Terreno e reagenti per la crescita della linea cellulare RTG-2

4.4.1 Caratteristiche generali dei terreni per colture cellulari

La possibilità di coltivare le cellule in vitro dipende dal terreno di coltura che è una miscela di diverse sostanze, responsabili del mantenimento delle caratteristiche chimico-fisiche del terreno stesso.

La composizione dei terreni di coltura è estremamente variabile, tuttavia le principali sostanze contenute nel terreno base sono le seguenti:

Aminoacidi. Nei terreni più semplici sono presenti solo gli AA essenziali, mentre nei terreni com-plessi vengono aggiunti anche AA non essenziali, richiesti dal tipo di cellula in coltura. La glutam-mina è un AA essenziale per molti tipi di cellule, sia come fonte di energia, che di carbonio. E’ ag-giunta al terreno, tenendo presente che a temperature > 10°C ha una vita media di circa 1 mese. Vitamine. Un terreno semplice come il MEM contiene solo le vitamine del gruppo B. L’aggiunta di altre vitamine si rende necessaria soprattutto quando vengono impiegate basse concentrazioni di siero.

Sali. La pressione osmotica ottimale varia nelle diverse linee cellulari, a seconda della specie d’ori-gine, ma risulta, in genere, compresa tra 260 e 320 mOsm/Kg. La corretta pressione osmotica si ottiene con un’adeguata concentrazione di una BSS. Una BSS è composta di sali inorganici e può includere bicarbonato di sodio e, a volte, glucosio. In tabella 23 è mostrata la composizione

delle BSS più utilizzate. Il sodio (Na⁺) regola il movimento dell’acqua dentro e fuori le cellule.

Si trova con il suo anione Cl^-. La pressione osmotica esercitata sulla membrana plasmatica

di-pende dalla concentrazione di NaCl. Il potassio (K⁺) è essenziale per il funzionamento di molti

enzimi, è cofattore nella sintesi proteica ed è parte dell’ATPasi Na⁺-K⁺dipendente. Il calcio (Ca⁺⁺)

influisce sulla capacità delle cellule di aderire al substrato. Il magnesio (Mg⁺⁺) è cofattore delle

reazioni enzimatiche e serve a garantire l’integrità dei ribosomi. Il bicarbonato di sodio, intera-gendo con l’anidride carbonica atmosferica, svolge un ruolo molto importante come sistema tam-pone. Le BSS si dividono in due gruppi: 1) le BSS che si equilibrano con la pressione atmosfe-rica in un sistema chiuso, come i sali di Hanks che contengono poco bicarbonato di sodio; 2) le

BSS che si equilibrano in fase gassosa (con pCO₂5%), come i sali di Earle.

Glucosio. Costituisce la fonte di energia.

Soluzioni tampone. Per aumentare le capacità tamponanti delle BSS, il terreno può contenere anche una soluzione tampone. L’agente più comunemente usato è il bicarbonato di sodio. Un’altra so-stanza tampone è l’HEPES (N-2-hydroxyethilpiperazine-N-2-Ethansulfonic acid) che si comporta in modo anfotero e quindi non necessita di un’atmosfera arricchita per mantenere il pH costante. Minerali. Quando viene impiegato un terreno povero di siero, è necessaria l’aggiunta di ferro, rame, zinco e selenio.

Supplementi organici. Quando viene impiegato un terreno povero di siero, è necessaria l’ag-giunta di nucleosidi, piruvati e lipidi.

Ormoni. Vengono aggiunti solo nei terreni privi di siero.

4.4.2 Ricostituzione del terreno di base in polvere

Per preparare 1 L di terreno MEM (formulazione, paragr. 4.2.5) partendo dalla polvere (1 X), procedere come segue:

Tab. 23 – Soluzioni saline bilanciate

2. Sciogliere la polvere, in un matraccio da 1 L, con l’acqua ultrapura sterilizzata. Procedere aggiungendo la polvere e l’acqua poco alla volta (in modo che non si formino grumi), solu-bilizzando bene tramite agitazione manuale (o con agitatore magnetico). Portare a volume. 3. Quando la soluzione è limpida, filtrare il terreno con la pompa peristaltica, sotto cappa bio-logica, utilizzando un filtro Sterivex-GV e bottiglie in vetro sterilizzate in autoclave (121°C, 20 minuti).

4. Conservare il terreno in frigo (4 °C), fino al momento dell’uso. 4.4.3 Preparazione dei supplementi per il terreno di crescita

Il terreno di base MEM ricostituito come al paragrafo precedente, deve essere addizionato con

siero FBS al 10%, e P/S 50 UI/ml-50 μg/ml, prima di poter essere utilizzato per la crescita delle

cellule RTG-2. 4.4.3.1 Il siero

Il siero FBS viene conservato a -20°C. Scongelarlo, prima di aggiungerlo al terreno, lascian-dolo a temperatura ambiente o in bagno termostatato alla temperatura di crescita delle cellule (20 ± 2°C) per il tempo necessario (circa 1 ora). Quando si acquistano confezioni da 500 ml di FBS, è possibile scongelarlo, aliquotarlo nel modo più conveniente per le proprie esigenze e ri-congelare le varie aliquote fino al momento dell’uso.

