Transferosomi per il trasporto del flavonoide genisteina (GEN-TFs). I sistemi di
drug delivery basati su transferosomi contenenti il flavonoide genisteina (GEN-TFs) sono stati realizzati e forniti dal Dipartimento di Chimica e Farmacia dell’Università degli Studi di Sassari. I quattro drug delivery systems multilamellari si differenziano tra loro a seconda del tensioattivo costituente. I transferosomi fluorescenti GEN-TFs utilizzati in questo studio sono stati ottenuti aggiungendo la fluoresceina alle formulazioni e rispettando le stesse procedure preparative. Per valutare gli effetti dei sistemi di drug delivery, le cellule PC12 (12°-25° passaggio) sono state esposte al trattamento con GEN non legata ai transferosomi (30 μM or 50 μM) o GEN-TF1, - TF2, -TF3, -TF4 (30 μM and 50 μM) singolarmente o in associazione con H2O2 (75 μM) per 24h91. Gli esperimenti, ripetuti in triplicato, sono stati effettuati in piastre da 24 pozzetti alla densità cellulare di 105 cellule /pozzetto.
Transferosoma per il trasporto di quercetina ed L-dopa (TF2-QL). Le nanovescicole
(TF2-QL) contenenti quercetina (Q) o quercetina solubile (QS) ed L-dopa (L) sono state realizzate dal Dipartimento di Chimica e Farmacia dell’Università degli Studi di Sassari. La linea cellulare PC12 (12°-25° passaggio) è stata esposta per 24h a concentrazioni crescenti di TF2-QL o TF2- QSL (0.6, 6, 16 e 32 μM) singolarmente o in associazione con MPTP (0.5 mM), MnCl2 (0.75 mM) o CdCl2 (30 μM). Gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato ed effettuati in piastre da 24 pozzetti seminando 105 cellule/pozzetto.
Nanoparticelle a base di chitosano caricate con genisteina (NP-GEN). Le
nanoparticelle a base di chitosano caricate con genisteina (NP-GEN) sono state fornite dal Dipartimento di Chimica e Farmacia dell’Università degli Studi di Sassari. Le cellule PC12 (passaggio 12°-25°) sono state trattate per 24h con due diverse serie di NP-GEN (NP1-GEN e NP2-GEN) preparate rispettivamente in acetone ed etanolo e contenenti genisteina (30 μM). Le formulazioni contengono inoltre diverse concentrazioni di chitosano: NP1-13 µg e NP2-26 µg. La concentrazione di GEN
Silvia Fancello; Sviluppo di strategie per nuovi approcci terapeutici nelle malattie neurodegenerative; Dottorato di ricerca in Scienze Biomediche; Indirizzo Neuroscienze; XXXI ciclo;
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invece è sempre la stessa (30 uM). Gli esperimenti sono stati effettuati in triplicato seminando 105 cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti.
Beta (β)-ciclodestrine. Le β-ciclodestrine (A-CD, monomero), (B-52, monomero), (C-
93, polimero), (D-60, monomero), (E-73, polimero), (F-29, polimero) sono state fornite dal Dipartimento di Chimica e Farmacia dell’Università degli Studi di Sassari. In questo studio, le linee cellulari PC12 (12°-25° passaggio) e Caco-2 (20°-40° passaggio) sono state trattate per tempi di esposizione differenti (15’, 30’, 1h e 24h) con diverse concentrazioni di β-ciclodestrine (0.5, 1, 2.5, 5 e 10 μM). Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in triplicato.
Metabolismo glucidico neuronale. Lo studio del metabolismo glucidico neuronale è
stato effettuato, in triplicato, in cellule PC12 (12°-25° passaggio) seminate alla densità di 3x106 cellule in petri da 60 mm di diametro. All’inizio di ogni esperimento è stato effettuato un cambio del mezzo di coltura con PBS-glu contenente i trattamenti farmacologici insulina (0.5U/mL) o pargilina (1 μM) e dopo 30 minuti sono state rilevate le concentrazioni di glucosio e lattato nel surnatante. Dopo 30 minuti dal cambio del medium le cellule sono state esposte a MPTP 1 mM per 6h. Le misurazioni successive di glucosio e lattato sono state effettuate a 2, 5 e 6h dal trattamento con MPTP.
