cerebellari prelevati da ratti neonati.
Lo studio in vitro è stato condotto, esponendo ai campi elettromagnetici ELF, colture primarie di granuli cerebellari ottenute dal cervelletto di ratti a otto giorni dalla nascita. Queste colture sono state mantenute in un incubatore per cellule, all’interno di un solenoide generante un campo elettromagnetico di frequenza 50 Hz
e intensità 1 mT , per un periodo che variava da tre giorni ad otto giorni. Durante questo intervallo di tempo ho eseguito una serie di esperimenti volti allo studio dell’eventuale maturazione e differenziamento indotti dai campi elettromagnetici ELF in queste cellule. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti confrontando granuli cerebellari esposti e non esposti.
PROTOCOLLO SPERIMENTALE IN VITRO
Ratti neonati
Incubazione in assenza Campi elettromagnetici
Colture di granuli
cerebellari
Prelevamento dei granuli
del cervelletto di ratti P8
Incubazione in presenza di Campi elettromagnetici (1mT, 50 Hz)
1.1 Test di eccitotossicità da glutammato.
Nelle colture neuronali, trattate con il glutammato alle opportune concentrazioni, il 90%-95% dei neuroni maturi vanno incontro a morte causata dall’effetto eccitossico dell’aminoacido. Infatti il glutammato attiva i canali ionotropici che aprendosi provocano una massiccia entrata di Ca2+ nella cellula con conseguenze tossiche per il neurone (Favaron et al, 1988; Choi, 1990, Schramm et al, 1990; Mercanti et al, 1992). Le colture di granuli cerebellari rispondono al test di eccitossicità da glutammato solo all’ottavo giorno dall’espianto, quando tutte le subunità dei recettori per il neurotrasmettitore sono presenti sulla membrana plasmatica sinaptica; tale risposta è un indice dell’avvenuta maturazione neuronale.
Come mostrato in figura 1.1 dopo cinque giorni di esposizione ai campi elettromagnetici (1 mT, 50 Hz) i granuli cerebellari mostrano una differente risposta al test di eccitotossicità da acido glutammico rispetto alle cellule non esposte. In particolare nelle cellule esposte e trattate con il glutammato alla concentrazione 100 µM (Glu+Exp) è presente una mortalità maggiore del 30% rispetto alla mortalità fisiologica rilevata nei campioni non esposti trattate con la stessa concentrazione di glutammato(Glu). Questo aumento della mortalità riscontrato nelle cellule esposte, è inibito se le stesse sono trattate con 10 µM di dizocilpine maleato (MK-801), un antagonista dei canali NMDA del glutammato, durante i cinque giorni di esposizione. La precoce risposta al test di eccitossicità dei granuli cerebellari che ho riscontrato dopo cinque giorni di esposizione ai campi elettromagnetici ELF, mi ha fatto supporre una precoce comparsa dei recettori del glutammato sulla membrana sinaptica.
Fig. 1.1 Test di eccitossicità da glutammato su granuli del cervelletto di ratto neonato dopo cinque giorni di esposizione ai campi elettromagnetici ELF.
1.2 Analisi dei canali del glutammato, mediante la tecnica del Patch
clamp
La tecnica del patch-clamp che permette lo studio delle correnti che passano attraverso i singoli canali ionici, consiste nel fare aderire la punta di una sottilissima pipetta di vetro ad una membrana cellulare; praticando poi una lieve aspirazione attraverso la pipetta è possibile ottenere una perfetta saldatura tra la micropipetta e la membrana in modo da isolare una piccola area della membrana stessa, in questo modo si può misurare la corrente attraverso i pochi canali contenuti nella zona selezionata (Fig 1.2).
Fig. 1.2 Schema esplicativo della tecnica del Patch clamp.
Mediante la tecnica del patch-clamp è stato possibile misurare le correnti ioniche dei canali del KAINATO sia su cellule esposte ai campi magnetici ELF sia su cellule non esposte. Quando veniva somministrato ai granuli cerebellari 200 µM di kainato per 2-10 secondi, si aveva un induzione delle correnti in tutti i neuroni testati. Queste correnti si mantenevano in presenza dell’esposizione dell’agonista e raggiungevano uno livello di plateau per poi decadere una volta rimosso il kainato. Il passaggio di corrente attraverso la membrana veniva completamente bloccato da una soluzione di 10 µM di CNQX, un antagonista competitivo dei recettori non-NMDA, indicando che la somministrazione del kainato attivava specificatamente i recettori non-NMDA.
