4. Studi sulla sicurezza dei nanomateriali ne
4.2 Studi di permeazione/penetrazione cutanea
4.2.1 Studi in vitro
Negli studi in vitro analizzati sono state utilizzate diverse linee cellulari e diversi approcci metodologici; la molteplicità e variabilità nella metodolo- gia utilizzata ha generato una certa discrepanza trai vari risultati ottenuti. Ad esempio, in alcuni studi è stata evidenziata una notevole differenza 27
nella sensibilità tra i test di citotossicità eseguiti sulle diverse cellule in
Literature review on the safety of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in 25
sunscreens. Scientific review report 11 January 2017
Chaudhry et al., 2015 Opinion of the Scientific Committee on Consumer safety 26
(SCCS) - Revision of the opinion on the safety of the use of titanium dioxide, nano form, in cosmetic products. Regulatory toxicology and pharmacology : RTP. 2015;73(2):669-70.
Park HS, Shin SS, Meang EH, Hong JS, Park JI, Kim SH, et al. (2014) A 90-day stu
27 -
dy of subchronic oral toxicity of 20 nm, negatively charged zinc oxide nanoparticles in Sprague Dawley rats. International journal of nanomedicine.;9 Suppl 2:79-92.
esame. Inoltre si è concluso che "molto lavoro deve ancora essere fatto prima che i saggi di tossicità in vitro possano svolgere un ruolo di impor- tanza nella valutazione del rischio dei nanomateriali".28
Un lavoro successivo mette in evidenza le complessità associate a 29
studi in vitro, e la necessità di stabilire approcci sperimentali convalidati per rilevare ogni rischio biologicamente rilevante collegato all’impiego di nanomateriali.
Gli studi esaminati hanno coinvolto più tipologie di pelle e i risultati han30 -
no messo in evidenza che la pelle del suino e del ratto sono rispettiva- mente più permeabili di 4 e 9-11 volte della pelle umana.
Questa variabilità inter-specie nella penetrazione a livello cutaneo richie- de cautela quando si estrapolano i risultati positivi degli studi sugli animali per valutare la stima del danno potenziale nell'uomo. Infatti, i risultati di questo studio possono essere accettati solo come preliminari e specula31 -
tivi per quanto riguarda il possibile danno nell’uomo. In particolare i risul- tati sulla pelle suina in vitro e in vivo indicano chiaramente che le NP di TiO2 riescono a penetrare nello strato corneo, nello strato granuloso e strato cellulare basale, ma non nel derma. Le particelle che riescono a penetrare nello strato cellulare basale sono solo quelle di dimensione di 4 nm. In conclusione la capacità delle NP di TiO2 di penetrare nella pelle di maiale è risultata dipendente dalla dimensione.
Park HS, Shin SS, Meang EH, Hong JS, Park JI, Kim SH, et al. (2014) A 90-day stu
28 -
dy of subchronic oral toxicity of 20 nm, negatively charged zinc oxide nanoparticles in Sprague Dawley rats. International journal of nanomedicine.;9 Suppl 2:79-92.
Stone V, Johnston H, Schins PF. (2009) Development of in vitro systems for nano
29 -
technology: methodological considerations. Crit Rev Toxicol; 39(7): 613-626.
Nohynek GJ, Dudour EK & Roberts MS. (2008) Nanotechnology, cosmetics and the
30
skin; is there a health risk? Skin Pharmacol Physiol. 21: 136-149.
Wu J, Liu W, Xue C, Zhou S, Lan F, Bi L, Xu H, Yang X & Zeng FD. (2009) Toxicity
31
and penetration of TiOnanoparticles in hairless mice and porcine skin after subchronic dermal exposure.Toxicol Lett; 191(1): 1-8.
Questa è una scoperta importante considerando che una grande maggio- ranza di NP di TiO2 è presente nelle formulazioni protettive solari come agglomerati relativamente grandi, che possono aumentare solo dopo l’applicazione cutanea. In seguito sono stati registrati dati che suggeri- scono un’azione penetrativa delle NP di TiO2 al di là dello strato corneo, tutto ciò condizionato da importanti limitazioni metodologiche che hanno messo in dubbio la validità e l’estensione di questi dati nell’uomo.
