4. RISULTATI
4.2 Somministrazione inalatoria
4.2.1 Open field test
4.2.1.1 Analisi comportamentale
I parametri crossing, wall-rearing e rearing, sono stati misurati come media ± SEM della frequenza ogni 5 minuti, rispetto ai 20 minuti totali del test. La somministrazione di 5, 20 o 50 µl di olio essenziale di bergamotto, non ha indotto variazioni statisticamente significative della frequenza di crossing e wall-rearing per tutta la durata del test. Per i volumi più bassi di EOB è stata osservata in tutti e quattro gli intervalli sperimentali (5-10-15-20 minuti) una riduzione del parametro rearing rispetto al gruppo controllo, tale riduzione è stata osservata solo negli ultimi 15 minuti del test dopo inalazione di un volume di 50 µl di BEO (Fig.4.9).
Fig 4.9: crossing; wall-rearing; rearing, in 5 minuti dopo trattamento per via inalatoria con jojoba (controllo, 50 µl, n=9, barra bianca),BEO (5 µl, n=6, barra nera; 20 µl,, n=5, barra grigio scuro; 50 µl, n=7, barra grigio chiaro), in ratti maschi Wistar, nell’open field test.
32 I parametri grooming, immobility e center sono stati calcolati come media ± SEM del tempo totale in secondi, rispetto ai 20 minuti del test.
L’inalazione di volumi di BEO pari a 50 e 20 µl, ha indotto un aumento del parametro
grooming rispetto al gruppo controllo (jojoba 50 µl). Al contrario, la somministrazione
di un volume di 5 µl di BEO non ha indotto variazioni dello stesso parametro. Il trattamento con volumi differenti di olio essenziale di bergamotto (50, 20 e 5 µl), ha invece indotto una riduzione del parametro immobility rispetto al controllo. Per gli animali trattati con un volume di 50 µl di olio essenziale di bergamotto è stato inoltre osservato un aumento del tempo speso al centro dell’arena (center), rispetto agli altri gruppi sperimentali. Per il gruppo di animali trattati con BEO 20 µl è stata osservata una riduzione dello stesso parametro sia rispetto al controllo sia agli altri due gruppi trattati con il fitocomplesso (Fig. 4.10).
Fig. 4.10: grooming; immobility; center, in secondi dopo trattamento per via inalatoria con jojoba (controllo, 50 µl, n=9, barra bianca) BEO (5 µl, n=6, barra nera; 20 µl,, n=5, barra grigio scuro; 50 µl, n=7, barra grigio chiaro), in ratti maschi Wistar, nell’open field test.
4.2.1.2 Analisi neurochimica
I livelli extracellulari degli aminoacidi analizzati sono riportati in % rispetto al valore basale, indicato come media ± SEM, normalizzato ad 1.(Tabella 4).
33 Non è stata osservata alcuna variazione statisticamente significativa dei livelli degli amminoacidi in tutti i campioni raccolti dopo inalazione di olio di jojoba o BEO(Fig.4.11).
Fig. 4.11: livelli di aspartato (ASP); glutammato (GLU); glutammina (GLN),glicina (GLY), citrullina (CIT), taurina (TAU) espressi in % rispetto al valore basale normalizzato ad 1, nell’ippocampo ventrale, dopo trattamento acuto per via inalatoria con jojoba (50 µl, n=7 ) BEO (20 µl, n=3 ,50 µl, n=4 ), in ratti maschi Wistar, nell’elevated plus-maze test, eseguito durante la raccolta del campione 5.
