Sperimentazioni nelle farfalle

Sono state effettuate due sperimentazioni con il naso elettronico: la prima nell’estate del 2007 con individui di allevamento della specie H. fagi, allestita presso i laboratori di Chimica e di Ingegneria elettronica dell’Università di Tor Vergata; la seconda, nel 2008, su individui selvatici di entrambe le specie H. fagi ed H. alcyone (Figura 21, Tabella 10) nella località di studio, Vallemare (RI).

Figura 21 – Prima sperimentazione in laboratorio (2007); Seconda sperimentazione nella località di studio in condizioni seminaturali. (2008).

Le prima sperimentazione ha avuto lo scopo di valutare l’applicabilità del naso elettronico alle farfalle allo scopo di questa ricerca e quindi anche di definire le condizioni sperimentali ottimali per le misure. La seconda invece rappresenta la prima campagna di misure i cui risultati, seppur ancora preliminari, sono riportati in questa tesi (vedere par. 3.7 - nel cap.5 dei risultati).

Nelle sperimentazioni sono state sottoposte allo strumento individui allo stadio adulto e vivente all’interno di barattoli di vetro (314 ml) chiusi ermeticamente con parafilm solo per il tempo della misura da un campionatore (Ø = 6,5 cm). Il barattolo contenente la farfalla veniva collegato allo strumento attraverso due tubiciniinseriti a livello del campionatore di metallo fissato sulla sommità del recipiente (Figura 22). Uno dei tubicini porta l’aria nel barattolo, l’altro l’aspira confluendole verso la camera di misura ai sensori del naso. Nella fase di misura e di pulizia il percorso dell’aria nei tubi e nello strumento viene controllato automaticamente attraverso una valvola facendo arrivare ai sensori ora aria sintetica pulita ora aria con il campione di composti volatili da misurare. Gli individui sono stati manipolati il meno possibile sia in allevamento

separatamente in gabbiette singole con cibo a disposizione in attesa della preparazione per le misure al naso elettronico. Alla fine della stagione di misure, tutti gli individui sono stati conservati per l’esame dei caratteri diagnostici ai fini di una corretta determinazione delle specie.

Tabella 10 – Individui sottoposti al naso elettronico nelle due sperimentazioni 2007 e 2008.

H. fagi H. alcyone

Sperimentazione

Maschi Femmine Maschi Femmine

2007 8 - - -

2008 23 2 25 2

In attesa della misura le farfalle venivano inserite già nei barattoli di vetro e chiuse al loro interno con una retina (Figura 22) che permette il ricambio d’aria nel recipiente ed allo stesso tempo impedisce la fuga dell’individuo. Alla fine della sessione delle misure gli individui venivano riposti in gabbiette separate.

Ciascun barattolo è stato etichettato con una numerazione progressiva attribuita a ciascun individuo al momento dello sfarfallamento o della cattura in natura. Si è cercato per quanto possibile di utilizzare per ciascun individuo sempre lo stesso barattolo nelle diverse sessioni di misura. In ogni caso, i barattoli sono stati sempre sterilizzati con bollitura in acqua distillata e lasciati asciugare capovolti per ovviare di falsare la risposta dello strumento per problemi di contaminazione con odori diversi.

Per quanto riguarda l’analisi dei dati raccolti in entrambe le sperimentazioni poiché esse rappresentano le prime applicazioni condotte sulle farfalle i dati raccolti sono stati esaminati sotto un aspetto sensoristico ai fini della valutazione della capacità discriminatoria del naso elettronico. Quindi sono state considerate tutte le misure effettuate anche quelle ripetute per ciscun individuo.

I dati sono stati analizzati sia qualitativamente (box plot) che attraverso analisi delle componenti principali (PCA) utilizzando il Software Mathlab 7.0.

Figura 22 – Un maschio di H. fagi durante la fase di misura al naso elettronico (sinistra); individui in attesa delle prove ( destra).

v Sperimentazione 2007

Le prime prove hanno permesso di stabilire il protocollo di misura sulla base della risposta dello strumento riguardo ai parametri ambientali (temperatura) strettamente legati all’attività vitali delle farfalle ed ai parametri comportamentali (movimento, interazione con la partner). Ciascun individuo è stato misurato almeno tre volte al fine di valutare la ripetibilità delle misure . L’effetto della temperatura è stato studiato valutando la risposta dello strumento sottoponendo ad esso maschi di H. fagi in tre condizioni di temperatura differenti: OUT, IN e SUN. In particolare nella condizione OUT gli individui venivano tenuti in attesa della misura alla temperatura ambiente all’esterno del laboratorio all’ombra e misurati in un locale adiacente a porte aperte cosicché la temperatura fosse quella esterna (in media TOUT = 29 °C). Nella condizione IN gli individui venivano tenuti e misurati all’interno del laboratorio ad una temperatura media di 24°C. Nella condizione SUN le farfalle venivano misurate

Figura 23 – Prove sull’effetto del movimento: individuo non perturbato (sinistra); individuo soggetto a perturbazione (destra).