L’effetto di promotori della pemeazione cutanea quali acido oleico e/o etanolo sulla penetrazione di ZnO nanoparticellare è stato valutato da Kuo et al (2009) utilizzando campioni cutanei di topi hairless. . I risultati 32
indicavano che le NP ZnO avevano la capacità di penetrare nello strato corneo, ma non in cellule vitali (epidermide e derma). Questo risultato ha suggerito che le NP di ZnO non sono in grado di penetrare nelle cellule vitali cutanee dell’uomo, proprio
perché
tale evento non si verifica nem- meno sperimentalmente su cute di animali con elevata permeabilità cuta- nea sotto l’effetto di promotori.È stata inoltre esaminata la possibilità che i follicoli piliferi possano svol- gere una parte importante nell’assorbimento percutaneo dei nanomateria- li. Dallo studio è stato ipotizzato che i follicoli piliferi che rappresentano 33
siti molto limitati per l’assorbimento (fino allo 0,1% della superficie cuta- nea), fossero permeabili alle NP, anche se non sono state studiate appli- cazioni specifiche di NP ZnO o TiO2.
Kuo TR, Wu CL, Hsu CT, lo W, Chiang SJ, Lin SJ, Dong CY & Chen CC. (2009)
32
Chemical enhancer induced changes in the mechanisms of transdermal delivery of zinc oxide nanoparticles. Biomaterials. 30: 3002-3008.
Otberg N, Patzelt A, Rasulev U, Hagemeister T, Linscheid M, Sinkgraven R, Sterry W
33
& Lademann J. (2008) The role of hair follicles in the percutaneous absorption of caf- feine. Brit J Clin Pharmacol. 65(4): 488-492.
In uno studio ulteriore non è stato rilevato TiO2 nel tessuto epidermico 34
o dermico al di fuori dei follicoli. Allo stesso modo, altri studi hanno rileva- to solo tracce di NP TiO2 nella sezione superiore del follicolo pilifero sen- za alcuna prova di assorbimento nell'epitelio follicolare. Solo con studi successivi si è concluso che le NP di TiO2 sembrano penetrare nella 35
pelle umana probabilmente attraverso i lipidi del sebo del follicolo pilifero, senza però trovare nessuna concentrazione di NP TiO2 all'interno della matrice sebacea dei follicoli piliferi.
Studi più recenti hanno sostanzialmente sostenuto e concluso che ne’ le NP di TiO2 ne’ le NP di ZnO, applicate su campioni di pelle umana sana o irritata, sono in grado di penetrare l’epidermide in concentrazione signifi- cative.
Gli studi sono stati eseguiti su tre preparazioni di nanoparticelle di ZnO testate per la loro capacità di penetrare nella pelle umana:
1. Soluzione di NP di ZnO sospese in caprylic/capryc triglycerides (co- munemente usati in preparati per la protezione solare);
2. Soluzione acquosa pH 6 (per imitare il pH della pelle naturale); 3. Soluzione acquosa pH 9 (che minimizza i danni all’epidermide).
Quando applicate a campioni di pelle umana in vitro per 48 h, nessuna di queste formulazioni di NP di ZnO è stata in grado di penetrare oltre gli strati superficiali dello strato corneo nell'epidermide intatta. È stato dimo- strato, tuttavia, che l'idrolisi dello ZnO ha causato un aumento degli ioni Zn2+ tale da renderli in grado di penetrare all’interno degli strati vitali del-
l’epidermide. Gli autori suggeriscono che gli incrementi nei dosaggi si-
Lademann J, Knorr F, Richter H, Blume-Peytavi U, Vogt A, Antoniou C, Sterry W &
34
Patzelt A. (2008) Hair follicles – an efficient storage and penetration pathway for topi- cally applied substances. Skin Pharmacol Physiol. 21: 150-155.
Bennat C & Muller-Goymann CC. (2000) Skin penetration and stabilization of formu
35 -
lations containing microfine titanium dioxide as physical UV filter. Internat J Cosmet Sci. 22(4): 271-283.
stemici di zinco rilevati nell'uomo dopo l'applicazione di prodotti per la
protezione solare rappresentino ioni Zn2+ e non ZnO nanoparticellare.