4.4.3.2 Antibiotici

Allo scopo di prevenire le contaminazioni batteriche, è opportuno addizionare il terreno di col-tura con antibiotici. Nel caso delle colture di RTG-2, si puo’ utilizzare

penicillina-streptomi-cina 50 UI/ml-50μg/ml:

Preparazione a partire da soluzione P/S 5000UI-5 mg/ml (Sigma P4458):

- Porre in una bottiglia sterile, 445 ml di acqua ultrapura e sterilizzare in autoclave (121°C per 20 min.).

- Far raffreddare l’acqua.

Componenti Sali di Earle Dulbecco PBS

senza Ca²⁺ e Mg²⁺ Dulbecco PBS con Ca²⁺ e Mg²⁺ Sali di Hanks g/L g/L g/L g/L CaCl₂ 0,02 0,2 0,14 KCl 0,4 0,2 0,2 0,4 KH2PO4 - 0,2 0,2 0,06 MgCl₂ · 6H₂O - - - 0,1 MgSO4 · 7H2O 0,2 - 0,98 0,1 NaCl 6,68 8 8 8 NaHCO₃ 2,2 - - 0,35 Na2HPO4 · 7H2O - 2,2 2,16 0,09 NaH2PO4 · H2O 0,14 - -D-glucoso 1 - 1 1 0 , 0 -1 0 , 0 o l o n e f o s s o R

Fase gassosa 5% - Atmosfera

normale

Atmosfera normale

- Aggiungere all’acqua 5 ml di soluzione P/S 5000UI-5 mg/ml (Sigma P4458), e miscelare. - Conservare in provette sterili, aliquote da 5 ml, a -20°C fino al momento dell’uso.

4.4.4 Preparazione del terreno di crescita, per uso

Per preparare 500 ml di terreno completo per la crescita delle cellule RTG-2, procedere come segue:

1. Prendere: terreno MEM di base ricostituito (come al punto 4.4.2), siero FBS e antibiotici P/S.

2. Porli in un bagno termostatato alla temperatura di 20 ± 2 °C per almeno 30 minuti (fino a che il siero e gli antibiotici non si sono scongelati).

3. Porre sotto cappa una bottiglia in vetro sterile da 500 ml.

4. Portare sotto cappa il terreno MEM di base, il siero e gli antibiotici, dopo aver pulito la su-perficie esterna dei contenitori con alcool etilico al 70%.

5. Inserire nella bottiglia in vetro da 500 ml (utilizzando per ogni sostanza una pipetta diversa) nell’ordine:

Terreno MEM di base ricostituito (come al punto 4.4.2) 445 ml

Siero FBS (10%) 50 ml

P/S 50 UI/ml-50 μg/ml 5 ml

6. Conservare il terreno di crescita per uso in frigo (4 °C).

Il terreno di crescita va sempre portato alla stessa temperatura di crescita delle cellule, quindi prima dell’uso riscaldarlo a 20 ± 2 °C, utilizzando un bagno termostatato.

4.4.5 Tripsina

La tripsina è un enzima proteolitico derivato dal pancreas dei bovini o dei suini, che taglia le proteine in corrispondenza del gruppo carbossilico degli amminoacidi basici, lisina e arginina. E’ l’enzima più frequentemente impiegato per il distacco rapido delle cellule dal substrato, perché è ben tollerato e viene facilmente neutralizzato con il siero.

Può essere utilizzata da sola alla concentrazione di 0,25%, oppure in soluzione con EDTA (che rimuove gli ioni calcio e magnesio dalla superficie cellulare, facilitando l’azione della tripsina). Viene conservata a -20°C. Deve essere scongelata prima dell’uso e conservata in frigo a 4°C per un massimo di 3 settimane (Freshney, 2005).

Prima dell’uso con le cellule RTG-2 deve essere portata alla temperatura di 20 ± 2 °C. Va la-sciata fuori dal frigorifero, per il tempo strettamente necessario alle operazioni di distacco e co-munque non oltre 30 minuti, altrimenti si disattiva (Freshney, 2005).

4.4.6 D-PBS

La soluzione Dulbecco Posphate Buffered Saline, chiamata per brevità PBS, è una

solu-zione tampone da utilizzare nella formulasolu-zione senza Ca²⁺ e Mg²⁺. Essa viene

prevalen-temente impiegata per lavare il monostrato cellulare, prima del distacco enzimatico con trip-sina. Può essere acquistata in forma liquida e sterile (Sigma 8537), o può essere preparata in laboratorio.

Preparazione di PBS (per 1 L):

*I tappi delle fiasche devono essere avvitati completamente. Se si utilizzano fiasche con tappo ventilato, coprire con parafilm.

KCl 0.2 g

KH₂PO 0.2 g

NaCl 8.0 g

NaHPO₄(anidro) 1.15 g (oppure NaHPO₄·2 H₂O 1.8 g)

- Sterilizzare in autoclave (121 °C, 20 min).

La soluzione PBS può essere conservata in frigo a 4°C.

Deve essere portata alla temperatura di 20 ± 2 °C prima dell’uso con le cellule RTG-2.