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Metodi
Saggi di vitalità cellulare MTT e Trypan blue. Il saggio di vitalità MTT è stato
effettuato utilizzando il 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5,diphenyltetrazolium bromide (MTT), colorante solubile, convertito dalle ossido-reduttasi mitocondriali delle cellule metabolicamente attive in sali blu insolubili di formazano. Nel dettaglio, l’MTT (1mg/mL) è stato aggiunto ad ogni campione e incubato per 4 ore a 37°C. Allo scadere del tempo di incubazione, le cellule sono state lavate con PBS e centrifugate per 15 minuti. Successivamente, il pellet è stato dissolto in 2 mL di isopropanolo ed infine la densità ottica misurata alla lunghezza d’onda di 570 nm (Bauty Diagnostic Microplate Reader). Il saggio di vitalità Trypan blue è stato effettuato parallelamente al saggio MTT. Il Trypan blue (0.4%) è stato aggiunto ad ogni campione trattato al termine degli esperimenti al fine di valutare la capacità di esclusione del colorante da parte delle cellule vitali. La conta delle cellule vitali e non, è stata effettuata mediante camera di Burker. I risultati di entrambe le analisi sono stati riportati come percentuale (%) di cellule vitali rispetto al gruppo di controllo.
Saggio di citotossicità LDH. Il saggio di citotossicità LDH ha permesso la
quantificazione dell’enzima lattato deidrogenasi (LDH) nel mezzo di coltura dei campioni relativi allo studio dei GEN-TFs. Il rilascio dell’enzima citoplasmatico nel medium riflette l’entità del danno membranale indotto e di conseguenza, i livelli di LDH risultano essere direttamente proporzionali alla % di cellule morte. Al termine dei trattamenti, la procedura sperimentale per la determinazione enzimatica è stata eseguita come descritto nel manuale di istruzioni “LDH-Cytotoxicity Assay Kit II (BioVision)”. Alla fine degli esperimenti, il valore di assorbanza è stato rilevato alla lunghezza d’onda di 440 nm mediante il lettore Bauty Diagnostic. I dati ottenuti sono stati espressi come (%) di enzima LDH rilasciato nel mezzo di coltura rispetto al gruppo di controllo.
Uptake. Per valutare l’internalizzazione del sistema di drug delivery GEN-TF2, le
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ed esposte al trattamento con la formulazione fluorescente GEN-TF2 (30 µM and 50 µM). Dopo 24h di incubazione, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS e risospese in DMEM/F12 contenente 0.25% w/w di Trypan blue170. L’uptake della formulazione GEN-TF2 è stato valutato attraverso il citofluorimetro FACSCANTO (Becton & Dickinson, USA) ed i dati ottenuti analizzati mediante il software DIVA 6.3 (BD Bioscience).
Quantificazione dei ROS intracellulari. Il contenuto intracellulare di specie reattive
dell’ossigeno (ROS) è stato valutato mediante il kit ROS-ID® Total ROS Detection (Enzo Life Sciences). Le cellule PC12 seminate in piastre da 6 pozzetti (1.5x106 cellule/pozzetto) sono state esposte per 24h a perossido di idrogeno (75 µM) singolarmente o in presenza della formulazione GEN-TF2 (30 µM). Successivamente, le cellule sono state lavate con Wash Buffer e incubate con la soluzione ROS Detection (Oxidative Stress Detection Reagent, carboxy-H2DCFDA, in Wash Buffer) per 30 minuti a 37°C al buio. La produzione intracellulare di ROS è stata quantificata mediante citofluorimetro FACSCANTO (Becton & Dickinson, USA) alla lunghezza d’onda Ex/Em: 490/525 nm.
