L’ambito della presente ricerca è stata la caratterizzazione dal punto di vista strutturale e funzionale di nuovi geni umani, con particolare attenzione rivolta ai geni del cromosoma 21, attraverso un approccio metodologico integrato.
La sequenza nucleotidica del cromosoma 21 umano (HC21) è stata determinata con alta accuratezza e pubblicata nel 2000 (Hattori et al.). Il numero totale dei geni (codificanti per proteine e non codificanti) presenti sul braccio lungo del cromosoma 21, non è ancora completamente conosciuto e per molti di questi loci genici non risulta completa la caratterizzzazione funzionale
Il presente progetto di ricerca sottolinea la necessità di proseguire l'analisi genomica della sequenza del cromosoma 21 umano per una completa determinazione del suo contenuto genico. Inoltre si pone a più ampio raggio come studio avanzato del genoma umano, con un particolare riferimento ai geni del cromosoma 21, nel tentativo di portare contributi conoscitivi eventualmente utili a chiarire la complessa, ed ancora ampiamente sconosciuta, patogenesi molecolare della Sindrome di Down (DS) correlata con la trisomia 21.
In particolare, il lavoro si è articolato in tre parti: la caratterizzazione del locus genico umano CYYR1 (cysteine and tyrosine-
rich protein 1 gene), gene identificato e clonato nel 2002 nel laboratorio di
Genomica del Dipartimento di Istologia, Embriologia e Biologia Applicata (Vitale et al., 2002) e localizzato sul cromosoma 21; l’utilizzo del modello animale di zebrafish per lo studio funzionale dell’omologo di CYYR1 e lo studio di sequenze non codificanti altamente conservate, coinvolte nella regolazione genica ed infine lo sviluppo di un software in grado di produrre mappe cromosomiche di espressione, al fine di inserire lo studio del gene CYYR1 in un’analisi a più ampio raggio sui geni del Cromosoma 21.
1. CARATTERIZZAZIONE DEL LOCUS GENICO UMANO
CYYR1
La prima parte del presente studio, si proponeva di effettuare la caratterizzazione del locus genico umano CYYR1, uno dei geni più estesi sul Cromosoma 21.
Il locus risulta molto complesso in quanto esistono numerose isoforme, codificanti per proteine putative diverse e che, probabilmente, mediano funzioni biologiche differenti; inoltre sono presenti trascritti in antisenso che arricchiscono ulteriormente la complessità del tratto genomico oggetto di studio.
In primo luogo, è stato quindi necessario effettuare esperimenti di clonaggio dei trascritti, identificati grazie a strumenti bioinformatici e
database disponibili in rete. Successivamente l’analisi dell’espressione
genica ha richiesto la messa a punto di tecniche quali Real-time PCR e RT- PCR quantitativa relativa. Tramite queste tecniche, infine, gli studi di espressione dei trascritti del locus CYYR1 sono stati condotti in diverse linee cellulari, allo scopo di ottenere modelli cellulari che esprimessero in maniera significativa il gene di interesse e potessero essere impiegati per indagare aspetti funzionali di CYYR1.
2. IL MODELLO ANIMALE DI ZEBRAFISH PER LO STUDIO FUNZIONALE E DELLE REGOLAZIONE GENICA
Nella seconda parte dello studio è stato utilizzato il modello animale del pesce zebra, che permette di studiare geni di interesse (nel presente lavoro, il gene cyyr1) nel contesto dell’organismo in toto e di verificarne aspetti funzionali.
In primo luogo, è emersa la necessità di effettuare una analisi sistematica per l’identificazione di un gene housekeeping “ideale” da utilizzare come gene di riferimento in studi di espressione sul pesce zebra. Il secondo obiettivo è stato quello di mettere a punto metodiche per studi di modulazione genica, quali la sovraespressione genica e la realizzazione di organismi knockdown. A queste metodiche utili per indagare la funzione
del gene cyyr1, è stata affiancata la Real-time PCR per verificare l’espressione del gene e una sua possible modulazione, in particoalre durante lo sviluppo embrionale.
Il modello animale di zebrafish è stato utilizzato anche per la caratterizzazione di sequenze conservate evolutivamente e correlate a funzioni regolatorie (CNE, conserved non coding element). Le CNEs, identificate in primo luogo con metodi bioinformatici in Ciona intestinalis, e correlate a geni coinvolti nello sviluppo embrionale, sono state utilizzate per la progettazione di primers specifici. Questi primers sono quindi stati utilizzati in PCR ai fini di clonare in vitro le sequenze CNEs di C.
intestinalis, e gli ampliconi ottenuti sono stati utilizzati in esperimenti di
microiniezione in embrioni di pesce zebra, per verificare se tali sequenze mantessero una funzione regolatoria anche nei vertebrati.
Esiste un quadro molto complesso in cui sono coinvolti molteplici meccanismi molecolari in grado di influenzare l’espressione genica e quindi determinare lo sviluppo embrionale, la funzione di cellule, tessuti ed organi o provocare patologie.
Con il progredire della definizione dei pathway molecolari considerati potrà essere interessante verificare se all’interno di queste cascate di segnale, sono coinvolti anche elementi regolatori; in particolare le indagini sul gene cyyr1 fanno ipotizzare un suo coinvolgimento a livello di sviluppo embrionale e moltissimi geni chiave a questo livello sembrano essere regolati proprio da CNEs.
3. SVILUPPO DI UN SOFTWARE IN GRADO DI PRODURRE MAPPE CROMOSOMICHE DI ESPRESSIONE (TRAM)
Lo studio sul gene CYYR1 rientra in un’indagine a più ampio raggio sui geni del Cromosoma 21, coinvolti nella patogenesi della Sindrome di Down, ma anche nella tumorigenesi e nello sviluppo embrionale.
L’analisi dell’espressione genica fornisce numerose informazioni che possono contribuire ad associare un gene o un insieme di geni a un particolare meccanismo biologico normale o patologico
La meta-analisi di studi indipendenti potrebbe fornire elementi utili che mettano in evidenza regioni cromosomiche caratterizzate da una consistente e stabile sovraespressione o sottoespressione genica. Non esistono, ad oggi, strumenti bioinformatici in grado di effettuare una meta- analisi di questo tipo in modo semplice e facilmente fruibile. Per questo la messa a punto di un software in grado di produrre mappe cromosomiche di espressione a partire da dati di analisi genica globale potrebbe risultare molto utile per l’interpretazione di dati così numerosi, quali l’insieme delle analisi di espressione prodotte dal lavoro della comunità scientifica e spesso liberamente consultabili in rete.
Questo approccio bioinformatico potrebbe consentire di identificare in modo predittivo intere regioni cromosomiche i cui geni hanno lo stesso schema di espressione e profili stabili di sovra/sottoespressione in campioni biologici.
Su queste basi, nel presente studio è stato messo a punto un
software in grado di produrre mappe cromosomiche di espressione a
partire da dati di analisi genica globale (TRAM, Transcriptome Mapper). Questo programma può essere utilmente impiegato per approfondire le conoscenze riguardanti l’espressione genica durante lo sviluppo embrionale di zebrafish e trovare ulteriori dati da affiancare a quelli ottenuti mediante la Real-time PCR, consentendo una meta-analisi di dati di espressione genica disponibili in rete.
Allo scopo di ampliare la ricerca sull’espressione e la caratterizzazione dei geni del Cromosoma 21, potrebbe infine essere utilizzato per la meta-analisi di microarray per confrontare l’espressione genica di campioni trisomici ed euploidi.