Tecnica IFAT ( Immunofluorescence antibody test)

L’immunofluorescenza è una tecnica di laboratorio usata in quasi tutte le branche della biologia per ricerche per la diagnostica clinica; questa tecnica si basa sul lavoro pioneristico di Coons e Kaplan (Coons , et al. , 1941; Coons e Kaplan, 1950) e successivamente di Mary Osborne (Weber et al., 1975). Con questa tecnica è possibile rendere visibile una reazione antigene - anticorpo, marcando uno dei due con fluorocromi quali istiocianato di fluoresceina (FITC) o tetrametil rodamina istiocianato (TRITC). Il FITC è un composto giallo che può essere legato ad anticorpi senza alterare la loro reattività; quando irradiato da luce ultravioletta o celeste riemette una luce visibile verde chiaro. Il TRiTC emette una fluorescenza rossa. Questa tecnica è utilizzata sia per individuare un microrganismo patogeno da tessuti infetti sia complessi antigene-anticorpo . Viene utilizzata anche per rilevare anticorpi specifici dal siero di sangue,ma in questo caso l’antigene verso cui si cercano gli anticorpi viene fissato su vetrino e si procede con la tecnica indiretta. L’immunofluorescenza può essere diretta o indiretta;la prima è utilizzata per identificare la presenza degli antigeni, mentre l’altra è usata per la titolazione degli anticorpi o per la ricerca degli antigeni.

Figura 10. Immunofluorescenza diretta e indiretta (da Robinson ,immunohistochemical staining methods 2009, http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf ).

Immunofluorescenza diretta

Gli anticorpi diretti verso un antigene specifico sono marcati con un

fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato;

il vetrino viene lavato in PBS per eliminare gli anticorpi non legati. Il vetrino sarà osservato ad n microscopio a luce ultraviolet

antigene anticorpo ci sarà una fluorescenza brillante.

Figura 11. Immunofluorescenza diretta UTET, pag. 685)

Immunofluorescenza indiretta

È la tecnica utilizzata in questo lavoro,

incubato con un siero sospetto d’avere anticorpi per quell’antigene; lasciando solo anticorpi specifici legati agli antigeni.

solo dopo incubazione con antiglobul

non legate. La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione cres Questa tecnica, rispetto all’indiretta

può legare più antiglobuline marcate

antiglobuline specifiche per ogni classe di antico dell’anticorpo (Tizard, 2006).

munofluorescenza diretta

Gli anticorpi diretti verso un antigene specifico sono marcati con un fluorocromo e dopo aver fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato;

il vetrino viene lavato in PBS per eliminare gli anticorpi non legati. Il vetrino sarà osservato ad n microscopio a luce ultravioletta e dove c’è una reazione positiva,quindi c’è un legame tra antigene anticorpo ci sarà una fluorescenza brillante.

mmunofluorescenza diretta (da “Microbiologia e immunologia veterinaria

Immunofluorescenza indiretta

la tecnica utilizzata in questo lavoro, in cui un antigene presente in un campione viene incubato con un siero sospetto d’avere anticorpi per quell’antigene; il siero viene poi lavat

specifici legati agli antigeni. Il legame anticorpo-antigene è visualizzato solo dopo incubazione con antiglobuline marcate e dopo aver rimosso, mediante lavaggio

La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione cres

rispetto all’indiretta, ha due vantaggi cioè che ogni complesso antigene anticorpo egare più antiglobuline marcate e la brillantezza è molto più marcata.

antiglobuline specifiche per ogni classe di anticorpi si può determinare la classe specifica

40 fluorocromo e dopo aver fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato; successivamente il vetrino viene lavato in PBS per eliminare gli anticorpi non legati. Il vetrino sarà osservato ad n ta e dove c’è una reazione positiva,quindi c’è un legame tra

Microbiologia e immunologia veterinaria”, Giorgio Poli,

in cui un antigene presente in un campione viene il siero viene poi lavat o, antigene è visualizzato mediante lavaggio, quelle La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione crescente di siero. ha due vantaggi cioè che ogni complesso antigene anticorpo e la brillantezza è molto più marcata. Inoltre usando rpi si può determinare la classe specifica

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Figura 12. Immunofluorescenza indiretta (da “Microbiologia e immunologia veterinaria”,Giorgio Poli,UTET, pag. 685)

Principi di fluorescenza

Fosforescenza e fluorescenza sono 2 tipi di luminescenza. Quando molecole con proprietà luminescenti assorbono luce, emettono raggi luminosi a diverse lunghezze d’onda; nella fluorescenza l’emissione di luce è estremamente rapida mentre nella fosforescenza l’emissione continua per millisecondi o minuti, dopo che la fonte di energia è stata rimossa. Il materiale fluorescente emette luce per la struttura atomica; gli elettroni sono organizzati in diversi livelli intorno al nucleo dell’atomo ed ogni livello ha una predeterminata quantità d’energia. Quando un elettrone assorbe l’energia da un fotone di luce, diventa “eccitato” e salta al livello di energia superiore e meno stabile e tale stato non dura più di 10 secondi. L’energia è persa dall’elettrone sottoforma di calore ,mentre la restante come fotone. La fluorescenza emessa ha minor energia rispetto alla luce assorbita, così la lunghezza d’onda della luce emessa e maggiore rispetto alla luce che ha eccitato.

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Figura 13. Principio della fluorescenza (da Robinson ,immunohistochemical staining methods 2009, http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf)

Esiste un range di lunghezza d’onda che può eccitare gli elettroni del fluorocromo; la fluoresceina ,quando colpita da luce con lunghezza d’onda tra 450 nm e 520 nm emette fluorescenza; la lunghezza d’onda che da la maggior fluorescenza è 495nm ed è chiamata “excitation peak”. Anche la luce prodotta dai fluorocromi ha una lunghezza d’onda, che per la fluoresceina va da 490 nm a 630m e il picco d’emissione è 515 nm (Robinson et al., 2009).

Figura 14. Eccitazione e spettro d'emissione della fluoresceina. Quando la fluoresceina è eccitata a una lunghezza d'onda diversa dal picco la forma della curva dell'emissione resta la stessa(verde scuro),ma è ridotta l'intensità (da Robinson ,immunohistochemical staining methods 2009, http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf)

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