Saggi analitici per la determinazione del potere antiossidante

La capacità di scavenger determinata con il saggio elettrochimico proposto è stata confrontata e correlata con i valori di potere antiossidante, ottenuti impiegando metodiche analitiche ampiamente utilizzate, sia a livello di ricerca che di controllo qualità.

4.7.1 Saggio ABTS

Il radicale ABTS·+ è un radicale stabile in ambiente acquoso che presenta uni spettro UV/Vis con un massimo di assorbimento a 732 nm. Nella determinazione della capacità antiossidante con questa metodica si valuta per via spettrofotometrica (λ = 732 nm) la quantità di ABTS·+ che viene consumata dalla reazione con i componenti del campione che si sta analizzando.

La soluzione madre di radicale ABTS·+ è stata preparata facendo reagire, al buio per 20 ore, 2,5 x 10-5 mol di ABTS con 1,25 x 10-5 mol di S2O82- in 50 mL di tampone

acetato 50 mM, pH 4,5, secondo la reazione: 2 ABTS + S2O82- → 2 ABTS·+ + 2 SO42-

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Questa soluzione è stata diluita 3:10 con tampone acetato per ottenere una soluzione di ABTS·+ 1,5 x 10-4 M.

In una cuvetta, posta all’interno dello spettrofotometro UV/Vis, vengono mescolati 2 mL di ABTS·+ 1,5 x 10-4 M, con 100 μL di campione opportunamente diluito. L’assorbanza della soluzione così ottenuta si registra in modo continuo per 20 min.

Il parametro che è stato utilizzato per determinare la capacità antiossidante è il decremento di assorbanza DA così definito:

Dove Acampione e Abianco rappresentano l’assorbanza registrata dopo 20 minuti per

il campione e per il bianco. Si è osservato che DA è linearmente proporzionale alla

concentrazione; la pendenza della retta ottenuta è stata utilizzata, analogamente a quanto già descritto per il metodo elettrochimico messo a punto, per determinare la capacità antiossidante espressa come trolox equivalenti.

4.7.2 Saggio DPPH

Il radicale DPPH è un radicale stabile in soluzione metanolica, disponibile commercialmente in forma solida, con uno spettro UV/Vis che presenta un massimo di assorbimento a 516 nm. In questo saggio, la cinetica di consumo del radicale DPPH, dovuto alla sua reazione con i composti antiossidanti presenti nel campione, viene seguita per via spettrofotometrica (λ = 516 nm).

Prima di iniziare la determinazione vera e propria, si costruisce una retta di calibrazione con soluzioni standard di DPPH, che permette di monitorare in maniera quantitativa la concentrazione residua della specie radicalica.

Per la determinazione della capacità antiossidante si sono posti in una cuvetta 3,0 mL di una soluzione metanolica di DPPH 65 μM e 80 μL di campione anch’esso in soluzione metanolica. L’assorbanza della soluzione è stata monitorata per 30 min. La capacità antiossidante è solitamente espressa come EC50, che rappresenta la

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concentrazione effettiva di antiossidante in grado di determinare un decremento dell’assorbanza originaria del 50 %, ad un tempo prefissato. Minore è il valore di EC50,

maggiore è il potere antiossidante del campione esaminato. Tuttavia, per avere un confronto diretto con le altre metodiche utilizzate, il potere antiossidante, valutato con questo metodo, è stato espresso come trolox equivalenti, utilizzando le assorbanze registrate a 30 min.

4.7.3 Saggio ORAC

Nel saggio ORAC si valuta la capacità del campione di proteggere un composto fluorescente, solitamente la fluoresceina, dall’attacco dei radicali perossialchilici, generati dalla decomposizione termica dell’AAPH a 37°C. La concentrazione di fluoresceina viene seguita tramite fluorimetria (λecc = 517 nm; λem = 517 nm).

In una cuvetta per spettrofluorimetria vengono aggiunti, nell’ordine indicato:  200 μL di campione in tampone fosfato 75 mM, pH 7,4

 1500 μL di fluoresceina 96 nM nello stesso tampone o 75 mM pH 7,4  300 μL di AAPH 133 mM nello stesso tampone

Al termine delle aggiunte, il segnale della fluoresceina è stato registrato per un tempo di 45 min. In Figura 11 è riportato un esempio delle cinetiche osservate per soluzioni a i concentrazioni di trolox crescenti

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Figura 11. Saggio ORAC a diverse concentrazioni di Trolox, tratto dal lavoro originale di Ou et al.11

Il segnale che è stato utilizzato per valutare il potere antiossidante è l’area sottesa dalla curva (AUC), calcolata con la seguente formula:

dove f0, f1, f2, f3 e fn sono i valori di fluorescenza ottenuti rispettivamente all’inizio

dell’esperimento, alla prima, seconda, terza ed’ennesima misurazione.

Anche in questo caso l’AUC è linearmente proporzionale alla concentrazione di composto antiossidante; dalla pendenza della retta ottenuta, in modo analogo a quanto già descritto, è possibile calcolare l’indice TEAC.

4.7.4 Determinazione della capacità antiossidante di un

campione reale.

4.7.4.1 Descrizione del campione reale

Una volta testata la capacità antiossidante di singoli composti puri, il metodo proposto, che sfrutta l’elettrodo GC-pfen, è stato impiegato per l’analisi di un campione reale, costituito da un succo di frutta a base di purea di mirtillo, uva rossa e mela, prodotto

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dalla ditta Yoga®, sotto il nome di “Antiossidante Quotidiano Viola”, nello stabilimento di Barbiano di Cotignola (Ra).

Il campione reale è stato analizzato anche coi metodi analitici standardizzati, al fine di confrontare i parametri TEAC risultanti.

L’etichetta presente nel contenitore di succo, riporta le caratteristiche composizionali elencate in tabella 4; il valore del pH, non disponibile, è stato misurato, eseguendo 3 ripetizioni, ed è stato espresso come media + deviazione standard.

Tabella 4. 1.Parametri del campione reale analizzato.

Parametro Valore

pH 3.21 ± 0,01

Contenuto di Vitamina C 400[mg / l]

Contenuto di Vitamina E 30[mg / l]

Polifenoli Totali 800[mg / l]

4.7.4.2 Descrizione del trattamento del campione.

Poiché il campione di succo di frutta si presentava sotto forma di sospensione, esso è stato filtrato sotto vuoto, mediante tubo di Venturi, attraverso filtro di nylon con pori aventi diametro medio di 0,45 μm, in modo tale da ottenere una soluzione trasparente.

La fase di filtrazione è molto delicata perché la presenza di particelle in sospensione può inficiare il dato analitico finale, soprattutto per le misure spettrofotometriche e spettrofluorimetriche, a causa di fenomeni di scattering della radiazione incidente.

Al termine della filtrazione, il campione di succo di frutta è stato subito conservato in frigo sotto atmosfera di azoto, al fine di evitare contaminazioni e preservare i composti antiossidanti presenti.

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4.7.4.3 Descrizione del tipo di prove effettuate.

Tutte le metodiche sopracitate (metodo proposto, metodi ABTS, DPPH, ORAC), sono state applicate per la determinazione della capacità antiossidante, espresso sempre in termini di Trolox® equivalenti, per il campione reale.

In base ai diversi metodi impiegati sono stati eseguiti opportuni rapporti di diluizione del campione in acqua distillata.

4.8 Fabbricazione di elettrodi di Pt modificati a