Test Microtox© : Test di inibizione della bioluminescenza naturale d

Aliivibrio fischeri

3.3.1 Generalità

Il sistema Microtox® è un test biologico di tossicità acuta basato sull’utilizzo della bioluminescenza naturale di A. fischeri. Poiché in presenza di contaminanti

l’emissione di luce da parte di A. fischeri diminuisce, la misura dell’eventuale inibizione della bioluminescenza a seguito dell’esposizione del batterio ad una

sostanza nota o ad un campione naturale di acqua o sedimento, consente di valutare il grado di tossicità della sostanza o della matrice testata. Il test è un metodo acuto standard ISO (ISO 11348) ed assume particolare rilievo in quanto consente di prendere in considerazione i possibili effetti tossici esercitati dai formulati nei confronti della comunità acquatica microbica, una componente chiave della fauna acquatica; la sua inclusione nella batteria di saggi utilizzata per valutare la tossicità dei formulati prodotti in ambito NANORESTART rappresenta un valore aggiunto rispetto a quanto richiesto dal regolamento CLP, che non contempla la valutazione degli effetti nei confronti della comunità microbica.

3.3.2 La specie test

A. fischeri (famiglia delle Vibrionaceae) è un batterio flagellato marino Gram-

negativo con una forma bastoncellare molto diffuso nell’ambiente marino. Esso è un cosmopolita, ma con maggior diffusione nelle fasce temperate e subtropicali. La sua bioluminescenza è determinata dalla trascrizione dell’operone Lux.

3.3.3 Esecuzione del test

In accordo con l’ISO 11348 questa tipologia di test può essere effettuata usando un preparato “fresco” di batteri o preparazioni di batteri liofilizzati. Nella

sperimentazione all’interno del progetto di NANORESTART si è usufruito dei batteri liofilizzati forniti dal rivenditore esclusivo per l'Italia dei prodotti Microtox(r) (ECOTOX LDS, Cornaredo, Milano). Per l'esecuzione del saggio sono stati inoltre utilizzati il luminometro Microtox M500 (che mantiene i campioni a 15°C ed esegue le letture della bioluminescenza) ed il software di gestione MicrotoxOMNI che guida l'operatore in tutti i passaggi previsti dal protocollo e nel calcolo dell'EC50.

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La procedura di saggio inizia con la riattivazione dei batteri, che avviene secondo la seguente modalità:

 inoculo di 1 mL di soluzione ricostituente (soluzione di NaCl al 20%) in una cuvetta specifica per l'esecuzione del test Microtox e incubazione della stessa a 4°C per circa 15 minuti, utilizzando l'apposito pozzetto presente nel

luminometro M500;

 travaso della soluzione ricostituente refrigerata a 4°C nella fiala contenente i batteri liofilizzati;

 sciogliere i batteri con una lenta rotazione, quindi riversare il contenuto della fiala nuovamente nella cuvetta posta a 4°C;

 lasciare riposare per 20-30 minuti prima dell’utilizzo; Una volta ricostituiti, i batteri devono essere utilizzati entro 24 ore.

Per l'analisi dei campioni, si è effettuato dapprima uno "screening test" ad una concentrazione di 1000 mg l-1_{; successivamente, in base alla risposta, si è}

eventualmente effettuato un "basic test" su una serie di concentrazioni ristrette, al fine di calcolare l'EC50 in modo accurato.

Entrambi questi test sono gestiti da templates presenti nel software MicrotoxOMNI che guida l'operatore in tutte le fasi di preparazione del campione e di lettura dei risultati.

3.3.4 Screening test

Il test è stato eseguito con 1 controllo (soluzione al 20% di NaCl) e 1 replica del campione, utilizzando i pozzetti posti nella fila A e nella fila B dell'analizzatore M500, ed il pozzetto F3 per la diluizione dei batteri.