Ciclo cellulare. Questa analisi è stata effettuata per lo studio degli effetti di GEN-TF2
sulle fasi del ciclo cellulare di cellule PC12 esposte a danno ossidativo. Le cellule PC12 seminate in piastra da 6 pozzetti alla densità di 1.5 x 106 cellule/pozzetto sono state esposte al trattamento con GEN-TF2 (30 µM) e H2O2 (75 µM) per 24h. Dopo il trattamento le cellule sono lavate due volte con PBS e, successivamente fissate in EtOH 70%, trattate con RNasi A (10 µg/ml) ed infine marcate con ioduro di propidio (100 µg/ml) al buio per 30 minuti. L’analisi citometrica è stata effettuata mediante FACSCANTO (Becton & Dickinson, USA) e, l’analisi dei dati attraverso il software DIVA 6.3 (BD Bioscience).
Apoptosi. Lo studio dell’apoptosi è stato effettuato mediante il kit PE Annexin V
Apoptosis Detection (BD Pharmingen) al fine di valutare gli effetti della formulazione GEN-TF2 sulla linea cellulare PC12 esposta a stress ossidativo. La colorazione con l’annessina V è tipicamente utilizzata in combinazione alla
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colorazione vitale 7-ammino-actinomicina (7-AAD) per distinguere le cellule vitali da quelle apoptotiche (precoci e/o tardive) e da quelle necrotiche. Dopo il trattamento per 24h delle cellule PC12 con GEN-TF2 (30 µM) e H2O2 (75 µM), i campioni sono stati lavati con Annexin V binding buffer e incubati con Annexin V-PE/7-AAD per 15 minuti al buio a RT (20-25°C). L’analisi citometrica è stata effettuata attraverso lo strumento FACSCANTO (Becton & Dickinson, USA) e i dati analizzati mediante il software DIVA 6.3 (BD Bioscience).
Microscopia confocale. L’internalizzazione delle β-ciclodestrine è stata valutata in
cellule Caco-2 piastrate su vetrini coprioggetto alla densità di 2x105 cellule/mL/pozzetto. Le cellule sono state esposte per 30 minuti al trattamento con le β-ciclodestrine fluorescenti A-CD, B-52 e C-93 (5 µM) e successivamente lavate in PBS e fissate in 4% PFA. La colorazione nucleare è stata effettuata con DAPI (2 µg/ml) in PBS tween 0.05% per 15 minuti al buio e, al termine dell’incubazione i campioni sono stati lavati in PBS e sigillati sul vetrino portaoggetto. L’osservazione dei preparati è stata effettuata attraverso un microscopio confocale laser-scanning (rodamina B isotiocianato Ex: 568 nm HeNe laser/Em: 623 nm) equipaggiato con obiettivo ad immersione Apochromatic 63x DIC oil (NA1.4) (LSM710; Zeiss, Oberkochen, Germania). Le immagini sono state analizzate mediante il software Zen2008 Light Edition (Zeiss, Oberkochen, Germania).
Valutazione della fluorescenza intracellulare. Questa tecnica è stata impiegata per
valutare il segnale delle β-ciclodestrine fluorescenti proveniente dal compartimento intracellulare di cellule Caco-2. Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti con fondo nero alla densità di 2.5x104 cellule/pozzetto ed esposte al trattamento con A-CD, B-52 e C93 (5 µM), dissolte in HBSS, per 15’, 30’ e 1h. Al termine dell’incubazione, le cellule sono state lavate quattro volte con HBSS e successivamente lisate con Triton X-100 all’1% al fine di ottenere il rilascio totale del contenuto intracellulare. L’intensità di fluorescenza è stata misurata servendosi del lettore di micropiastre SpectraMax i3x (molecular devices, USA) (rodamina B isotiocianato Ex: 568 nm/Em: 623 nm).