Allo stesso modo, in un altro studio, lo zinco è stato rilevato solo nello strato corneo e non negli strati sottostanti di epidermide vitale dopo appli- cazione di NanosunTM 65/30 su pelle di suino.36
Pertanto, le prove attualmente disponibili suggeriscono che la probabilità di penetrazione delle nanoparticelle di TiO2 o di ZnO oltre gli strati cuta- nei superficiali fino agli strati vitali del derma è estremamente bassa.
4.2.2 Studi in vivo.
Il potenziale assorbimento sistemico di nanoparticelle di ZnO è stato va- lutato in condizioni di vita reale di utilizzo di prodotti solari su volontari umani per un periodo di cinque giorni. I livelli di zinco nel sangue e nelle 37
urine di soggetti esposti ai prodotti solari contenti ZnO nano, aumentava- no in tutti i soggetti nel periodo di esposizione, con livelli significativamen- te più alti, in soggetti di sesso femminile, sottoposti ad applicazioni di crema solare contenente NP di ZnO, in forma nano, rispetto a quelli esposti a particelle di ZnO più grandi o di soggetti di sesso maschile esposti a particelle di entrambe le dimensioni.
Detoni CB, Coradini K, Back P, Oliveira CM, Andrade DF, Beck RC, et al. ( 2014) Pe
36 -
netration, photo- reactivity and photoprotective properties of nanosized ZnO. Photo- chemical & photobiological sciences. 13(9):1253-60.
Gulson B, McCall M, Korsch M, Gomez L, Casey P, Oytam Y, Taylor A, Kinsley L &
37
Greenoak G. (2010) Small amounts of zinc from zinc oxide particles in sunscreens ap- plied outdoors are absorbed through human skin. Toxicol Sci. 118: 140-149.
Tuttavia, ci sono delle preoccupazioni relative alla metodologia e alla conduzione dello studio che hanno un impatto sulla validità di tali risultati. Infatti, la determinazione della concentrazione di ioni Zn2+ nel sangue come prova dell'esposizione sistemica o dermica alle NP di ZnO non di- mostra necessariamente la penetrazione dermica o l'esposizione sistemi- ca ad esse in quanto il metodo utilizzato per rilevare lo Zn dei filtri solari non era in grado di discriminare le nanoparticelle di ZnO dagli ioni Zn2 +.
Tuttavia, queste osservazioni possono essere importanti per una valuta- zione sui rischi umani, in quanto essi dimostrano che il livello di esposi- zione allo zinco dopo l'uso a breve termine e in tempo reale della crema solare con NP di ZnO è stato trascurabile rispetto ai livelli di zinco nor- malmente presenti nel corpo con una tipica dieta quotidiana. Pertanto, tale esposizione non è probabile che sia di alcuna preoccupazione per la salute umana.
Successivamente si è studiata la penetrazione dermica di NP di TiO2 e 38
ZnO nei volontari umani dopo l'applicazione in vivo, con la tecnica della biopsia cutanea. Lo studio è stato effettuato simulando una cute danneg- giata applicando la tecnica del tape-stripping per rimuovere lo strato cor- ne.o È interessante notare che la rimozione dello strato corneo ha deter- minato una scarsa adesione della protezione solare. Le NP non sono sta- te in grado di penetrare oltre lo strato corneo; né il titanio (Ti) né Zn2+
erano rilevati ne derma dopo 48 ore di esposizione alla crema solare in condizioni occlusive.
Il problema della penetrazione di ingredienti nanoparticellari attraverso la cute danneggiata (con dermatite o con scottature solari) è stato appro-
Filipe P, Silva JN, Silva R, Cirne de Castro JL, Marques-Gomes M, Alves LC, Santus
38
R & Pinheiro T. (2010) stratum corneum is an effective barrier to TiO and ZnO nanopar- ticle.
fondito anche in altro studi . Si è concluso che la penetrazione attraverso 39
la pelle compromessa e lesa potrebbe essere alla penetrazione attraver- so la cute sana (sono stati citati riscontri di altri studi). Per la pelle psoria- tica (irritata ed infiammata da psoriasi), l'applicazione cutanea ha portato alla sola penetrazione negli strati superiori dello strato corneo. Ulteriori dati in vitro riguardanti l’applicazione di nano-TiO2 su cute danneggiata 40
mediante tape-stripping non hanno rilevato penetrazione di Ti nelle cellule vitali della cute.