Per il test si procede come segue:

 posizionare le cuvette nei pozzetti da A1,A2,B1,B2 ed in F3;  aggiungere nel pozzetto F3 1500 μL di diluente;

 aggiungere nel pozzetto A1 1000 μL diluente;

 aggiungere nel pozzetto A2 2500 μL di campione e 250 μL di acqua di mare ricostituita e scartare 750 μL di soluzione (concentrazione iniziale 91%);  attendere 5 minuti;

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 trasferire quindi 150 μL di reagente batterico nel pozzetto F3 e mescolare;  attendere 15 minuti entro i quali aggiungere 100 μL dei batteri diluiti del

pozzetto F3 nei pozzetti da B1 a B2;

 al termine dei 15 minuti inserire la cuvetta B1 nel pozzetto di lettura ed eseguire il set-up dello strumento (tasto SET);

 eseguire quindi le letture delle I0(intensità luminosa iniziale) dei pozzetti da B1 e B2;

 trasferire quindi 900 μL del controllo e del campione da A1 e A2 a B1 e B2 (raggiungendo una concentrazione finale pari al 90% della concentrazione iniziale di prodotto saggiato);

 premere quindi la barra spaziatrice ed attendere il suono del timer precedentemente impostato (5, 15 o 30 minuti) ed eseguire le letture nei tempi reimpostati.

I risultati vengono espressi come % di effetto (I%) data dalla seguente relazione:

𝐼(%) = 100 ∙ (𝐼𝑏− 𝐼_𝑐 𝐼𝑏

) dove:

Ic= emissione luminosa del campione

Ib= emissione luminosa del bianco di controllo

Qualora la % di effetto ottenuta sia stata superiore al 50%, si è proceduto all'esecuzione del "Basic test".

3.3.5 Basic test

Il test è stato eseguito con 1 replica utilizzando 1 controllo e 9 diluizioni, utilizzando i pozzetti A1, B1 per il controllo,da A2 a D4 per il campione, ed il pozzetto F3 per la diluizione dei batteri.

Per la diluizione dei campioni e l'esecuzione del saggio si è proceduto come segue:  distribuzione delle cuvette Microtox nei pozzetti da A1 a D4 ed in F3;  aggiunta di1500 μL di diluente nel pozzetto F3;

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 aggiunta di 2500 μL di campione e 250 μL di acqua di mare sintetica nel pozzetto C5, e scarto di 750 μL di soluzione;

 esecuzione di diluizioni seriali 1:2 trasferendo 1000 μl di campione a partire dal pozzetto C5 al pozzetto C4, dal pozzetto C4 al pozzetto C3 e così via fino ad arrivare al pozzetto A2, dove vengono scartati 1000 μL di campione in eccesso;

 attesa di 5 minuti per la stabilizzazione del campione e contemporaneo trasferimento di 150 μL dei batteri precedentemente ricostituiti nel pozzetto F3;

 attesa di 15 minuti, durante i quali sono stati aggiunti 100 μL dei batteri diluiti dal pozzetto F3 nei pozzetti da B1 a B5 e da D1 a D5;

 al termine dei 15 minuti inserimento della cuvetta B1 nel pozzetto di lettura ed eseguire il set-up dello strumento (tasto SET);

 seguendo le indicazioni a video del software MicrotoxOMNI, eseguire le letture delle I0 dei pozzetti da B1 a B5 e da D1 a D5;

 terminata la lettura trasferire immediatamente 900 μL del bianco e del campione da A1 a B1, da A2 a B2, da A3 ad B3, da A4 a B4 e così via fino alla fine;

 esecuzione delle letture della bioluminescenza secondo gli intervalli scanditi del timer (5, 15 e 30 minuti) controllato dal software MicrotoxOMNI

Al termine delle letture il software produce l’EC50 e tutti i parametri necessari per la valutazione della qualità del dato.

Nella Figura 11 viene mostrato il luminometro M500 utilizzato per effettuare i test, nella quale sono

sintetizzati le sue funzioni base.

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3.3.6 Procedura QA/QC

Sebbene questo saggio non preveda l’impiego di organismi allevati o campionati in natura, risultando quindi soggetto a minore variabilità e minor problemi di

campionamento, risulta comunque necessario verificare:

 La sensibilità degli organismi utilizzati e del loro stato di conservazione  Il funzionamento del sistema

 La procedura stessa di esecuzione della prova (replicabilità, riproducibilità, confounding factors).

La procedura QA/QC per quanto riguarda i batteri bioluminescenti prevede:

 L’implementazione di un controllo positivo con una sostanza di riferimento, Zn, per ciascun lotto batterico utilizzato

 La valutazione della bioluminescenza (I0) nel controllo negativo (NaCl2% soluzione)

 La valutazione della corretta esecuzione delle misure, in particolare il coefficiente di correlazione (R2_{) tra la concentrazione ed inibizione della} bioluminescenza e la bioluminescenza nei controlli

Il valore dell’EC50 di Zn dovrebbe essere compreso nell’intervallo 0.6-2-2 m/L, l’I0 , invece, deve essere nell’intervallo tra 80 e 110 %.

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