Sulla base delle osservazioni comportamentali sul corteggiamento il movimento è stato ritenuto un fattore che avrebbe potuto influenzare il rilascio dei composti volatili e quindi la risposta dello strumento. Per tale motivo sono state realizzate delle prove ad hoc che tenessero conto di questo aspetto. L’effetto del movimento è stato esaminato, valutando la risposta dei sensori in fase di misura, sottoponendo gli individui allo strumento in due condizioni diverse: assenza di perturbazione e presenza di perturbazione. La perturbazione, realizzata attraverso l’agitazione del recipiente contenente l’individuo, sollecitava il suo movimento (battito delle ali) nel barattolo (Figura 23) simulando così grossolanamente le azioni di corteggiamento. Per ciascun maschio sono state effettuate quattro prove ad una temperatura ambiente costante di circa 30 °C: due senza perturbazione (a maschio fermo) e due con perturbazione (maschio in movimento). In queste misure sono stati utilizzati gli stessi individui delle prove precedenti ed in particolare quattro maschi di H. fagi dell’allevamento.

Tabella 11 – Naso elettronico: tempi di misura e pulizia (minuti) adottati nelle diverse prove.

Sperimentazione Prove Tempo di

pulizia Tempo di misura 2007 IN,OUT,SUN 10’ 3’ NO/SI perturbazione 10’ 3’ 2008 Maschi 10,5’ 2,3’ Coppie 14’ 3,5’ v Sperimentazione 2008

Sulla base delle condizioni sperimentali definite nella sperimentazione precedente, nel 2008 è stata messa in opera la prima campagna di misure con il naso elettronico al fine di caratterizzare il pattern chimico delle due specie di lepidotteri oggetto di studio e perseguire lo scopo di questa ricerca. Le misure sono state realizzate nella località di studio a temperature ambientali senza perturbazione degli individui. In particolare sono stati svolti esperimenti sui maschi (Na = 24, H. alcyone; Nf = 20, H. fagi) ed alcune prove preliminari sulle coppie maschio-femmina (Na = 2; Nf = 2).

La misura dei maschi ha l’obiettivo di caratterizzare il pattern chimico delle due specie e di rilevare delle differenze tra di esse, allo scopo di verificare se esiste un meccanismo di isolamento chimico tra le due specie. Sono state effettuate tre misure per ciascun maschio. In Tabella 11 sono indicate le tempistiche relative alle fasi di misura e di pulizia dei sensori. Tutti gli individui

stessa specie. Il processo di campionamento per i maschi è riassunto nella Figura 24.

Figura 24 - Set sperimentale per la misura dei maschi singoli.

La misura delle coppie invece si propone di indagare lo scambio dei segnali chimici tra i due sessi, verificando l’effetto della vista e dell’odore sulle risposte dei sensori. Per queste misure è stato necessario allestire un set sperimentale ad hoc differente a seconda delle condizioni testate. Il maschio e la femmina sono stati collocati in due barattoli separati collegati in modo differente a seconda del set sperimentale messo in atto. Ciascuna coppia è stata misurata per tre volte in ciascuno dei diversi set sperimentali. Gli individui sono stati posti in tre condizioni differenti indicate come : 1) NO-COM e NO-VISTA (Figura 25); 2) COM e NO-VISTA (Figura 27) e 3) COM – VISTA (Figura 26). In tutte le condizioni, lo strumento ha misurato sempre la somma degli odori provenienti dai due barattoli. In dettaglio, nel primo caso, maschio e femmina non si vedono e l’uno non può percepire l’odore dell’altra e viceversa. Nel secondo caso gli individui ancora non hanno possibilità di vedersi per la presenza della barriera

interposta tra i due barattoli, ma questi sono collegati attraverso un tubicino e quindi il maschio può percepire olfattivamente la presenza della femmina e viceversa. Nel terzo caso i barattoli sono collegati con un tubicino e la barriera tra essi non è presente, quindi maschio e femmina possono vedersi e sono anche in comunicazione aerea.

Figura 25 – Set sperimentale per la misura delle coppie, NO-COM e NO-VISTA.

Il set sperimentale usato in 2 e 3 è lo stesso usato, ma la barriera interposta tra i barattoli che in 2 è fissa, in 3 è stata tolta al momento della misura e ripristinata in fase di pulizia. Questo è stato fatto al fine di evitare una perdita di efficacia dello stimolo visivo rappresentato dalla vista del partner.

Figura 26 – Prove al naso elettronico sulle coppie: in assenza (destra) ed in presenza (sinistra) di barriera alla vista del partner.

Figura 27 – Set sperimentale per la misura delle coppie, COM/NO-VISTA. Il set COM/VISTA è identico, ma si rimuove la barriera tra i barattoli.