La presente tesi di dottorato si inserisce in un programma generale di attività di ricerca che la sezione di Fisiologia del Dipartimento di Medicina Veterinaria porta avanti da diversi anni sui meccanismi che sono alla base dei processi riproduttivi di diverse specie domestiche, attraverso l’impiego di modelli sia in vivo che in vitro.
In considerazione degli svantaggi dell’utilizzo del tuorlo d’uovo come componente animale, descritti nella parte generale, in questo lavoro si è voluta saggiare l’efficacia dell’aggiunta di alcune sostanze sostitutive nell’extender di congelamento, al fine di sviluppare un sistema definito per la crioconservazione del seme di becco di razza sarda.
Il tuorlo d’uovo rappresenta il più importante crioprotettore utilizzato per gli extenders di congelamento del seme di numerose specie animali. La sua azione protettiva contro i danni derivati dall’abbassamento delle temperature è data dalle lipoproteine a bassa densità in esso presenti (LDL - Low density Lipoproteins), che sono considerate le migliori molecole con capacità crioprotettiva.
Tuttavia, in considerazione del fatto che il tuorlo d’uovo è una componente animale, soggetta pertanto ad un’ampia variabilità dei suoi costituenti, sono sorti dei dubbi circa la sua effettiva efficienza e sui vantaggi del suo utilizzo.
Il tuorlo d’uovo infatti è soggetto a contaminazione batterica che può rappresentare un rischio sanitario nell’inseminazione artificiale; non è pronto per l’uso in quanto deve essere accuratamente separato dalla sua membrana e dall’albume; la sua composizione lipidica è soggetta ad un’ampia variabilità in funzione della dieta e delle condizioni di vita della gallina; inoltre secondo alcuni può avere un’azione meccanica che rallenta il movimento degli spermatozoi e un effetto che inibisce la loro respirazione (Kampschmidt et al., 1953; Watson e Martin, 1975). Tuttavia trovare sostanze alternative al tuorlo d’uovo non è semplice perché
il preciso meccanismo attraverso il quale questo protegge lo spermatozoo durante il congelamento, rimane ancora poco compreso.
Nel presente lavoro sono state condotte diverse prove di congelamento del seme di becco utilizzando alcune sostanze definite, che per le loro proprietà potrebbero essere sostitutive al tuorlo d’uovo. Queste sono:
1) Lecitina di soia: rappresenta un’importante fonte di fosfolipidi naturali (fosfatidilcolina (PC), fosfatidil-etanol-amide (PE) e fosfo-tidil-inositolo (PI)) e contiene anch’essa un’alta quantità di lipoproteine a bassa densità, ma a differenza del tuorlo è una componente nota reperibile commercialmente.
2) Colesterolo: il rapporto colesterolo-fosfolipidi ha un ruolo fondamentale nel garantire la fluidità e la stabilità delle membrane cellulari alle basse temperature, pertanto aumentare il contenuto di colesterolo nella membrana spermatica può essere una strategia per migliorare la qualità del seme dopo crioconservazione.
Il colesterolo è una molecola idrofobica non solubile nei diluenti utilizzati per il congelamento del seme, ma recentemente sono state usate le ciclodestrine per inserirlo e rimuoverlo dalle membrane cellulari. Il colesterolo utilizzato in questo lavoro è una molecola già solubilizzata con le metil-beta-ciclodestrine, reperibile commercialmente.
Formula del colesterolo Metil-beta-ciclodestrine
3) Trealosio: è un disaccaride, crioprottettore non permeabile. Sia in vivo che in vitro protegge le membrane cellulari dai danni causati dalla disidratazione e dagli shock termici
prodotti dal processo di refrigerazione-congelamento e modula la fluidità delle membrane. Inoltre sembra avere un’azione antiossidante. La presenza di trealosio in associazione col glicerolo, altro crioprotettore con diversa modalità d’azione, potrebbe garantire maggiori percentuali di sopravvivenza allo scongelamento.
4) Melatonina: l’azione crioprotettiva della melatonina durante la criocoservazione del seme risulta relazionata al suo effetto antiossidante, che neutralizza un alto numero di radicali liberi tossici (Tan et al., 2007; Hardeland et al., 2009; Peyrot e Ducrocq, 2008) e influenza l’espressione degli enzimi antiossidanti. Questo effetto si ripercuote positivamente sui diversi parametri di qualità: vitalità, motilità (Gwayi e Bernard, 2008), concentrazione di ATP e integrità del DNA.
Melatonina Trealosio
Inoltre, partendo dal presupposto che la crioconservazione induce sulla cellula spermatica uno stress ossidativo dovuto alla produzione di ROS (specie reattive dell’ossigeno), cui segue lipoperossidazione a carico dei lipidi della membrana plasmatica, sono stati effettuati i seguenti dosaggi sull’estratto cellulare post congelamento:
1) Capacità antiossidante totale: è un dosaggio basato sull’impiego di un radicale, l’ABTS, che viene scavengerizzato tanto velocemente quanto più antiossidanti sono presenti nel campione. Permette la misurazione di sostanze antiossidanti nei liquidi o negli estratti biologici.
2) Concentrazione dei tioli totali e del glutatione: i tioli sono dei composti che
contengono un gruppo tiolico (-SH) legato ad un atomo di carbonio e che presentano proprietà antiossidanti. Esempi di comuni tioli sono la cisteina, l’omocisteina, la N-acetilcisteina (NAC) e il GSH. Il glutatione (GSH), antiossidante idrosolubile, è il più abbondante tiolo a basso peso molecolare presente nelle cellule dei mammiferi. E’ coinvolto in molti processi fra cui il mantenimento del bilancio ossidoreduttivo intracellulare (Jacob et al., 2003) e la sua funzione antiossidante sembra essere strettamente legata al suo gruppo tiolico. Il GSH protegge i tessuti dai danni provocati dai radicali in maniera diretta, ossia reagendo con le specie radicaliche, oppure in modo indiretto, mantenendo nella forma ridotta sia i gruppi sulfidrilici delle proteine che di alcuni antiossidanti (Yu, 1994). E’ stato dimostrato per esempio che il GSH mantiene la normale distribuzione dei gruppi sulfidrilici delle proteine di membrana dello spermatozoo di toro durante il processo di congelamento-scongelamento (Chatterjee et al., 2001).
I dosaggi di questi antiossidanti sono stati effettuati per confrontare le eventuali differenze presenti a seguito dell’aggiunta delle sostanze sopra elencate nell’extender di congelamento, al fine di valutare se i diversi mestrui diluitori utilizzati potevano contrastare gli stress ossidativi indotti dalla crioconservazione.
In questo lavoro sono stati presi in considerazione come parametri di valutazione della qualità del seme dopo scongelamento (a seguito dell’utilizzo dei diversi extenders) i seguenti: la vitalità spermatica (intesa come rapporto cellule vive/morte), la percentuale di spermatozoi motili progressivi e rapidi (tramite analisi computerizzata CASA), i livelli intracellulari di ATP, il grado di frammentazione del DNA tramite metodica Comet assay, la capacità fecondante tramite la fecondazione eterologa e lo stato ossidativo.