Studio del mosaicismo con analisi SNuPE – DHPLC

2.3.1 Purificazione enzimatica della reazione di PCR

La reazione di primer extension richiede la rimozione completa di tutti i primers presenti e di tutti i dNTPs che potrebbero interferire con la reazione. Per questo motivo si rende necessario un approccio di tipo enzimatico che prevede l’utilizzo di due enzimi: la fosfatasi alcalina di gamberetto (Shrimp Alkaline Phosphatase o SAP) e l’esonucleasi I (Exonuclease I o Exo I). Il primo enzima viene utilizzato al fine di idrolizzare i nucleotidi che non hanno partecipato alla reazione di PCR, trasformandoli in nucleosidi e liberando un fosfato; il secondo enzima idrolizza i primers rimasti in eccesso dalla reazione di PCR. 5 µL di prodotto di PCR da preparare per la reazione di primer extension sono stati trattati con 2 µL di ExoSAP-IT (Amersham Pharmacia), un buffer che contiene i due enzimi descritti in precedenza. Il protocollo per la purificazione viene eseguito su termociclatore:

•37° C per 15’Temperatura ottimale di azione dei due enzimi •80° C per 15’Temperatura necessaria per inattivare i due enzimi

Figura 2.3. Schema di funzionamento della purificazione enzimatica del prodotto di PCR.

2.3.2 Reazioni di Single Nucleotide Primer Extension (SnuPE)

Il prodotto di PCR purificato mediante la digestione enzimatica, viene sottoposto ad analisi SNuPE utilizzando un primer lungo 20 basi disegnato in modo da riconoscere la sequenza a monte (Primer Forward) o a valle (Primer Reverse) del sito che deve essere saggiato quantitativamente per i due alleli presenti. Nella reazione vengono forniti solamente i due ddNTPs complementari ai due alleli da studiare. L’estensione del primer viene effettuata grazie alla Thermo Sequenase DNA polimerasi (Amersham Pharmacia) che aggiunge al primer un singolo dideossinucleotide (mini-sequencing) che termina la reazione di polimerizzazione. La reazione SNuPE è stata preparata in un volume di 15 µL con il seguente protocollo (Tabella 2.9):

Tabella 2.9. Reagenti per la reazione di SNuPE

REAGENTE CONCENTRAZIONE VOLUME FINALE

PCR purificata 7 ul

2 ddNTPs 10mM 1ul

Sequencing Buffer 10X 1.5 ul

Primer (Forward o Reverse) 10pM/ul 1.5 ul

Thermo Sequenase 1U/ul 0,5 ul

H2O Fino a 15 ul

La reazione è stata effettuata su termociclatore con il seguente protocollo:

- Denaturazione iniziale 94° C per 2’ 94° C per 5”

- Mini-sequencing per 50 cicli 43° C per 5” 60° C per 5”

- Denaturazione finale 94° C per 30”
_{Trasferita subito in} ghiaccio

2.3.3 Analisi della reazione SNuPE mediante DHPLC

La discriminazione tra i due diversi alleli presenti nella reazione è stata ottenuta sfruttando le caratteristiche della colonna DNAsep (Transgenomic) alla temperatura completamente denaturante di 70°C (Hoogendoorn et al., 2000). I prodotti della SNuPE sono stati eluiti dalla colonna utilizzando un gradiente lineare di Aceto Nitrile in un buffer 0.1M di TEAA a pH 7.0, ad un flusso costante di 0.9 ml al minuto. Il gradiente della durata di 10’ è stato ottenuto miscelando il Buffer A con una percentuale di Buffer B crescente dal 18% al 38% come mostrato nella tabella 2.10:

Tabella 2.10. Gradiente DHPLC utilizzato per la reazione SNuPE

Tempo in minuti % Buffer A % Buffer B Flusso (ml/min)

0 87 13 0,9 0,1 82 18 0,9 10,1 62 38 0,9 10,2 0 100 0,9 10,7 0 100 0,9 10,8 87 13 0,9 12,8 87 13 0,9

