Lo smaltimento delle acque di vegetazione dei frantoi oleari costituisce, attualmente, uno dei principali problemi dal punto di vista ambientale, specialmente nei paesi del Mediterraneo dove si concentra la maggior parte della produzione mondiale di olio di oliva e dove non è consentito lo spargimento superficiale.
Le acque di vegetazione sono tra i reflui agro-industriali a più alto tasso inquinante a causa del loro elevato carico organico, caratterizzato soprattutto da composti fenolici e polifenolici ad elevata azione antimicrobica e fitotossica.
La purificazione biologica delle acque di vegetazione è particolarmente difficile poiché questo refluo presenta solidi in sospensione e un elevato carico organico, in particolare polifenoli con attività biostatica e/o biocidi, che riduce fortemente le prestazioni degli impianti di depurazione. Di conseguenza, l’impianto deve prevedere due o più stadi di trattamento che rendono la depurazione complessa e costosa.
Attualmente, la normativa vigente consente in Italia la pratica dello spandimento delle acque di vegetazione sui terreni agrari; nonostante questa risulti, al momento, essere la soluzione migliore sia dal punto di vista pratico che economico, trova attuazione solo se si ha disponibilità di terreni sufficientemente vicini su cui spargere il refluo e comunque deve essere applicata in maniera controllata dal momento che gli eventuali effetti positivi o negativi sulla composizione, sulla carica microbica e la fertilità del terreno sono ancora oggi oggetto di studio. Inoltre, la migrazione di alcuni composti negli strati più bassi del terreno potrebbe causare la contaminazione di eventuali falde acquifere sottostanti con conseguenze per la salute dell’uomo.
Negli ultimi anni sono state proposte soluzioni alternative finalizzate a sfruttare questo refluo, in quanto ricco di composti utili. La valorizzazione delle AV mediante il loro impiego per l’ottenimento di prodotti a medio o alto valore aggiunto attraverso processi fisico-chimici o fermentativi, riveste notevole interesse scientifico.
Nelle AV sono presenti una grande varietà di biomolecole come acidi organici, polialcoli, zuccheri semplici e complessi e lipidi che le rendono una possibile base per i processi fermentativi (Ramos-Cormenzana et al.,1995; Crognale et al., 2003). In virtù del contenuto residuo di lipidi, le AV potrebbero rappresentare un ottimo candidato come terreno liquido di crescita per la produzione di lipasi microbiche.
Lo scopo della presente tesi di dottorato è stato quello di mettere a punto un processo fermentativo per la valorizzazione delle AV mediante produzione microbica di enzimi, in particolare enzimi lipolitici, ottenendo al contempo un abbattimento o quanto meno,
una riduzione del loro potere inquinante. Va tenuto presente che, trattamenti aerobi che diano come esito un abbattimento della concentrazione di fenoli, abbinata ad una riduzione del carico organico, potrebbero costituire una valida forma di pretrattamento a monte della metanogenesi (D’Annibale et al., 2003; Mantzavinos & Kalogerakis, 2005; Crognale et al., 2006). E’ noto, infatti, che un limite tecnico collegato all’impiego delle AV, in questi processi è rappresentato dall’effetto inibitorio che la componente fenolica esercita sulla microflora metanogenica.
Esiste una vasta bibliografia in cui viene presa in esame la produzione di lipasi da numerose specie microbiche tra cui Penicillium e Candida, e sia il terreno che il processo fermentativo per la produzione di questo enzima è stato ampiamente ottimizzato. Nella maggior parte dei casi, una buona produzione di lipasi microbica prevede l’utilizzo di terreni sintetici piuttosto complessi che di certo incidono in maniera significativa sul prezzo finale del prodotto. Inoltre, negli ultimi anni anche la produzione di preparati enzimatici commerciali contenenti lipasi di origine microbica ha avuto un notevole sviluppo. Sigma, Amano, Roche, Novo Nordisk, etc., forniscono preparati lipolititici con varie composizioni e proprietà catalitiche utilizzati in diversi settori: industria alimentare, farmaceutica, dei detergenti e per la produzione di biodiesel.
L’innovazione che dovrebbe introdurre questo lavoro è la produzione microbica di lipasi di possibile interesse industriale utilizzando un substrato costituito da un refluo agro-industriale. Con questa idea, si è cercato di mettere a punto un terreno di produzione a basso costo che permettesse di ottenere buoni livelli di attività e contemporaneamente un abbattimento del carico inquinante del refluo finale.
In prima battuta, è stato effettuato uno screening di microrganismi (funghi e lieviti) in grado di crescere sulle acque di vegetazione producendo lipasi. Con lo scopo di approfondire ulteriormente questo studio, tra i ceppi esaminati sono stati scelti quelli che hanno permesso di raggiungere la maggiore produzione e la migliore produttività. I microrganismi in questione sono stati i funghi Geotrichum candidum NRRL 553 e Penicillium citrinum NRRL 1841, NRRL 3754 e ISRIM 118 e il lievito Candida cylindracea NRRL Y-17506. In via preliminare, per tutti questi ceppi sono stati condotti degli studi per valutare l’effetto di alcuni fattori sulla produzione di lipasi quali tipologia di AV, utilizzo di vari oli come induttori di attività e impiego di diverse fonti di azoto.
A questo punto l’attenzione si è focalizzata su Penicillium citrinum NRRL 1841 e Candida cylindracea NRRL Y-17506 per i quali si è cercato di ottimizzare le condizioni colturali per la crescita cellulare nell’ottica di migliorarne la produzione enzimatica. La produzione di lipasi da P. citrinum NRRL 1841, utilizzando il terreno a base di AV, è stata ottimizzata in beuta valutando l’effetto del pH iniziale, della concentrazione di azoto e di estratto di lievito secondo un approccio multi-fattoriale. Con il terreno così ottimizzato, al fine di ottenere informazioni sul possibile trasferimento di scala del processo, sono stati condotti altri esperimenti in reattori da banco. Allo scopo, sono stati impiegati due tipi di sistemi, un bioreattore ad agitazione meccanica (STR) e uno ad agitazione pneumatica (Air-lift).
Sebbene tutti i ceppi studiati sono stati in grado di crescere sulle acque di vegetazione e produrre a livelli significativi attività lipolitica, una particolare attenzione è stata poi riservata a C. cylindracea (noto anche come C. rugosa) per il notevole interesse applicativo della lipasi prodotta da questo lievito. Inizialmente, si è cercato di ottimizzare in beuta la composizione del terreno di produzione (concentrazione dell’olio di oliva, effetto del glucosio, aggiunta di surfactanti e di vari fattori di crescita) e di valutare in via preliminare l’effetto sulla crescita cellulare e sull’attività di alcune condizioni colturali quali velocità di agitazione e aerazione.
Inoltre, con lo scopo di valutare la fattibilità tecnica di un trasferimento di scala del bioprocesso e approfondire la messa a punto del processo fermentativo sono stati condotti una serie di esperimenti in bioreattore da banco ad agitazione meccanica (STR). In particolare, utilizzando il terreno a base di AV ottimizzato, si è cercato di ottimizzare alcuni parametri quali pH, velocità di agitazione e aerazione.
Infine, messo a punto il bioprocesso di produzione della lipasi da C. cylindracea coltivata su un terreno a base di AV, si è cercato di identificare il profilo enzimatico del campione grezzo così ottenuto, dal momento che, come è noto dalla letteratura, questo lievito è in grado di produrre fino a sette isoforme ad attività lipolitica.