3.4.1 Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (PCR)
La reazione di polimerizzazione a catena operata da una polimerasi (PCR) consente di amplificare specifici frammenti di DNA. Essa consiste in una serie di cicli identici, ciascuno caratterizzato da tre fasi a differente temperatura. Nella prima fase la doppia elica del DNA viene denaturata alla temperatura di 94°C; nella seconda fase gli inneschi oligonucleotidici vengono fatti appaiare al DNA a singolo filamento, ad una temperatura scelta in base al grado di omologia tra gli inneschi e il DNA stampo e alla composizione in basi degli inneschi stessi; nella terza fase l‟elica complementare di DNA viene sintetizzata a 72°C a partire dall‟innesco appaiato ad opera della Taq DNA polimerasi. Le tre fasi sono ripetute per numerosi cicli (20-30), per consentire l‟amplificazione specifica di una sequenza di DNA compresa tra i 2 inneschi di un fattore 2n, dove n indica il numero dei cicli. Per le reazioni di PCR è stato utilizzato un apparecchio ThermoHybaid/PCRexpress.
3.4.2 Elettroforesi su gel d'agarosio
Per l‟analisi del DNA sono stati preparati gel d'agarosio allo 0,8% in tampone TAE, a cui è stato aggiunto bromuro d'etidio (concentrazione finale 0,5 g/ml). Alla soluzione
59 di DNA da analizzare su gel è stato aggiunto un tampone di caricamento composto da: glicerolo 6%, blu di bromofenolo 0,02% per visualizzare bande di DNA ad alto peso molecolare o in alternativa xilene cianolo 0,02% per bande di basso peso molecolare, SDS 0,02% (concentrazioni finali). L'elettroforesi è stata condotta in tampone TAE, ad un voltaggio costante di circa 10 V/cm (per gel 5x7,5 cm) o 3 V/cm (per gel 15x20 cm).
3.4.3 Estrazione e purificazione di DNA da gel d'agarosio
I prodotti di amplificazione sono stati purificati dopo separazione elettroforetica su gel di agarosio all‟1%, utilizzando il Gel Extraction Kit (QIAgen) secondo il protocollo raccomandato dalla casa produttrice. Tale metodo sfrutta la capacità di particelle di silice di trattenere le molecole di DNA (Vogelstein & Gillespie, 1979). La resa poi di ciascuna reazione è stata stimata quantificando su gel d‟agarosio allo 0,8% per confronto con DNA standard a concentrazioni note.
3.4.4 Mini preparazione di DNA plasmidico ad elevata purezza
Singole colonie batteriche di E. coli sono state inoculate in 2 ml di terreno LB, contenente l‟antibiotico per la selezione; i vari inoculi sono stati quindi incubati a 37°C per 16 ore in agitazione a 250 rpm.
La sospensione batterica è stata centrifugata a 9.000 x g per 10 minuti, eliminando accuratamente il supernatante dopo la centrifugazione. In seguito il pellet batterico è stato trattato con il QIAprep Spin Miniprep Kit® (QIAagen) secondo il protocollo fornito dalla ditta. Per la purificazione del vettore pBI gli inoculi sono stati di 10 ml e il protocollo di purificazione del kit è stato modificato come indicato dalla casa produttrice.
La purezza e la concentrazione del DNA plasmidico estratto sono state determinate per elettroforesi su gel d‟agarosio, utilizzando DNA standard come riferimento.
60 3.4.5 Sequenze nucleotidiche
I campioni sono stati sequenziati utilizzando il servizio offerto dal C.R.I.B.I., presso l‟università di Padova, e l‟elaborazione delle sequenze è stata effettuata con i programmi Chromas 2.0.0.0 e DNAMAN 4.1.5.1.
3.4.6 Restrizioni
0,5-2 g di DNA sono digeriti con 1-2 unità di enzima di restrizione in un volume di reazione di 20 l, contenente il tampone specifico per l‟enzima utilizzato, per 2 ore alla temperatura indicata dalla casa produttrice.
3.4.7 Reazione di ligazione
Il DNA del vettore linearizzato ed il frammento del DNA da clonare sono stati mescolati in un rapporto molare 1:6. La razione è stata condotta in un volume di 10 l utilizzando 1U di T4 DNA ligasi (New England Biolabs) e incubando la reazione per 16 ore a 16°C.
3.4.8 Preparazione delle cellule elettro-competenti di E. coli e A. tumefaciens
Un pre-inoculo da una singola colonia in 50 ml di terreno 2xTY è stato fatto crescere a 37°C (E. coli) o 28°C (A. tumefaciens) in agitazione a 250 rpm per 16 ore. 5 ml della coltura batterica sono stati diluiti in 500 ml di terreno LB e nuovamente incubati per 3 ore in agitazione fino a OD600= 0,5-0,8, corrispondente alla fase esponenziale di crescita. Le colture sono state raffreddate in ghiaccio per 15 minuti quindi centrifugate 15‟ a 4.000 x g a 4°C in tubi pre-raffreddati. I batteri sono stati risospesi in 100 ml di una soluzione sterile fredda di H2Oup e nuovamente centrifugati a 4°C a 4.000 x g per altri 15 minuti. Il pellet batterico è stato poi risospeso per altre 2 volte in 100 ml di acqua come già descritto. Dopo l‟ultima centrifuga il pellet è stato risospeso in una soluzione sterile raffreddata a 4°C di glicerolo al 10% nuovamente centrifugato ed
61 infine risospeso in circa 1 ml di glicerolo freddo al 10% per aliquotare le cellule competenti e conservarle a -80°C.