2.3.4 Clonaggio dei prodotti di PCR ottenuti da DNA genomico derivato da sangue periferico del paziente 1

Nel paziente 1, gli elettroferogrammi delle sequenze forward e reverse dell’esone contenente l’inserzione nucleotidica mostravano una sequenza dell’allele mutato molto bassa in intensità di fluorescenza e quindi risultavano difficili da interpretare. Lo stesso prodotto di PCR utilizzato per le reazioni di sequenza è stato dosato mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% confrontando la taglia con quella di uno standard di peso molecolare a concentrazione nota (Low mass, Invitrogen). La quantità di prodotto di PCR da utilizzare nella reazione di ligazione è stata calcolata seguendo le specifiche fornite dalla ditta fornitrice del vettore di clonaggio pGEM-T-Easy vector (Promega, Madison, WI, USA).

50ng di vettore X Taglia inserto

__________________________ X 3 = ηg di inserto

3.0kb (Taglia vettore)

La quantità di prodotto di PCR così calcolata è stata quindi sub-clonata nel vettore di clonaggio pGEM-T-Easy vector (Promega, Madison, WI, USA) effettuando la reazione di ligazione che utilizza i reagenti riportati in tabella 2.11.

Tabella 2.11 Reagenti per la reazione di ligazione

REAGENTE REAZIONE STANDARD CONTROLLO POS CONTROLLO NEG

Prodotto di PCR X ul* - -

2X Rapid Ligation Buffer 5 ul 5 ul 5 ul

pGEM-T Easy Vector (50ng) 1 ul 1 ul 1 ul

Inserto di DNA controllo - 2 ul -

T4 DNA Ligasi (3Weiss units/ul) 1 ul 1 ul 1 ul

H2O Fino a 10 ul Fino a 10 ul Fino a 10 ul

( X=quantita' di prodotto di PCR precedentemente calcolato )

Successivamente 2 µL di prodotto di ligazione sono stati mescolati con 50 µL di cellule E. Coli DH5α competenti e tenute in ghiaccio per 20'. E' stato quindi effettuato uno shock termico immergendo le cellule a 42°C per 45'' e un successivamente in ghiaccio. Dopo aver aggiunto 950 µL di terrreno LB (1 L contiene 10g di Bacto- tryptone, 5g di Bacto-yest extract e 5g di NaCl), la coltura batterica è stata fatta crescere a 37°C per 1,5 ore mantenendola ad una agitazione di 150 rpm. Le cellule transfettate sono fatte crescere su piastre contenenti LB e Ampicillina (100ug/mL). Al fine di definire con maggior accuratezza la mutazione e di quantificare l'allele mutato, sono state prelevate circa 150 colonie batteriche e sono state fatte crescere in 100 µL di terreno LB per 30 minuti a 37°C. Successivamente è stata effettuata una lisi di due microlitri di terreno di crescita batterica mediante riscaldamento a 98°C per 10 minuti (Colosimo et al., 2003). Il prodotto di tale lisi è stato utilizzato per effettuare una reazione di PCR da 25 cicli utilizzando una mix di 10 µL contenete dei primers interni all'inserto e disegnati per amplificare un frammento di 151bp ( Primers delle sequenze SP6 e T7). I cloni ricombinanti per la presenza del frammento di 151bp sono stati

analizzati su un gel di agarosio al 2% e sono stati identificati 96 cloni che contenevano l'inserto sub-clonato. Poiché la mutazione osservata nel paziente 1 non introduceva né rimuoveva un sito di taglio per un enzima di restrizione, abbiamo screenato i 96 prodotti di PCR con analisi di SNuPE. Ciascun prodotto di PCR è stato purificato con ExoSAP- IT (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) e successivamente analizzato mediante SNuPE come descritto precedentemente. Due esempi di cloni contenenti gli alleli mutati e normali sono riportati nella figura 3.4 (A e B).

2.4 Analisi molecolare mediante MLPA in pazienti con lissencefalia con gradiente