Uno studio ulteriore di penetrazione cutanea è stato condotto su minipigs utilizzando tre diverse forme di NP di TiO2. 41
Analisi dettagliate con microscopia elettronica di trasmissione, hanno rile- vato la penetrazione minima di NP di TiO2 negli strati sub-epidermici della pelle, ma non hanno trovato evidenza di penetrazione di NP di TiO2 at- traverso percorsi attesi come lumen follicolari. In concerto, questi risultati suggeriscono che il rischio di penetrazione di NP di TiO2 nel derma attra- verso i follicoli piliferi è molto basso.
La microscopia a due fotoni (una tecnica di imaging a fluorescenza che consente di fotografare tessuti) è stata utilizzata per visualizzare la distri-
Newman MD, Stotland M, Ellis JI. (2009) The safety of nanosized particles in titani
39 -
um dioxide and zinc oxide based sunscreens
Senzui M, Tamura T, Miura K, Ikarashi Y, Watanabe Y, Fujii M. (2010) Study on pene
40 -
tration of titanium dioxide (TiO) nanoparticles into intact and damaged skin in vitro. Sadrieh N, Wokovich AM, Gopee NV, Zheng J, Haines D, Parmiter D, Siitonen PH,
41
Cozart CR, Patri AK, McNeil SE, Howard PC, Doub WH & Buhse LF. (2010) Lack of significant dermal penetration of titanium dioxide from sunscreen formulations contai- ning nano- and submicron-size TiO2particles. Toxicol Sci; 115(1): 156-66.
buzione di NP di ZnO in vivo dopo l'applicazione topica di una crema so- lare. Non si è riscontrata penetrazione di nanoparticelle di ZnO oltre lo strato corneo, incluse le rughe microscopiche della pelle, dove questo strato è notevolmente più sottile.
Le NP di ZnO (<100 nm di diametro), sia non rivestite che rivestite con trietossicaprililsilano (per aumentare l’idrofobicità), non alteravano la fun- zione di idratazione o barriera della pelle quando applicate localmente sugli avambracci di volontari umani per 4 h. Si è notato che queste NP si localizzavano prevalentemente all'interno dello strato corneo e delle pie- ghe dell’epidermide. E’ stata riscontrata la prova di una minima penetra- zione nello strato granuloso dell'epidermide vitale solo per le NP rivestite. Inoltre, nessuna formulazione alterava lo stato di ossidazione delle cellule nell'epidermide vitale e nessuna delle NP di ZnO, sia rivestite che non, penetrava nell'epidermide vitale in condizioni occlusive. La penetrazione delle NP di ZnO in una pelle danneggiata (tape stripped), era minima e limitata allo strato più esterno delle cellule vitali dell'epidermide. Non risul- tavano cambiamenti nella morfologia cellulare nè evidenze di apoptosi in cellule epidermiche vitali dopo l'applicazione topica di entrambe le tipolo- gie di nanoparticelle per 6 ore.