3.4.8 Trasformazione per elettroporazione
1,5 l di reazione di ligazione vengono aggiunti ad una aliquota da 50 l di cellule competenti scongelate dal -80°C e mantenute su ghiaccio. Le cellule sono poste all‟interno di cuvette da elettroporazione raffreddate con elettrodi distanti 0,2 cm.
L‟impulso per la trasformazione, della durata di 4-5 ms, è stato applicato utilizzando l‟apparato Gene-Pulser®
(Bio-Rad) impostato secondo i seguenti parametri: 960 F, 2,5 KVolts, 200 Ohms.
Le cellule elettroporate sono state successivamente recuperate dalla cuvetta con 1 ml di terreno LB e mantenute a temperatura ottimale di crescita del batterio per 30 minuti prima di essere piastrate su terreno solido selettivo.
3.4.9 Analisi dei ricombinanti batterici mediante PCR su colonia
Per individuare rapidamente le colonie di E. coli o A. tumefaciens trasformate con i vettori ricombinanti, è stata sfruttata la tecnica di PCR applicata direttamente alle cellule batteriche (Sandhu et al., 1989).
Per ciascun campione è stata preparata una miscela contenente i seguenti componenti: 2 l di tampone di reazione 10X, 0,6 l MgCl2 25 mM (BIOLINE), dNTPs fino ad una concentrazione finale 200 M ciascuno, 10 pmoli di innesco senso e altrettanti di innesco anti-senso, 1 U di polimerasi BIOTAQ™ DNA Polymerase (BIOLINE), H2O deionizzata sterile fino ad un volume di 20 l. Le cellule, raccolte con punta sterile da una singola colonia cresciuta su terreno solido, sono state risospese nella miscela di reazione, che è stata quindi riscaldata in termociclatore ThermoHybaid® a 95°C per 5‟ per facilitare la rottura della parete batterica.
62 3.5 CLONAGGI
3.5.1 Trascrizione inversa ed amplificazione del cDNA (RT-PCR)
1 x 106 cellule di ibridoma murino esprimenti anticorpi monoclonali sono state utilizzate come materiale di partenza per la purificazione dell‟RNA totale utilizzando l‟ “Rneasy Plant mini Kit” della QIAGEN seguendo le istruzioni fornite dalla casa produttrice.
Per l‟amplificazione delle sequenze codificanti le catene leggere e pesanti degli anticorpi monoclonali sono stati usati l‟enzima SuperScript II (RT) dell‟Invitrogen per la retro trascrizione dell‟mRNA totale alle condizioni indicate dalla ditta produttrice.
Per ogni campione è stata preparata una miscela di reazione così composta: 2-3 g di RNA
500 M dNTPs 0,8 M oligo dT
H2O DEPC fino a 13 l
La mix di reazione è stata incubata per 5 minuti a 65°C e poi raffreddata in ghiaccio per 1 minuto prima di aggiungere altri 7 l a campione della seguente mix:
tampone di reazione (5X) 10 mM DTT
40U inibitori di RNasi 200U SuperScript II
La reazione è stata incubata per 1 ora a 42°C per l‟amplificazione delle sequenze codificanti le catene leggere. Per l‟amplificazione delle sequenze codificanti le catene pesanti invece, siccome nelle mix di reazione al posto dell‟oligo dT è stato utilizzato l‟oligonucleotide specifico IgGCH3, la temperatura di reazione è stata aumentata a 55°C. L‟allungamento finale è stato effettuato a 72°C per 15 minuti.
63 3.5.2 Disegno degli oligonucleotidi per l’amplificazione da cDNA dei diversi
costrutti
Gli oligonucleotidi che sono stati disegnati ed utilizzati per l‟amplificazione delle sequenze codificanti per la catena pesante e la catena leggera delle immunoglobuline sono riportati nella tabella 2.
Tabella 2. Oligonucleotidi utilizzati per l‟amplificazione delle sequenze codificanti le catene leggere e pesanti da cDNA.
Oligonucleotide Sequenza
VLambda CAG GCT GTT GTG ACT CAG G CLambda 1 CTA GAG ACA TTC TGC AGG AGA C CLambda 2 CTA GGA ACA STC AGC ACG GGA C IgG1CH1 ATA GAC AGA TGG GGG TGT CG
IgG1CH3 CCG GAG CTC TCA TTT ACC AGG AGA GTG GG MH1 SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC
MH2 SAG GTN MAG CTG SWS SAG YCW GG