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Quantificazione della permeabilità transepiteliale. Questa metodica è stata messa
a punto ed ottimizzata con lo scopo di studiare la permeabilità transepiteliale delle β-ciclodestrine fluorescenti. Le cellule Caco-2 sono state seminate alla densità di 2x105 cellule/0.5 mL nel compartimento apicale di inserti transwell per piastre da 12 pozzetti pretrattati con collagene (porosità: 0.4 µm, area: 1.12 cm2). Il compartimento basolaterale dei pozzetti è stato riempito con 1.5 mL di medium completo. Le cellule sono state coltivate per 21 giorni a 37°C e 5% CO2, effettuando regolarmente (2 volte a settimana) cambi del mezzo di coltura nei compartimenti apicali e basolaterali dei transwell per ottenere un monostrato cellulare differenziato. L’integrità e lo sviluppo del monostrato cellulari è stato monitorato misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER, espressa in Ω cm−2) attraverso lo strumento EVOM Meter, World Precision Instruments, Inc. USA. Il monostrato cellulare di Caco-2 è stato considerato idoneo ai fini sperimentali al raggiungimento del valore di TEER maggiore a 700 Ω cm−2. Prima di effettuare i trattamenti, ogni singolo monostrato è stato lavato due volte con PBS, pre-incubato con HBSS per 20 minuti ed esposto ai trattamenti con le β-ciclodestrine fluorescenti A-CD, B-52 e C-93 (5 µM) dissolte in HBSS per 15’, 30’ e 1h a 37°C171. Al termine dei tempi di incubazione, sono stati prelevati i campioni provenienti dal compartimento basolaterale per ciascun trattamento e ciascun monostrato cellulare nel compartimento apicale è stato lavato quattro volte con HBSS e lisato con Triton X- 100 all’1%. Tutti i campioni sono stati caricati ed analizzati in piastre da 96 pozzetti con fondo nero e la quantificazione dell’intensità di fluorescenza è stata effettuata attraverso il lettore di micropiastre SpectraMax i3x (molecular devices, USA) (rodamina B isotiocianato Ex: 568 nm/Em: 623 nm). I valori ottenuti sono stati utilizzati per caratterizzare le singole β-ciclodestrine fluorescenti in base alla loro capacità di permeazione dal compartimento apicale a quello basolaterale; di seguito è stata riportata la formula per il calcolo dei coefficienti di permeabilità apparente:
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Università degli Studi di Sassari. Papp = (dQ/dt) x (1/C0 x A)
(Papp: coefficiente di permeabilità apparente (cm/s); dQ/dt: velocità di permeabilità delle β-ciclodestrine (mol/s); C0: concentrazione iniziale delle β- ciclodestrine nel compartimento apicale (mol/ml); A: superficie di membrana dell’inserto (cm2).
Analisi di glucosio e lattato su cellule PC12. La costruzione dei biosensori per il
glucosio e il lattato è stata effettuata secondo la metodica decritta in letteratura172. Le cellule PC12 (12°-25° passaggio) sono state trattate con pargilina (1 μM), insulina (0.5 U/mL) e MPTP (1 mM) singolarmente o in co-somministrazione. I campioni di surnatante prelevati dalle colture, venivano iniettati in un micropozzetto (250 μL) e il glucosio ed il lattato quantificati con l’ausilio dei biosensori. Tutti gli esperimenti sono stati riprodotti in triplicato ed effettuati in piastre Petri da 30 mm di diametro seminando le cellule ad una densità di 3x106 cellule/4mL medium/petri. Il surnatante di ogni campione è stato analizzato con i biosensori per il glucosio e per il lattato a 30’, 120’ e 300’ di trattamento e, le correnti risultanti (nA) sono state poi convertite in concentrazioni (mM/L).
Analisi statistica. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i valori sono
stati espressi come medie ± gli errori standard con intervallo di confidenza del 95% (p<0.05). Le differenze statistiche tra i campioni controllo e i diversi gruppi sperimentali sono state valutate utilizzando l’analisi One-Way ANOVA seguita da Newman-Keuls post-hoc test (unpaired t-test per le differenze tra gruppi) e paired t- test per le differenze all’interno del singolo gruppo mediante il software Graph-Pad Prism versione 5.0 (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA).
Silvia Fancello; Sviluppo di strategie per nuovi approcci terapeutici nelle malattie neurodegenerative; Dottorato di ricerca in Scienze Biomediche; Indirizzo Neuroscienze; XXXI ciclo;
Università degli Studi di Sassari.
Silvia Fancello; Sviluppo di strategie per nuovi approcci terapeutici nelle malattie neurodegenerative; Dottorato di ricerca in Scienze Biomediche; Indirizzo Neuroscienze; XXXI ciclo;
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