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5. DISCUSSIONE
I principi attivi di origine naturale e nello specifico gli estratti da droghe vegetali sono stati tra i primi farmaci primi agenti utilizzati per il trattamento di malattie del SNC, come disturbi dell’umore, stati d’ansia e depressione (Gomes et al., 2009). In particolare, l’impiego degli oli essenziali in queste problematiche trova oggi espressione nell’aromaterapia, una forma di medicina complementare ampiamente utilizzata nel mondo occidentale. La possibilità di utilizzare fitocomplessi nelle patologie del SNC potrebbe, d’altra parte, limitare i molteplici effetti collaterali che accompagnano l’uso dei farmaci di sintesi attualmente utilizzati (Gomes et al., 2009). Sperimentalmente, la valutazione di una potenziale attività ansiolitica, ansiolitico-sedativa o antidepressiva è affidata alla realizzazione di test comportamentali che hanno l’intento di indurre una condizione di stress e uno stato ansioso dovuto alla situazione nella quale è proiettato l’animale; esso, infatti, esprime sia una sorta di paura e preoccupazione che curiosità per il “nuovo”. Il fattore comune a tutti i test è rappresentato dal fatto che l’animale è posizionato in un ambiente “non familiare” che tende ad esplorare, specialmente durante i primi minuti, muovendosi in un “campo aperto” quale è l’arena dell’open field o lungo le braccia di un labirinto quali sono quelle del plus-maze. Lo stato emozionale dell’animale relativo a questa nuova condizione viene valutato mediante lo studio di specifici parametri che descrivono i differenti aspetti del comportamento e della sua “motivazione di fondo”. Esposizioni ripetute al test, influenzano notevolmente il comportamento, tanto che gli animali si abituano rapidamente e la loro locomozione tende a ridursi durante le varie sessioni, fino a quando l’attività raggiunge un livello stabile che è spesso usato per valutare gli effetti che diversi farmaci possono avere sulla locomozione (Walsh and Cummins, 1976). L’open field, ad esempio, è un test sfruttato per studiare prevalentemente farmaci con un’ipotetica azione ansiolitica, valutandone gli effetti “non specifici” o “effetti collaterali”, cioè quei comportamenti “non legati all’ansia”, così come la locomozione e il sonno (Walsh and Cummins, 1976). In questo tipo di test, dopo la fase di eplorazione, caratterizzata da un aumento della frequenza del parametro wall-rearing, l’animale tende ad evitare attivamente il centro dell’arena (center), che induce ansia, muovendosi lungo la periferia, comportamento caratterizzato da un aumento dei parametri crossing e wall-rearing. In un secondo momento, quando subentra la fase di “habituation” l’animale riduce i suoi movimenti (immobility), rimanendo più tempo immobile perché “il nuovo” è ormai diventato “familiare”. I
35 farmaci ansiolitici, come ad esempio le benzodiazepine, diminuiscono la permanenza dell’animale nella periferia, dell’arena aumentando il tempo di esplorazione (Choleris et al., 2001), portando alla riduzione di parametri come il crossing e il grooming, quest’ultimo utilizzato come indice di risposta dell’animale a un nuovo ambiente (Espejio, 1997). In particolare, questo parametro, aumenta in due condizioni opposte: minore e maggiore stress (Kalueff and Tuohimaa, 2004a). La mancanza di stress, induce l’animale a effettuare una sorta di “grooming” spontaneo, come passaggio da un’attività ad un’altra. Generalmente, avviene in modo rilassato e senza interruzioni, passando dal lavaggio della zampa e della coda, alla pulizia dei genitali. Allo stesso modo, condizioni di stress inducono negli animali la comparsa di grooming caratterizzato da interruzioni frequenti e incomplete (Kalueff and Tuohima 2005). L’esecuzione di un test come
l’open field, permette la descrizione di un parametro molto influenzato dalla nuova
condizione che si presenta per l’animale: l’ansia indotta dalle dimensioni e dalla forma dell’arena, nonché la curiosità per qualcosa che non si conosce. Nel nostro caso, gli effetti comportamentali osservati per le dosi di 250 e 500 µl/kg di olio essenziale di bergamotto somministrato per via sistemica, evidenziano delle strette analogie con gli effetti comportamentali prodotti da farmaci ansiolitici come il diazepam. In particolare, le frequenze di crossing (statisticamente significativa) e wall-rearing, risultano addirittura inferiori anche a quelle osservate negli animali trattati con la dose ansiolitica della benzodiazepina (1.2 mg/kg i.p.) (Siemiatkowski et al., 2000). Inoltre, la riduzione del grooming osservata negli animali trattati con il fitocomplesso (statisticamente significativa rispetto al controllo) sembrerebbe avvalorare l’ipotesi di un’azione ansiolitica esercitata dall’olio essenziale di bergamotto. Tuttavia, la riduzione dell’attività locomotoria osservata durante la realizzazione del test, è strettamente correlata all’aumento di un altro parametro, l’immobility e ciò lascerebbe pensare alla possibilità che il fitocomplesso possa verosimilmente produrre piuttosto un effetto ansiolitico-sedativo di tipo dose-dipendente. Ciò sembra essere confermato ulteriormente dalla riduzione del parametro wall-rearing che è specifico dell’attività esploratoria dell’animale. Per meglio caratterizzare tale ipotesi o riuscire a prescindere l’uno o l’atro effetto, sono stati realizzati esperimenti utilizzando l’elevated plus-maze test nel quale, generalmente, la preferenza per le braccia chiuse del labirinto (evitando attivamente quelle aperte) riflettono la manifestazione di una risposta simile alla paura (Pawlak et al., 2012). L’aumentata tendenza a evitare le braccia aperte durante i primi 3- 5 minuti del test, può essere prevenuta da farmaci ansiolitici come le benzodazepine.