La capacità delle NP di TiO2 di penetrare attraverso la pelle intatta è stata
valutata su volontari dalla carnagione chiara . La protezione solare con42 -
tenente NP di TiO2 è stata applicata una volta al giorno per 3 giorni a 2 partecipanti e una volta al giorno per 8 giorni a 4 partecipanti (2 mg/cm2
su una superficie di 5 cm2). Il giorno successivo all'ultima applicazione
della protezione solare, erano acquisite biopsie cutanee (circa 4 mm di diametro) da ciascun partecipante. In totale, meno di 30 nanoparticelle di TiO2 o i loro aggregati sono stati rilevati in tutti i campioni di cute indipen-
Coelho SG, Patri AK, Wokovich AM, McNeil SE, Howard PC, Miller SA. Repetitive
42
dentemente dalla profondità della pelle. La maggior parte delle NP è stata rilevata principalmente nei follicoli piliferi del derma. L'accumulo follicolare di NP non è stato associato alla penetrazione nelle cellule vitali della pel- le.43
In un altro studio condotto in due volontari umani, è stata applicata una protezione solare commerciale contenente NP di TiO2 (2 mg/cm2 su una
superficie totale di pelle di circa 600 cm2) 6 volte al giorno per 7 giorni
consecutivi sia su pelle intatta che bruciata dalla radiazione UVB. In en- trambi i tipi di cute sono state ritrovate NP di TiO2. Questo studio non ha
accertato se le quantità in tracce di NP riscontrate nelle cellule epidermi- che possano in seguito raggiungere la circolazione sistemica. 44
Un ulteriore studio condotto sui topi per valutare se le NP di ZnO possano essere rilevate negli organi dopo applicazione topica della protezione so- lare ha utilizzato animali di sesso femminile, immuno-competenti, e senza pelo, ai quali sono stati somministrati per via topica per un periodo di quattro giorni un totale di 0,6 g di formulazione contenente NP di ZnO. Gli ioni di Zn2+ derivanti dalle NP di ZnO sono stati rilevati nel fegato, nei
reni, nel cervello, nel cuore, nel polmone, nel sangue e nella milza . Il me- todo di rilevazione dello zinco non ha potuto distinguere tra Zn2 + libero
proveniente dalle NP e zinco presente nelle NP di ZnO, pertanto non è stato possibile determinare se le NP penetrassero nella pelle. Indipen- dentemente dalla fonte degli ioni Zn2 +, non vi è stato un aumento dei li-
Filipe et al., 2009;Epub 2009 Aug 18.Stratum corneum is an effective barrier to TiO2
43
and ZnO nanoparticle percutaneous absorption.
Lademann et al., 1999.Lademann J, Weigmann H, Rickmeyer C, Barthelmes H,
Schaefer H, Mueller G & Sterry W. (1999) Penetration of titanium dioxide microparticles in a sunscreen formulation into the horny layer and the follicular orifice. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 12: 247-256
Naess EM, Hofgaard A, Skaug V, Gulbrandsen M, Danielsen TE, Grahnstedt S, et al.
44
(2016) Titanium dioxide nanoparticles in sunscreen penetrate the skin into viable layers of the epidermis: A clinical approach. Photodermatology Photoimmunology and Photo- medicine.32(1):48-51.
velli di zinco totale negli organi e ciò suggerisce che i meccanismi omeo- statici endogeni di zinco non venissero alterati dall'applicazione della pro- tezione solare. I livelli serici di amiloidi A1 e A2 (marcatori dell'infiamma- zione della fase acuta) erano ridotti nei topi trattati con le NP di ZnO ri- spetto al controllo ed erano equivalenti ai valori in topi in stato di gravi- danza, indicando che le formulazioni non hanno indotto o aggravato l'in- fiammazione. Gli autori hanno successivamente esteso queste indagini con studi a lungo termine (36 settimane) che includevano gruppi di topi trattati con creme solari che contenevano NP di TiO2 e gruppi di topi trat- tati ed esposti a irradiazione UV . Questi studi hanno rivelato che l'uso della protezione solare è stato associato a una protezione significativa dalle malattie cutanee della pelle (che sono state osservate nei topi irra- diati UV) e che i livelli di zinco tissutale e i livelli di titanio epatico non era- no elevati nei topi trattati con protezione solare. Gli autori hanno concluso che l'applicazione ripetuta a lungo termine della protezione solare ai topi non ha portato ad una significativa penetrazione dermica, nè all'accumulo negli organi. Pertanto, sulla base sia degli studi in vitro, che utilizzano sia la pelle animale che umana che degli studi in vivo comprendenti studi su volontari, si può concludere che le nanoparticelle di ZnO o di TiO2 pene- trano minimamente negli strati cutanei e che la penetrazione è in gran parte limitata allo strato corneo. Ciò suggerisce che la probabilità che i filtri solari analizzati in forma nano producano citotossicità o causino dan- ni ad organi interni o tessuti è molto bassa poiché l'assorbimento sistemi- co è estremamente improbabile.
ALCUNI ESEMPI DI FORMULAZIONI SOLARI CONTENENTI NANOMATE- RIALI:
Figura 7: Protezione solare con SPF 50 (Avène)
INCI: Avene Thermal Spring Water (Avene Aqua). C12-15 Alkyl Benzoate.
