Per valutare le metilazione del locus TSDR (Treg-specific demethylated region), ad ogni time-point (giorno 7, giorno 14, giorno 21 e giorno 28), 5x105 cellule sono state lavate con PBS w/o CaMg e centrifugate 300xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante è stato completamente eliminato ed il pellet di cellule residuo è stato conservato a -80°C fino al momento dell’estrazione di DNA.
La tecnica utilizzata per estrarre il DNA è quella del Salting Out che prevede la lisi delle cellule tramite un tampone di lisi ed il trattamento con Proteinasi K allo scopo di estrarre gli acidi nucleici e degradare le proteine presenti che vengono allontanate mediante precipitazione con i sali. Infine mediante trattamento con etanolo si ottiene la precipitazione del DNA. La precipitazione delle proteine mediante salting out sfrutta il principio secondo cui la solubilità delle proteine in soluzione dipende dalle loro caratteristiche chimico-fisiche, dalla temperatura, dal pH e dalla concentrazione salina. Ad alte concentrazioni di sali, la solubilità delle proteine diminuisce bruscamente causando la precipitazione delle stesse. Per estrarre il DNA, il pellet di cellule che è stato conservato a -80°C, è stato innanzitutto lavato con il tampone di lisi composto
da TRIS 1M , EDTA 0,5M, NaCl 1M (Sigma Aldrich), a cui sono stati aggiunti Proteinasi K 20mg/ml (Qiagen) e SDS 20% (Sodio Dodecil Solfato, Sigma Aldrich). I campioni sono stati incubati in bagnetto a 65°C per 10 minuti ed infine le proteine in sospensione sono state fatte precipitare con NaCl saturo 6M, centrifugando a 3000xg, 15minuti a temperatura ambiente. E’ stato recuperato il surnatante, a cui è stato aggiunto 1 ml di Etanolo assoluto (EtOH 100%) freddo. Agitando con forza la provetta è possibile a questo punto vedere ad occhio nudo la cosiddetta medusa di DNA (figura 15 ), che può essere recuperata per essere lavata in EtOH 70%.
Figura 15 . Esempio di
Centrifugando, è stato possibile eliminare il surnatante e il pellet contente il DNA è stato lasciato quindi ad asciugare per eliminare ogni residuo di etanolo per evaporazione. La provetta contenente il pellet è stata quindi lasciata una notte a +4°C, per la successiva quantificazione del DNA estratto.
Il DNA estratto è stato quantificato e ne è stata valutata la purezza per mezzo della lettura allo spettrofotometro (Nanodrop 1000 V3.7.0, Thermo Scientific). Un microlitro di campione viene appoggiato sull’estremità di un cavo a fibre ottiche (receiving fiber) mentre un secondo cavo a fibre ottiche (source fiber) viene portato a contatto col campione liquido facendo si che il liquido colmi la distanza tra le due fibre. Una lampada flash a luce pulsata allo xeno fornisce la sorgente di luce che viene analizzata da uno spettrofotometro dopo che questa ha attraversato il campione. Lo strumento viene controllato da un software ed i dati registrati sul PC.
La concentrazione del DNA si ricava dall’Assorbanza a 260 nm (lunghezza d’onda di massimo assorbimento per gli acidi nucleici) utilizzando la legge di Lambert-Beer, mentre la purezza del DNA si ricava dai rapporti tra le assorbanze a 260, 280 e 230 nm.
Ogni campione di DNA deve essere a questo punto sottoposto a un trattamento che permette la conversione delle citosine non metilate in uracile. Questo processo è stato effettuato utilizzando il kit EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (Zymo Research). Per avere risultati ottimali, il kit prevede che vengano utilizzati fino a 500 ng di DNA per ottenere una buona conversione delle citosine non metilate utilizzando il trattamento con il bisolfito e la seguente amplificazione tramite PCR. Tuttavia, ci siamo resi conto che per i nostri campioni la quantità di DNA di partenza doveva essere maggiore per ottenere una buona resa, ed abbiamo quindi deciso di utilizzare 800 ng di DNA di partenza per ogni campione. Il protocollo è stato poi seguito senza ulteriori modifiche. In breve è stato aggiunto al DNA il reagente che consente la conversione delle citosine, ed ogni campione è stato quindi inserito nel termociclatore (uno strumento che permette di incubare la miscela a una serie di temperature che variano in maniera programmata) nel quale sono avvenute sia la denaturazione del DNA sia la conversione tramite bisolfito. I campioni sono stati quindi lasciati ad incubare a +4°C per 20 ore.
Il giorno seguente il DNA è stati inserito all’interno di una colonnina contenente una soluzione che lega il DNA metilato ed è stato centrifugato a 12000xg per 1 minuto. L’eluato è stato eliminato, è stato effettuato un lavaggio, seguito da centrifuga, ed è stata aggiunta una soluzione di desulfonazione che viene lasciata a contatto coi campioni per 20 minuti a temperatura ambiente. Sono stati poi fatti un paio di lavaggi con la soluzione appropriata, infine è stata aggiunta direttamente sulla matrice della colonnina una soluzione di eluizione che ha permesso al campione di eluire nella provetta sottostante una volta sottoposto a centrifuga a 12000xg per 2 minuti.
