Per metodi colturali si intendono metodi che prevedono la coltivazione del microrganismo, spesso in combinazione con analisi fenotipiche (fisiologiche e biochimiche) e genotipiche (PCR specie- specifica) che permettono la corretta identificazione e tipizzazione delle specie studiate. I metodi colturali generalmente definiscono gruppi e/o generi e con minore probabilità la loro sensibilità arriva a descrivere correttamente la specie. Quindi l'isolamento delle colonie dalla piastra e la loro identificazione e tipizzazione biochimica e molecolare è necessaria per aumentare la sensibilità delle analisi (Giraffa, 2004; Jany et al., 2008; Nocker et al., 2007).
Le tecniche tradizionali per analizzare e studiare i microrganismi sono basate sulla coltivazione e l’isolamento su substrati selettivi e semi selettivi (Van Elsas et al., 1998).
La possibilità di coltivare microrganismi su terreni di coltura appropriati permette di studiare i tratti morfologici e metabolici delle colonie che si sviluppano, nonché la loro riproduzione e i tempi di crescita propri di quelle specie. Questo tipo di approccio risulta quindi molto utile, nonostante sia
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limitata la percentuale delle specie a cui è applicabile. Risulta quindi indispensabile ricorrere alle tecniche di isolamento in colture pure delle varie specie microbiche, in modo da poter analizzare le caratteristiche di ogni singola specie al di fuori del contesto ambientale da cui vengono prelevati e separatamente dalle altre specie presenti in quell’ambiente.
Uno dei metodi più utilizzati per ottenere questo tipo di coltura è quello della semina diretta su piastra di materiale contenente più specie microbiche e, solo in seguito alla crescita delle colonie, si procede con le fasi di isolamento. L’isolamento di specie microbiche da un campione ambientale può essere semplificato utilizzando in alcuni casi terreni di coltura selettivi, contenenti sostanze che inibiscono la crescita di specie sensibili ad esse e che eliminano tutte quelle specie che non sono l’organismo d’interesse. Possono essere utilizzati anche terreni differenziali o di identificazione che addizionati di sostanze che consentano una crescita differenziale in quanto metabolizzate solo da alcuni ceppi, che ne permettano quindi l’identificazione.
Una volta ottenute le colture pure si può procedere con i test biochimici che ci permettono di identificare velocemente alcune caratteristiche del ceppo, come ad esempio la colorazione di Gram (Halebian et al., 1981), il “test del KOH”, simile alla colorazione, che prevede l’utilizzo dell’ idrossido per il riconoscimento dei Gram-positivi e Gram-negativi (Ryu, 1940). Altri test come: il “test dell’ossidasi” e “della catalasi” per verificare la produzione degli enzimi Citoctromo Ossidasi e della Catalasi rispettivamente da parte dei ceppi esaminati. Inoltre è possibile condurre studi sulle dimensioni e la morfologia delle cellule e delle colonie.
Talvolta in ecosistemi microbici complessi la capacità di alcuni batteri con deficit metabolici può essere stimolata dalla presenza e dall'interazione con altri microrganismi che sono in grado di supplire a questi loro deficit (Nadkarni et al., 2009). Purtroppo, i terreni di coltura permettendo tipicamente la crescita solo di una piccola frazione di microrganismi e non sono in grado di riprodurre le nicchie ecologiche e le interazioni simbiotiche presenti in ambienti naturali complessi. Spesso permettono la crescita di alcune specie sopprimendo la crescita di altre per cui la composizione della comunità della frazione coltivabile è distorta. Infine, la maggior parte dei terreni di coltura sono fonti estremamente ricche di carbonio rispetto ai substrati che si ritrovano normalmente in situ, e questo potrebbe influenzare la composizione della comunità microbica coltivata verso copiotrofi, microorganismi che crescono in presenza di elevati livelli di fattori nutritivi (Nocker et al., 2007).
Alcune tecniche colturali permettono di ottenere informazioni sul fenotipo metabolico dei ceppi studiati.
Un approccio che permette di ottenete informazioni tassonomiche e saggiare sia la diversità metabolica di un ceppo è il sistema Biolog® (Haywood, California, USA). Il metodo si basa sull’utilizzo di micropiastre con 96 pozzetti contenenti differenti substrati carboniosi e un colorante, il violetto di tetrazolio (Smalla et al., 1998), utilizzato come indicatore redox per evidenziare l’ avvenuto utilizzo della fonte di carbonio. Ai pozzetti viene aggiunta una sospensione del
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microrganismo isolato. Un pozzetto contenente la sola sospensione viene considerato come controllo. Dalla riduzione dei sali di tetrazolio osservata misurando l’assorbanza allo spettrofotometro dopo un’incubazione di 24–48 ore, si riesce a stimare l’attività catabolica microbica in risposta a ciascun substrato. Confrontando il profilo ottenuto con quello delle specie in banca dati è possibile ottenere informazioni tassonomiche del microrganismo in esame. Il sistema Biolog da interessanti informazioni sul profilo metabolico permettendo di osservare come alcuni microrganismi abbiano competenze metaboliche comuni, mentre altre specie abbiano invece caratteristiche totalmente differenti. Le informazioni biochimiche che così si ottengono risulteranno utili per definire la componente metabolica dei ceppi non ancora identificati, ma non può rappresentare un’alternativa all’identificazione molecolare, ma piuttosto può essere un ulteriore prova da affiancare ai dati molecolari che verranno condotti. I dati ottenuti potrebbero essere analizzati in relazione a differenti parametri chimico-fisici come temperatura, salinità, nutrienti.