Come illustrato in figura 1.3 l’esposizione per sei giorni ad un campo elettro- magnetico di 50 Hz e 1 mT induce un aumento delle correnti legate ai recettori del KAINATO significatamene più grande rispetto alle cellule non esposte. Questa differenza scompare a sette ed a otto giorni di esposizione, quando i granuli cerebellari raggiungono la loro maturazione fisiologica.
Fig.1.3 Analisi mediante patch-clamp delle correnti ioniche dei canali del kainato su granuli del cervelletto di ratto neonato dopo sei, sette e otto giorni di esposizione a campi elettromagnetici ELF.
1.3 Analisi dell’espressione dei recettori dell’acido glutammico
Mediante tecniche di RT-PCR e Western Blotting ho analizzato l’espressione dei recettori per l’acido glutammico sia a livello trascrizionale che traduzionale.
Come mostrato in figura 1.4 l’esposizione ai campi elettromagnetici delle colture di granuli cerebellari induce una precoce espressione delle diverse subunità dei recettori per l’acido glutammico. Infatti mentre nelle cellule non esposte è possibile mettere in evidenza una grande produzione di mRNA per queste subunità solo all’ottavo giorno dall’espianto, come risultato di una fisiologica maturazione, nelle cellule esposte si evidenzia la presenza di mRNA per le subunità NR1, GluR1, GluR2, GluR3 e GluR5 già a partire dal quarto giorno. L’mRNA del gene per la ß- Actina e l’rRNA per il gene 18S sono costitutivamente espressi per tutti i tempi considerati e rappresentano quindi il mio controllo interno.
Fig.1.4 Anali dell’espressione degli RNA messaggeri per le subunità dei recettori ionotropici del glutammato NR1, GluR1, GluR2, GluR3 e GluR5 mediante RT-PCR su granuli del cervelletto di ratto neonato, a vari giorni di maturazione.
Questi risultati sono stati poi confermati dall’analisi in Western Blotting per le stesse subunità recettoriali. In figura 1.5 si evidenzia infatti una precoce produzione delle proteine per le subunità NR1, GluR1, GluR2-3 e GluR5 dei recettori per il glutammato. Le cellule esposte ai campi ELF mostrano un incremento della presenza di proteine per queste subunità a partire dal quinto giorno di coltura, rispetto alle cellule di controllo. Le proteine estratte dalla linea cellulare PC12 sono state usate come controllo positivo.
Fig 1.5 Anali dell’espressione delle proteine per le subunità dei recettori ionotropici del glutammato NR1, GluR1, GluR2-3 e GluR5 mediante Western Blotting su granuli del cervelletto di ratto neonato a vari giorni di maturazione.
1.4 Analisi della distribuzione ed espressione dei neurofilamenti
(NF200)
I neurofilamenti sono i filamenti intermedi della cellula neuronale. Sono disposti, rispetto all’ assone, in fasci longitudinali di diametro medio di circa 10nm e uniti da legami crociati che conferiscono sostegno meccanico ed impediscono la rottura dell’assone stesso. Sono costituiti da lunghe proteine lineari a forma di bastoncello, suddivisibili in tre classi principali in base al loro peso molecolare, 68, 160 e 200 kDa.
Poiché i neurofilamenti rappresentano un indice del differenziamento neuronale, ho eseguito l’analisi dell’espressione dei neurofilamenti, in particolare degli NF200 (con peso molecolare di 200kD), mediante tecniche di immunoflorescenza indiretta e Western Blotting. La figura 1.6 mostra l’effetto dell’esposizione ai campi elettro-magnetici ELF, sulla distribuzione dei NF200 nei granuli cerebellari. Come si può notare dalla marcatura con l’anticorpo Anti-NF200, nelle cellule esposte per cinque giorni i neurofilamenti formano una rete molto più estesa rispetto alle cellule non esposte, inoltre sempre nelle celle esposte si evidenzia un incremento della percentuale di cellule positive alla marcatura che risulta simile alle cellule pienamente mature, in coltura da otto giorni (controllo positivo).
L’analisi in Western Blotting conferma gli stessi risultati, infatti la proteina NF200 risulta maggiormente espressa nelle cellule esposte sia per quattro che per cinque giorni rispetto alle stesse non esposte.
Fig.1.6 Analisi della distribuzione della rete di neurofilamenti mediante immunoflurescenza indiretta (A-D) e analisi dell’espressione della proteina NF200, mediante Western Blotting (E-F),su granuli del cervelletto di ratto neonato a vari giorni di maturazione.