36 Invece, la predominanza dell’approccio, durante i due minuti iniziali, può essere bloccata da farmaci ansiogeni causando un incrementato evitamento delle braccia aperte. Un comportamento impulsivo dell’animale è indice di una più alta percentuale d’entrata e di tempo trascorso nelle braccia aperte, riguardo al tempo d’entrata nelle braccia del labirinto (Ueno et al., 2002). In particolare, nel caso degli animali trattati con la dose di 250 µl/kg di olio essenziale di bergamotto, non si osserva un aumento della percentuale del tempo speso nelle braccia aperte (parametro utilizzato per indicare l’effetto ansiolitico dei farmaci) ma la riduzione del numero totale di entrate nelle braccia aperte e chiuse, che avvalora l’ipotesi di un effetto ansiolitico-sedativo del fitocomplesso e che non si osserva con la benzodiazepina. Quest’effetto è ancora di più evidente per il gruppo di animali trattati con la dose più alta di BEO. In particolare, i test degli animali di quest’ultimo gruppo sono caratterizzati da un aumento del tempo speso nelle braccia aperte a supporto dell’ipotesi non di un effetto ansiolitico del fitocomplesso ma di un comportamento dell’animale in cui esso effettivamente “non sceglie” di stare nell’uno o nell’altro braccio del labirinto perché manca la fase di esplorazione iniziale, ma rimane più tempo nelle braccia aperte per il subentrare di una riduzione nei movimenti (Tabella 1). In particolare, in questo gruppo sperimentale, si è osservato per tre degli animali trattati, un’eccessiva permanenza nelle braccia aperte, e per uno solo, una notevole riduzione della percentuale di tempo speso nelle stesse. Anche se il numero totale di entrate nelle braccia aperte e chiuse risulta essere inferiore per i gruppi di animali trattati con BEO 250 e 500 µl/kg i.p., sia rispetto al controllo che al gruppo trattato con diazepam, ciò non è da considerare come una vera e propria compromissione dell’attività locomotoria ma piuttosto come la comparsa di una ridotta capacità nei movimenti, dovuta verosimilmente alla componente “sedativa” dell’olio essenziale che risulta predominante rispetto a quella di tipo ansiolitico. Per capire se questo effetto potesse caratterizzare una semplice alterazione dei movimenti o uno stato di totale compromissione, si è voluto sottoporre l’animale a una situazione di stress e ansia “estrema”, che compaiono in condizioni sperimentali come il Porsolt test. L’animale messo a nuotare in un cilindro contenente acqua, si muove, infatti, in un ambiente ristretto e dal quale non esiste possibilità di fuga. Di conseguenza, a un periodo d’iperattività durante il quale esso prova a scappare, segue uno stato d’immobilità che riflette una situazione di disperazione o di tono dell’umore depresso, come se l’animale avesse “perso la speranza” (Porsolt et al., 1977, 1978). Questo test è ampiamente utilizzato per la valutazione dell’attività antidepressiva di farmaci ma dalla
37 letteratura, evidenze sperimentali, ne indicano l’impiego anche per fornire importanti informazioni sull’attività locomotoria degli animali e per la valutazione delle proprietà sedative di composti come gli oli essenziali (Lim et al., 2005). L’utilizzo anche in questo test del diazepam come farmaco ad attività ansiolitica è stato utile per meglio evidenziare le proprietà ansiolitiche e/o sedative dell’olio essenziale. L’analisi dei parametri comportamentali mostra, infatti, delle marcate differenze tra gli animali trattati con il diazepam e quelli trattati con BEO. Per questi ultimi ed in particolare per quelli trattati con la dose di 250 µl/kg, si osserva una riduzione statisticamente significativa dell’attività locomotoria (swimming). Tal effetto è di natura dose- dipendente, riducendosi con l’aumentare della dose del fitocomplesso. È importante evidenziare che con la benzodiazepina si osserva solo una minima riduzione del tempo speso a nuotare. Altre differenze con il farmaco ansiolitico, si osservano per il parametro immobility che aumenta considerevolmente dopo somministrazione del BEO. In particolare l’animale rimane a galla, senza perdere la “percezione della realtà”. Questo stato di sedazione apparente indotto dall’olio essenziale di bergamotto, è evidenziato dal parametro struggling (che descrive lo stato di ansia e di paura dell’animale) che rimane più elevato rispetto al gruppo controllo, per tutta la durata del test, caratterizzato da un alto margine di errore standard. I risultati ottenuti nel gruppo trattato con il diazepam, avvalorano l’ipotesi di un effetto sedativo legato al fitocomplesso. Infatti, la benzodiazepina a dosi ansiolitiche evidenzia un comportamento non sovrapponibile a quello del BEO, non modificando i parametri
