Numerosi studi hanno suggerito un ruolo sia pro-apoptotico che anti-apoptotico per le JNKs. I primi risultati indicavano che il distacco dalla matrice delle cellule epiteliali induceva in modo forte e rapido l’attivazione delle JNKs, che potrebbero contribuire all’anoikis. [181] Studi successivi hanno supportato un ruolo pro-apoptotico sulla base dell’osservazione che fibroblasti di embrione di topo mancanti di JNK 1 e 2 erano resistenti all’apoptosi indotta da UV, anisomicina e danno al DNA. [182] Questi effetti erano legati al fallimento nel rilascio del citocromo c dal mitocondrio o nell’attivazione di Bid. È importante sottolineare che il processo di anoikis coinvolge anche il rilascio del citocromo c. [183]
Al contrario, Almeida e collaboratori hanno osservato che in fibroblasti serum-starved le JNKs venivano attivate in risposta all’adesione ad una matrice di fibronectina e non al distacco da questa. [184] In questi esperimenti l’attivazione di JNK veniva stimolata dalla cotransfezione di FAK che era accompagnata da un aumento della sopravvivenza. Quindi fu proposto un pathway di sopravvivenza a partire dalle integrine, attraverso FAK, fino a JNK. Alcuni risultati, infatti,
fibroblasti: cellule aderenti 3T3 mostrano un picco nell’attività delle JNKs in fase G1 del ciclo cellulare e la transfezione di un dominante negativo MKK4, che funge da regolatore positivo a monte dell’attività delle JNKs, causa l’arresto della crescita in fase G1 delle cellule 3T3. [185] In questo studio, l’attività di JNK veniva stimolata sia dall’adesione alla matrice (in cellule HUVEC, 3T3 e 293) sia da FAK (in cellule 293).
Chiaramente la regolazione di JNK è molto differente nei fibroblasti rispetto alle cellule epiteliali: nei fibroblasti, ma non nelle cellule epiteliali, ras stimola l’attività di JNK e la progressione del ciclo cellulare è inibita dal dominante negativo MKK4. Infatti l’anoikis sembra agire attraverso meccanismi differenti nei due tipi cellulari, poiché i fibroblasti devono essere privati dei fattori di crescita per rispondere al distacco dalla matrice. [137] Questo potrebbe riflettere le diverse circostanze nelle quali i fibroblasti e le cellule epiteliali devono trovarsi per andare incontro ad anoikis in vivo.
1.6.4 - Il citoscheletro
Le differenze evidenti tra le strutture citoscheletriche delle cellule adese rispetto a quelle sospese suggeriscono che il segnale di sopravvivenza nell’anoikis potrebbe essere largamente regolato dal citoscheletro. Esistono ormai evidenze certe che le molecole di segnalazione ed i regolatori dell’apoptosi siano associati al citoscheletro e quindi potrebbero insieme regolare l’anoikis agendo da sensori dell’integrità citosceletrica. [137]
Ci sono numerosi collegamenti tra il citoscheletro ed il pathway di JNK. Primo, MKK4/SEK1 interagisce direttamente con la proteina citoscheletrica integrina-associata ABP280/filamina. [186] Cellule di melanoma mancanti di filamina sono refrattarie alla stimolazione di JNK ed il ripristino della filamina ripristina l’attività di JNK. Inoltre, la filamina è substrato delle capasi ed il clivaggio della filamina potrebbe avere un ruolo nella regolazione delle JNKs. [187] Secondo, le JNKs potrebbero controllare il riarrangiamento citoscheletrico associandosi direttamente con la p150Spir, un membro della famiglia dei WASP (effettori delle rho-like GTPases che regolano il citoscheletro actinico). [188] In esperimenti di transfezione, le due molecole collaborano nel causare riarrangiamenti citoscheletrici. Terzo, MLK2, una MAP Kinase Kinase Kinase che attiva JNK, è co-localizzato con JNK lungo i microtubuli ed associata con KIF3. [189]
Un’altra connessione con il citoscheletro coinvolge Bim e Bmf, due proteine pro-apoptotiche della famiglia della Bcl-2. [190, 191, 192] Bim normalmente sembra essere sequestrata da DLC1
distruggere i microtubuli, Bim viene rilasciato ed interagisce direttamente con Bcl-2 e stimola il rilascio del citocromo c dal mitocondrio. Bmf è sequestrato da DLC2 (actin/miosin-associated dynein light chain 2) in cellule MCF7. La sospensione cellulare, il trattamento con cytochalasin e l’irradiazione UV possono indurre il rilascio di Bmf che può così legare Bcl-2. Il rilascio di Bim e Bmf è indipendente dall’attività caspasica, quindi queste proteine potrebbero regolare direttamente le fasi iniziali dell’apoptosi e dell’anoikis agendo da sensori dell’integrità del citoscheletro.
È interessante notare che fibroblasti isolati da topi cheratina-8-/- sono circa 100 volte più sensibili
alla morte indotta da TNF (tumor necrosis factor) rispetto alle cellule normali; in questo risultato sembra essere implicato un legame tra il recettore 2 di TNF e le citocheratine. [193]
Un’ultima connessione è quella con la plectina citoscheletrica, una proteina che forma legami con i microtubuli, i filamenti intermedi e l’actina. La maggior parte della pro-caspasi-8 è stata trovata associata con i mitocondri in cellule MCF7 non stimolate. La stimolazione dell’apoptosi da parte del ligando di FAS causava immediatamente la processazione della pro-caspasi-8 mitocondriale e successivamente la sub-unità attiva dell’enzima veniva traslocata e clivava la plectina. Inoltre, fibroblasti da embrioni di topo mancante di plectina mostravano un’attenuata riorganizzazione citoscheletrica in seguito a trattamento con ligando di FAS, indicando la degradazione della plectina come evento spartiacque. [194]
È stato dimostrato che la GTPase rac-1, la cui più importante funzione è il controllo del citoscheletro, conferisce resistenza all’anoikis nelle cellule MDCK. [195] La completa inibizione dell’attività della PI3K cellulare ripristina la sensibilità nelle cellule MDCK, suggerendo che rac protegge le cellule tramite l’attivazione del pthway PI3K/Akt. Non si possono però escludere altri effetti di rac sul citoscheletro. È noto che sia rac che cdc42 segnalano attraverso PAK ed è stato dimostrato che sono regolate dalla proteina chinasi A cAMP-dipendente (PKA) [196]. In cellule 3T3, il distacco dalla matrice attiva transitoriamente PKA. PKA attivato potrebbe fosforilare ed inattivare PAK, prevenendo la risposta delle MAPKs alla stimolazione da parte dei fattori di crescita. È interessante sottolineare che PKA è associata con la proteina citoscheletrica actinica ezrin [197], suggerendo una possibile integrazione tra il citoscheletro ed i sistemi del metabolismo e della morte cellulare.