Il metodo purtroppo, presenta gli stessi limiti dei metodi colturali, in quanto permette di valutare l’attività dei microrganismi in grado di crescere alle condizioni di incubazione e in presenza di determinati substrati. Pertanto, i risultati ottenuti potrebbero non riflettere la reale diversità funzionale del microrganismo all’interno della comunità e nel suo habitat.
Simile al sistema Biolog è il sistema Api20 o Api100 (BioMerieux), tramite il quale viene identificata la diversità metabolica o la specie del microrganismo che si sta studiando (Bartelt-Ryser et al., 2005; Philips et al., 2012) utilizzando delle strisce (Api strips) contenenti fonti di carbonio differenti( 20 o 100) e se il microrganismo è in grado di ossidare la fonte di carbonio nella striscia, quest’ultima assumerà una determinata colorazione evidenziando l’attività del ceppo testato e dell’enzima coinvolto in questa ossidazione (Holmes et al., 1978). Sia il metodo Biolog che le strisce Api sono estremamente utili per lo studio della diversità metabolica microbica, soprattutto quando utilizzati come strumento di analisi complementare ad altri, come ad esempio i metodi molecolari (Barbieri et al., 2008). I dati ottenuti permetteranno di avere sia tassonomiche che metaboliche dei ceppi non ancora identificati. Ovviamente non possono da soli rappresentare un’alternativa all’identificazione molecolare, piuttosto possono essere un’ulteriore prova da affiancare ai dati molecolari.
Un’ulteriore tecnica d’indagine che permette di ottenere interessanti informazioni sugli isolati studiati è il matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI-TOF MS (Karas, 1988; Hillenkamp, 1991). La tecnica si basa sulla spettrometria di massa (MS) la quale è una tecnica analitica che viene impiegata per l’identificazione di composti incogniti, per determinazioni quantitative di composti noti e per chiarire le proprietà strutturali e chimiche delle molecole. Sebbene essa abbia trovato fin dagli inizi del secolo scorso un vasto impiego in diversi campi, la sua applicazione è stata estesa all’analisi di macromolecole biologiche solo alla fine degli anni ottanta quando vennero introdotti metodi di ionizzazione soft. Il MALDI-TOF MS è un veloce e accurato metodo per classificare ed identificare microrganismi e ottenere informazioni tassonomiche. Tale metodo consente di analizzare, con elevate
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sensibilità (dalle pico alle femto moli) analiti polari, poco volatili e termolabili come le macromolecole biologiche ad elevato peso molecolare (oltre 200 KDa), senza provocarne frammentazione in sorgente. La tecnica MALDI-TOF MS analizza simultaneamente ed in tempi rapidi miscele complesse di proteine o peptidi senza la necessità di una preventiva separazione. Per tale motivo, una delle principali applicazioni, riguarda l’identificazione di proteine a partire dall’analisi dei peptidi generati mediante digestione enzimatica (peptide mass fingerprinting). Recenti ed interessanti applicazioni di questa tecnologia riguardano l’analisi diretta di cellule intere. E’ possibile infatti analizzare cellule batteriche (Krishnamurthy, 1996; Krishnamurthy, 2000; Warscheid, 2004; English, 2003; Krishnamurthy, 1996), allo scopo di identificare i microrganismi sulla base del loro caratteristico profilo di espressione proteica. Il materiale di partenza può essere una singola colonia o una porzione di un centrifugato di cultura liquida. Lo strato sottile con i microorganismi viene coperto con una matrice e consentire misure in un range compreso fra 2.000 e 20.000 Da. Il MALDI-TOF offre un eccellente alternativa ai metodi tradizionali di identificazione di microrganismi e la velocità, robustezza e i costi minimi per la preparazione dei campioni e dell’effettuazione delle analisi fanno di questa tecnica un eccellente metodo sia nelle applicazioni di routine che nelle applicazioni su grandi numeri.
Numerosi sono gli studi in cui il MALDI-TOF è applicato per studiare batteri isolati da ambienti antartici e comprendere le loro caratteristiche fenotipiche e biologiche di adattamento (Solomon et al., 2003; Dieckmann et al., 2005; Nevot et al., 2006; Jagannadham et al., 2012; García-Descalzo et al., 2014).