Secondo questo protocollo può essere recuperato più del 75% del DNA di partenza, e per esserne sicuri , abbiamo sottoposto nuovamente ogni campione
a quantificazione utilizzando lo spettrofotometro GeneQuant Pro (Amersham Bioscience). Considerato però che il DNA si trova a singolo filamento e contiene l’uracile, lo misuriamo in qualità di RNA. Questo tipo di spettrofotometro non ci dà
direttamente la concentrazione, ma ci fornisce solo i valori di Assorbanza e del rapporto 260/280. Per effettuare le letture abbiamo diluito i nostri campioni di 300 volte (abbiamo messo 2 µl di campione in 580 µl di acqua) e ricordando il fattore di correzione ci siamo ricavati la concentrazione di ogni singolo campione.
In seguito, abbiamo deciso di effettuare una PRE-PCR per aumentare la quantità di DNA di partenza. La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) infatti permette l’amplificazione selettiva di una regione selezionata di una molecola di DNA. Per poterla attuare bisogna
conoscere le sequenze che si trovano ai confini della regione stessa, in modo tale da poter utilizzare due brevi oligonucleotidi (i cosiddetti primer) che delimitano la regione che verrà amplificata ibridando ognuno un filamento della doppia elica. Questa amplificazione avviene per merito di un’enzima, la Taq DNA polimerasi, che è la DNA polimerasi I del batterio Thermus Acquaticus, organismo che vive in sorgenti idrotermali bollenti. Questa Taq DNA polimerasi è termostabile, cioè resiste alla denaturazione dovuta a trattamento al calore, dettaglio importantissimo che ci permette di utilizzarla nelle PCR dove, per consentire la denaturazione del DNA, la temperatura viene fatta salire fino a 94°C. Di norma poi la temperatura viene fatta scendere intorno ai 50-60°C per permettere l’unione dei primer a posizione specifiche delle molecole di DNA (processo che viene definito ibridazione o annealing). A questo punto la temperatura viene nuovamente innalzata per permettere alla Taq polimerasi di funzionare, legandosi ad un’estremità di ciascun primer e sintetizzando nuovi filamenti di DNA, complementari alle molecole di DNA stampo. Questi tre passaggi di denaturazione, annealing e sintesi vengono ripetuti per circa 25-30 cicli, con i quali si ottengono più di 50 milioni di copie del frammento di interesse.
Noi ci siamo limitati ad effettuare una PRE-PCR, ovvero sia abbiamo utilizzato un numero minore di cicli di amplificazione, che anticipano la reazione vera e propria effettuata con la REAL-TIME PCR. Innanzitutto abbiamo portato ogni campione alla concentrazione di 20 ng/µl. Sono stati utilizzati 100ng di DNA che sono stati inseriti in una miscela contenente buffer, MgCl2, dNTPs, i due primer, forward e reverse, e la Taq polimerasi. Il buffer viene utilizzato per mantenere il pH stabile rendendo quindi l’ambiente adatto alla reazione, il MgCl2 è indispensabile per il corretto funzionamento della DNA polimerasi, mentre i dNTPs , ovvero i nucleotidi liberi, servono per la costruzione dei nuovi filamenti.
Buffer 5x 4 µl
MgCl2 7,5mM a 1,5mM 1,2 µl
dNTPs 10mM a 0,25mM 0,5 µl
Primer Forward 20µM a 750nM 0,75 µl
GoTaq Hot Start Polimerase 1U (Promega) 0,2 µl
H2O per arrivare ad un V2 di 15µl 7,6 µl
La PRE-PCR effettuata è di tipo Touchdown, che ci permette di aumentare la specificità della reazione di PCR utilizzando due diverse temperature di ibridazione. In questo modo, mantenendo una temperatura di ibridazione più alta nei primi cicli di PCR (5 cicli), riusciamo ad ottenere una stringenza maggiore che scoraggia la formazione di aspecifici, consentendo alla sequenza desiderata di predominare. La prima temperatura utilizzata è di 2-6°C in più rispetto alla Temperatura di Fusione (Tm ) consigliata per l’appaiamento dei primer. Terminati i primi 5 cicli, il termociclatore viene programmato per effettuare 10 cicli identici ai precedenti, tranne per quanto riguarda la temperatura di ibridazione, che facciamo scendere ad una temperatura meno stringente rispetto alla precedente, che ci consente di aumentare la quantità della sequenza desiderata. Il tempo di ibridazione viene mantenuto a 30 secondi in entrambi i passaggi di ibridazione, per non favorire appaiamenti a stampi a bassa complementarietà, cosa che accadrebbe se permettessimo l’ibridazione per tempi più lunghi.
I campioni sono stati lasciati overnight a riposare a +4°C ed il giorno successivo è stata effettuata la REAL-TIME PCR.