L‟evidenza di un possibile coinvolgimento del gene ASMT proviene da uno studio in cui si è stato effettuato un‟analisi di mutazioni e studi di associazione in un ampio campione di individui affetti da autismo (Melke et al.). In seguito allo screening di mutazioni condotto su tutti gli esoni di ASMT in 250 individui, sono state identificate diverse rare varianti genetiche :
1. Una variante di splicing (IVS5+2T>C) individuata in 3 famiglie con autismo 2. Quattro varianti non sinonime (N17K, K81E, G306A, L326F); di cui l‟ultima in tre famiglie.
3. Due varianti sinonime (N167N, Q205Q)
I nove individui con le varianti identificate, presentano anche iperattività ed alcuni hanno disturbi del sonno. La segregazione di ogni variante per ciascuna famiglia è schematizzata in figura 19. Le varianti N17K (rs17149149) and L326F sono state individuate anche in un campione controllo, mentre la variante di splicing (IVS5+2T>C) è presente in due famiglie ed in nessuno dei 426 controlli analizzati.
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Figure 19. Varianti non sinonime in ASMT (A) Le tre famiglie con la variante di splicing IVS5+2T>C; gli studi di RT-PCR sono stati condotti amplificando il cDNA di BLCL tra l‟esone 4 e 6 di ASMT del probado della famiglia ASD1. In figura, la lane 1 e 2 appartengono al probando (lane 1 +RT, lane 2 -RT). Si osserva, oltre al trascritto wt anche il trascritto in cui è presente un‟inserzione di 31bp del trascritto originario dovuto alla variante di splicing IVS5+2T>C; si osserva il trascritto wt nella lane 3 (lane 3 +RT, lane 4 -RT). L‟inserzione di 31bp dovuta alla creazione di un sito accettore di splicing alternativo, a valle dell‟esone 5, porta alla formazione di una sequenza proteica addizionale indicata in rosso; il frame shift che ne deriva causa la terminazione prematura della proteina che manca del dominio metil-transferasico. (B) Sono indicate le famiglie in cui sono state individuate ulteriori varianti non sinonime e la loro conservazione tra le differenti specie. I colori nei pedigree delle distinte famiglie indicano aspetti relativi alla diagnosi: ritardo mentale moderato (arancione) o grave (rosso), sindrome di Asperger o autismo di tipo alto funzionamento (giallo), ADHD (blù) e depressione (rosa). Il probando ASD3 rientra nei criteri diagnostici sia per ADHD che per autismo ad alto funzionamento, quello ASD7 sia per ADHD che per la sindrome di Asperger. L‟asterisco indica la presenza della mutazione mentre il punto l‟assenza di DNA per l‟analisi.
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L‟analisi biochimica ha mostrato che la variante IVS5+2T>C porta alla creazione, rispetto al sito canonico, di un sito accettore di splicing a valle dell‟esone 5, con la conseguente formazione di un‟inserzione di 31bp del trascritto. Il prodotto proteico che ne risulta è una proteina tronca che manca del dominio metil-transferasico. Inoltre, ulteriori dati dimostrano come le varianti IVS5+2T>C and L326F sono associate a bassi livelli dell‟attività enzimatica di ASMT e della concentrazione di malatonina (figura 20)
Figure 20. Attività enzimatica della proteina ASMT e concentrazione di melatonina nelle famiglie con le mutazioni individuate. (A) L‟attività enzimatica della protein ASMT è stata misurata sulle piastrine dei membri della famiglia ASD1 ed ASD6 che sono quelle che portano rispettivamente la variante di splicing IVS5+2T>C e la missenso L326F. (B) E‟ indicato negli stessi individui la concentrazione di melatonina nel sangue. C: controllo; F: padre; M: madre; P: individuo affetto.
Ulteriori evidenze sperimentali del contributo del gene ASMT al fenotipo autistico provengono dagli studi di associazioni di marcatori polimorfici lungo il gene. In particolar modo è stata effettuata un‟analisi per stabilire i blocchi di linkge disequilibrium nella regione in cui mappa il gene ASMT, e sono stati selezionati 13 SNPs per catturare la maggior diversità aplotipica nei 3 blocchi di LD (figura 21) (Melke et al. 2007)
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Figura 21: struttura dei blocchi di LD del gene ASMT
I risultati ottenuti evidenziano che le frequenze alleliche di due SNPs (rs4446909 e rs5989681) nel promotore B sono significativamente diverse tra il campione di 278 individui con autismo e quello di 255 controlli. In particola modo, l‟aplotipo H1 (GGGC) del primo blocco di LD è più frequente nel campione autistico rispetto al gruppo controllo, mentre l‟aplotipo H3 (ACGC) è più frequente nei controlli (tabella 3).
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Tabella 3: frequenze alleliche dei polimorfismi del promotore B nei pazienti e nei controlli.
Il coinvolgimento dell‟aplotipo H1 (GGGC) è emerso anche dall‟analisi TDT (Transmission Disequilibrium Test), in cui è statisticamente significativo la trasmissione di questo aplotipo dai genitori ai figli affetti rispetto agli altri aplotipi (figura 21).
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Figura 21: (A) Schema riassuntivo dei valori di P value (-log10) per tutti i marcatori analizzati utilizzando il caso/controlli o il TDT. I marcatori (in successione: rs4446909, rs5989681, P1BC, rs6644635) nella regione in grigio sono quelli del blocco di LD appartenente al promotore B. Gli SNPs che identificano l‟aplotipo d rischio H1 (GGGC) sono indicati come una linea continua (cerchi neri nel caso del caso/controllo e cerchi vuoti nel caso del TDT). (B) Quantificazione del trascritto di ASMT in relazione ai genotipi dei marcatori rs4446909 e rs5989681 (A: genotpi A/A o A/G; C: genotipi C/C o C/G; G: genotipi G/G). I circoli neri indicano gli individui autistici, mentre quelli bianchi indicano i controlli. Gli studi sono stati condotti su RT-PCR di linee linfoblastoidi di 38 individui autistici e 29 controlli.
L‟analisi successiva dei livelli di espressione del gene ASMT in relazione agli aplotipi del promotore B, ha messo in risalto una stretta correlazione tra i bassi livelli del trascritto e l‟allele G degli SNP rs4446909 e rs5989681 trovati precedentemente associati all‟autismo (figura 21).
Questi dati suggeriscono che esistono fattori genetici del gene ASMT che contribuiscono a particolari aspetti del fenotipo autistico come disturbi del sonno e ritmi circadiani alterati. Le evidenze sperimentali riportate in questo studio risultano interessanti, benché le varianti genetiche incontrate sono in un numero limitato di casi e l‟aplotipo di rischio non è il solo fattore che spiega la riduzione dell‟attività enzimatica.
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6. Studi di associacizione ad alta densità ed analisi di CNVs in due
loci di suscettibilità all’autismo: 2q24-32 e 7q21-32
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