Methylene Bis-Benzotriazolyl Tetramethylbutylphenol [Nano]. Water
(Aqua). Cetearyl Isononanoate. Diisopropyl Adipate. Isodecyl Neopenta- noate. Bis Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine. Diethylhexyl Bu- tamido Triazone. Aluminum Starch Octenylsuccinate. Butyl Methoxydi- benzoylmethane. Potassium Cetyl Phosphate. Titanium Dioxide (Ci 77891). Octyldodecanol. Decyl Glucoside. Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer. Benzoic Acid. Caprylic/Capric Triglyceride. Caprylyl Glycol. Disodium Edta. Fragrance (Parfum). Glyceryl Behenate. Glyceryl Dibehe- nate. Glyceryl Laurate. Hydrogenated Palm Glycerides. Hydrogenated Palm Kernel Glycerides. Iron Oxides (Ci 77492) (Ci 77491) (Ci77499). Propylene Glycol. Silica. Sodium Hydroxide. Sodium Myristoyl Glutamate. Talc. Tocopheryl Glucoside. Tribehenin. Xanthan Gum.
Figura 8:.Protezione solare SPF 15 (ST.BARTH)
INCI: Purified Carribean Sea Water, Cyclomethicone, Zinc Oxide[nano], Dimethicone, Octocrylene, Octyl Methoxy-cinnamate, Calendula officina- lis Oil, Cyclomethicone and Dimethicone Copolyol, PEG-30, Dipolyhydro- xystearate, Bixa Orellana extract, PPG-15 Stearyl Ether, Silicone and Beeswax, Dimethicone, Sodium Chloride, Parfum, Methylparaben, Ethyl- paraben, Propylparaben, Phenoxyethanol, Tocopheryl Acetate, Magne- sium Sulfate, Fumed Silica, Bisabolol, Decyl Glucoside, Benzyl Benzoate, Benzyl Salicylate.
Figura 9: Stick protettivo labbra (Bionike)
INCI:pentaerythrityl tetraisostearate, ethylhexyl palmitate, bis-diglyceryl polyacyladipate-2, bis-ethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine, ethy- lhexyl methoxycinnamate, ppg-3 benzyl ether myristate, candelilla cera (euphorbia cerifera (candelilla) wax), polyglyceryl-3 diisostearate, helian- thus annuus seed cera (helianthus annuus (sunflower) seed wax),
tita-
nium dioxide[nano]
, copernicia cerifera cera (copernicia cerifera (carnauba) wax), behenyl beeswax, stearyl beeswax, polyethylene, lau- royl lysine, silica, butyrospermum parkii butter (butyrospermum parkii (shea) butter), jojoba esters, sodium carboxymethyl beta-glucan, carnosi- ne, tocopheryl acetate, aqua (water), helianthus annuus seed oil (helian- thus annuus (sunflower) seed oil), tocopherol, pentylene glycol, ethyl va- nillin.Figura 10: Protezione SPF50 (Arganiae®)
INCI: Aqua, Dicaprylyl Carbonate, Caprylic/Capric Triglyceride, Polyglyce- ryl-3 Polyricinoleate, Ethylhexyl Salicylate, Ethylhexyl Methoxycinnamate, Diethylamino Hydroxybenzoyl Hexyl Benzoate, Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine, Cera Alba, Sesamum Indicum Seed Oil, Tris-Bi-
phenyl Triazine (nano), Argania Spinosa Kernel Oil, Glyceryl Stearate
SE, Magnesium Stearate, Calendula Officinalis Flower Extract, Butyro- spermum Parkii, Tocopheryl Acetate, Aloe Barbadensis Leaf Extract, Re- tinyl Palmitate, Decyl Glucoside, Vaccinium Myrtillus Fruit Extract, Ethy- lhexylglycerin, Magnesium Sulfate, Glycerin, Butylene Glycol, Sodium Hydroxyde, Simethicone, Xanthan Gum, Parfum, Phenoxyethanol, Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid, Alpha Isomethyl Ionone, Hydroxyisohexyl 3- Cyclohexene carboxaldehyde, Anise alcohol.