I concetti di base circa le interazioni ligando (farmaco, neurotrasmettitore, ormone, ecc.) - recettore, che coinvolgono in particolare i GPCR, sono riassunti nel Capitolo 1, mentre nel Capitolo 2 sono descritte le tecniche sperimentali e teoriche usate in questo lavoro (animali da laboratorio; frazionamenti di cellule; modelli matematici farmacodinamici; saggi di legame con radioligandi; sintesi chimica; uso del computer nella scoperta di farmaci e nella farmacologia molecolare). Queste tecniche sono state usate per valutare la plausibilità di siti di legame dei GPCR, localizzati sul bordo extracellulare della membrana, in studi di interazioni fra GPCR e ligandi bivalenti. Tali studi hanno coinvolto l’analisi teorica di ligandi noti di svariati recettori accoppiati alle proteine G allo scopo di ottenere un modello approssimato sulla lunghezza ottimale dello spaziatore. Lo studio teorico è stato validato per mezzo di derivati dimeri della teofillina sintetizzati allo scopo e saggiati sui recettori A1 dell'adenosina (Capitolo 3).
L’accurata analisi dei siti di legame è stata quindi portata avanti fino allo sviluppo del modello di Modulatori Allosterici Potenziatori e Competitivi (ECAM) per i GPCR (Capitolo 4).
dei ligandi bivalenti verso i GPCR. Le molecole che contengono due farmacofori o un singolo farmacoforo e un'unità di riconoscimento non farmacoforica, chimicamente collegati tra loro attraverso uno spaziatore, sono stati chiamati "ligandi bivalenti" (Neumeyer et al., 2003). Le proprietà d’interesse sono state studiate analizzando i valori di pKi relativa [pKi relativa = (pKi ligando bivalente/pKi monomero)*100] in
funzione delle lunghezze dello spaziatore. L'analisi ha mostrato una tendenza comune nel comportamento di questi ligandi verso i GPCR. Per supportare questa osservazione, è stata sintetizzata una nuova serie di derivati bivalenti contenenti unità di teofillina e tali nuove molecole sono state saggiate sul recettore A1 dell'adenosina. I
risultati ottenuti in relazione all’affinità di questi nuovi composti hanno mostrato la stessa tendenza generale al variare della lunghezza dello spaziatore. Inoltre, sono stati generati dei modelli teorici tridimensionali del recettore A1 dell'adenosina sia nello
stato monomerico che dimerico. I modelli hanno permesso l’analisi delle cavità che possono plausibilmente costituire i siti di legame per il ligando. Su questa base è stato possibile speculare su differenti modi di legame dei ligandi bivalenti rispetto ai GPCR in funzione delle lunghezze dello spaziatore. Ci si attende che uno sviluppo di questo studio possa dare origine a ligandi bivalenti utilizzabili per applicazioni terapeutiche. Infatti le interazioni con amminoacidi localizzati sulle anse della catena polipeptidica dei GPCR, situate vicino alla superficie extracellulare della membrana plasmatica, possono costituire dei bersagli ad alta selettività per nuovi ligandi. In questa prospettiva, la conoscenza della lunghezza ottimale dello spaziatore diventa un elemento chiave nella progettazione molecolare.
Il contenuto del Capitolo 4 è stato sviluppato in considerazione del fatto che gli agonisti ed i loro antagonisti competitivi si legano ad un sito di legame primario, o sito ortosterico, e che un modulatore allosterico è definito come "un composto che si lega ad un sito di legame secondario su una proteina per influenzare l'affinità di un altro composto per un sito topograficamente distinto". In questo capitolo viene descritto un nuovo modello matematico, chiamato modello di Modulatori Allosterici Potenziatori e Competitivi (ECAM), che è stato sviluppato durante lo svolgimento di questa tesi. Il modello descrive quantitativamente l'interazione di un modulatore allosterico con proprietà sia potenziatrici che competitive verso i recettori accoppiati a proteine G (GPCR). Sono state effettuate simulazioni del modello per esperimenti di legame all’equilibrio (in condizioni simili a quelle dello spiazzamento e della saturazione). Sono stati inoltre simulati esperimenti cinetici (associazione, dissociazione). I risultati hanno mostrato una buona capacità del modello di interpretare un certo numero di possibili comportamenti di legame ligando-recettore. I risultati offrono inoltre una base teorica che può essere utilizzata nella progettazione ed ottimizzazione di composti dotati di
proprietà potenziatrici allosteriche, competitive, agoniste, antagoniste, agoniste inverse. In conclusione, il modello dovrebbe fornire il punto di partenza per la progettazione di nuovi modulatori allosterici e per la loro ottimizzazione, sulla base di un meccanismo di interazione del modulatore ad un sito allosterico situato in prossimità del sito ortosterico verso il lato extracellulare della membrana. Esso dovrebbe fornire una misura dell'affinità del modulatore verso il recettore, data da costanti termodinamiche anziché da punteggi o da percentuali di efficacia comunemente usati (che sono meno riproducibili). L'affinità di legame del modulatore, data come costante termodinamica, è un parametro che il chimico farmaceutico o il farmacologo possono usare facilmente durante l'ottimizzazione delle strutture molecolari nell’ambito di una serie di composti. A questo proposito, è utile evidenziare quanto segue: poiché il sito allosterico si trova nelle anse extracellulari, che presentano bassa omologia fra di loro, anche fra sottotipi dello stesso recettore, un modulatore ECAM, che interagisca a livello di questo sito, possiede una probabilità molto elevata di essere considerevolmente selettivo verso un dato sottotipo recettoriale.
Infine, il capitolo 5 riassume le conclusioni generali ottenute dal lavoro descritto in questa tesi, fornendo una descrizione circa le prospettive future. Gli ultimi due capitoli contengono un riassunto di questo studio, in inglese (Capitolo 6) ed in italiano (Capitolo 7).
Riferimenti
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