immobility e swimming rispetto al gruppo controllo. Verosimilmente l’impiego di una
dose più alta elevata di diazepam avrebbe evidenziato una simile risposta sedativa (Santos et al., 2012). Mentre è ben noto il meccanismo d’azione del diazepam e i suoi effetti sulla trasmissione GABAergica (Goodman and Gilman 2012) che sono alla base di ciò che si osserva nei test, non è chiaro, invece, come il BEO possa “influenzare” il comportamento. Verosimilmente, ciò potrebbe essere dovuto alla capacità di specifici componenti contenuti nell’olio di interferire con la trasmissione sinaptica (Morrone et al., 2007) ed in grado, pertanto di modulare attività fisiologiche di base come l’attività elettroencefalografica (Rombolà et al., 2009). In accordo con tale ipotesi, durante il test dell’open fieldè è stato evidenziato un aumento statisticamente significativo dei livelli ippocampali di glutammato negli animali trattati sistemicamente con la dose di 500 µl/kg di BEO. È ben dimostrato che molte funzioni proprie del cervello (dalla percezione ordinata delle sensazioni e del dolore, all’apprendimento, alla memoria, al
38 controllo della funzione motoria), avvengono grazie alla liberazione di glutammato a livello sinaptico (Goodman and Gilman 2012). La difficoltà nel determinare un coerente meccanismo d’azione che possa spiegare gli effetti indotti dal BEO e il coinvolgimento di una specifica trasmissione nervosa, è sicuramente dettata dal fatto che per via sistemica, è somministrato interamente il fitocomplesso e non un singolo componente della miscela. Considerando tali evidenze sperimentali e soprattutto, l’impiego clinico del BEO in aromaterapia, sono stati studiati gli effetti dell’olio essenziale nell’open field test, dopo somministrazione per via inalatoria. La curva dose-risposta costruita con i volumi utilizzati di BEO per via inalatoria (5, 20 e 50 µl) non ha, tuttavia, evidenziato variazioni statisticamente significative dei parametri comportamentali studiati rispetto al gruppo controllo. Ciò potrebbe in parte derivare dal fatto che per poter osservare gli effetti del fitocomplesso per via inalatoria, è necessario vaporizzare volumi più alti dello stesso, visto che i soli costituenti della frazione volatile arrivano a livello del SNC. Le differenze osservate nei risultati del test comportamentale sembrerebbero supportate anche da un differente profilo neurochimico dopo inalazione rispetto alla somministrazione sistemica.
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6. CONCLUSIONI
I risultati ottenuti nel presente lavoro evidenziano un’attività sedativa dell’olio essenziale di bergamotto di tipo dose-dipendente. Tale effetto si osserva anche per la benzodiazepina, a dosi non ansiolitiche ma per quest’ultima appare evidente la comparsa di uno stato di sedazione “profonda” che si traduce nell’animale come totale immobilità e perdita dei movimenti più che in una riduzione dell’attività locomotoria, osservata invece per il BEO. La caratterizzazione di questi effetti biologici dell’olio essenziale di bergamotto assume particolare rilevanza in considerazione delle potenziali applicazioni cliniche del suo impiego nell’uomo. I risultati finora ottenuti avvalorano l’ipotesi relativa all’utilizzo di estratti naturali come rimedi terapeutici, da sostituire o affiancare ai farmaci ansiolitici convenzionali, come le benzodiazepine. Tali estratti sono caratterizzati dalla comparsa di un numero ridotto di effetti collaterali rispetto a quelli osservati in seguito all’assunzione di farmaci ansiolitici, come ad esempio dipendenza psicologica e/o effetti amnesici. Inoltre, dato che è sempre più elevato il numero di persone che ricorre all’aromaterapia e ai massaggi aromaterapici, come “terapia complementare”, diventa di estrema importanza studiare e caratterizzare i meccanismi molecolari non ancora noti, alla base degli effetti centrali del BEO. Tali osservazioni rappresentano i presupposti per dar luogo ad ulteriori esperimenti, al fine di caratterizzare meglio il profilo neurofarmacologico dell’essenza di bergamotto e consentirne, quindi, un uso razionale in terapia.
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