Trattamento dei campioni

Il trattamento dei campioni è finalizzato a modificare lo stato fisico del campione, per ridurlo nella forma appropriata per la tecnica analitica scelta. In questo studio metodologico, l’adozione di una tecnica come l’ICPMS, ha richiesto la riduzione dei campioni di uva e suolo, in soluzione acquose, mentre l’utilizzo della spettrometria XRF, per l’analisi dei campioni di suolo, ha richiesto la preparazione di pasticche di polvere pressata.

Per la decomposizione dei campioni agroalimentari, i trattamenti che si utilizzano sono: “Dry” o “Wet” digestion

Dry digestion

Il metodo consiste nel riscaldare il campione, in crogioli di porcellana, in una muffola ad una temperatura compresa tra 400-800 C°. Dopo la decomposizione, il residuo è dissolto con acido e trasferito nelle provette.

Con questo metodo, la componente organica è eliminata e la componente inorganica risulta altamente concentrata. Questo metodo, tuttavia, potrebbe portare alla perdita di alcuni elementi volatili o semi-volatili, come Hg, Pb, Cd, Ca, As, Sb, Cr e Cu. Anche se la dry digestion è il metodo più semplice, la tecnica potrebbe presentare diversi svantaggi: (a) richiedere molto tempo (12h-18h); (b) la non completa digestione di alcuni campioni, in particolar modo quelli che contengono un alto contenuto di zuccheri, per i quali è necessario aggiungere acidi al processo e prolungare il tempo di trattamento fino a 30 h (De La Guardia e Gonzalvez 2013).

Wet digestion

La Wet digestion o Acid digestion è un metodo che implica la decomposizione della matrice organica tramite l’aggiunta di una miscela di acidi forti/miscela di acidi e ossidanti, all’interno di un recipiente che verrà riscaldato. I reagenti comunemente utilizzati sono HNO3, H2SO4 o H2O2.

La wet digestion si realizza in due diverse procedure: sistema aperto/chiuso o decomposizione tramite forno a microonde (Chao e Sanzolone 1992).

Nel sistema aperto, la dissoluzione avviene tramite riscaldamento del campione, miscelato ad acido, su piastra calda. Quando la miscela campioni/acidi raggiunge l’incipiente secchezza, si aggiunge una nota quantità di acido e poi si diluisce, fino ad ottenere un certo volume noto. In alcuni casi è necessario un ulteriore ciclo, con aggiunta di acido e successiva evaporazione su piastra, per ottenere una soluzione più limpida.

Nella dissoluzione del campione tramite forno microonde, invece, il riscaldamento della miscela campioni/acidi avviene all’interno di contenitori ben sigillati e posti all’interno di un forno microonde, che può raggiungere temperature di circa 300 °C e pressioni dell'ordine di 800 psi.

Questo tipo di sistema permette di ridurre il tempo di digestione, i rischi di contaminazione, di utilizzare meno acidi ed evitare la perdita di elementi volatili. Tutti

questi vantaggi sono dovuti al riscaldamento diretto delle componenti e all'uso di alte pressioni, che permettono di aumentare il punto di ebollizione dell’acido, facilitando così la decomposizione dei campioni (Chao e Sanzolone 1992) (De La Guardia e Gonzalvez 2013).

Considerando che nel presente studio sono stati analizzati tre tipologie di campioni ( suolo, uva, vino), sono state adottate tre diverse procedure di trattamento.

Suolo

Per la caratterizzazione dei campioni di suolo sono stati adottati due diversi trattamenti, in funzione della tecnica scelta (XRF, ICP-MS).

Il trattamento per l’analisi in XRF ha previsto la seguente procedura. I campioni di suoli sono stati essiccati, in forno, a 105 °C e in seguito frantumati con il frantoio o pressa idraulica e polverizzati, attraverso un mulino a vibrazione con giara in agata. Dopo la macinazione sono stati posti in una muffola ad una temperatura di 500-550 °C, per circa 24 h, così da rimuovere la sostanza organica mediante calcinazione. In seguito, sono state realizzate delle pasticche di polvere pressata su supporto di acido borico, con l’utilizzo di una pressa idraulica e di uno stampo cilindrico. La L.O.I. (loss on ignition) di ogni campione è stata determinata calcolando la perdita di peso (0,5 g di campione calcinato) riportata, dopo il trattamento termico in muffola, ad una temperatura di 1000 °C.

Per analizzare il suolo in ICP-MS sono stati utilizzati i campioni calcinati a 500-550 °C, per eliminare la sostanza organica e trattati secondo il metodo wet digestion in sistema

aperto su piastra calda. È stata prelevata una quantità pari a circa 0.20 g di suolo, accuratamente pesata e posta poi all’interno di un becher in teflon. Nella prima fase sono stati aggiunti 3 ml di HNO3 (acido nitrico concentrato 65% Merck Suprapur ) e 6 ml di HF (acido fluoridrico concentrato a 40% Merck Suprapur ).

Per una migliore omogeneizzazione, la miscela campione/acidi è stata sottoposta ad un trattamento di ultrasuoni, per circa 1 ora.

In seguito, i becher sono stati messi su una piastra a 180-200 °C, per circa 4-5 ore. Una volta raggiunta l’incipiente secchezza, è stato necessario aggiungere 3ml di HNO3 e 3ml di

HF al composto e sottoporlo nuovamente ad ultrasuoni per circa 1 ora. Alla fine, i becher sono stati riposizionati sulla piastra e, una volta raggiunta di nuovo l’incipiente secchezza, sono stati aggiunti 4 ml di HNO3. A completa dissoluzione, il campione è stato ripreso con 2 ml di HNO3 e qualche millilitro di H2O.

La preparazione si è conclusa portando, infine, a volume il composto in un matraccio da 100 ml con acqua milliQ®.

In ogni soluzione è stato inserito uno standard interno multi-elementare, costituito da Re, Rh, In e Bi a concentrazione di 10 ppb (Fig.15).

Uva

I campioni d’uva, prima del trattamento di dissoluzione, sono stati posti all’interno di un contenitore in plastica e lavati con acqua milliQ®, facendo attenzione a non ledere le bacche per evitare una fuoriuscita del succo.

Dopo la fase di lavaggio, i campioni sono stati separati in due parti, utilizzando una centrifuga: il succo d’uva e una componente solida, formata da buccia, polpa e semi, denominata “residuo solido”. Anche nel processo di dissoluzione dei campioni d’uva è stato utilizzato un metodo di trattamento di wet digestion in sistema aperto.

Fig. 15 Schema descrittivo del procedimento di dissoluzione del suolo

Suolo •0.20 g I Step • 3 ml HNO3 • 6ml HF II Step • 3ml HNO3 • 3ml HF

III Step • 4 ml HNO3

IV Step

• 2 ml HNO3

• 0,1ml di soluzione standard interno Rh, Re, In e Bi a 10 ppm

Succo

La parte del succo d’uva è stata accuratamente pesata all’interno di un becher di teflon, con una quantità pari a circa a 4 ml. Nel primo step, 3 ml di HNO3 (acido nitrico concentrato

65% Merck Suprapur) e 3 ml di H2O2 (acqua ossigenata concentrato 30% Merck Suprapur)

sono stati aggiunti al succo d’uva. La miscela campione/acidi, poi, è stata sottoposta ad un trattamento ad ultrasuoni per circa un’ora, per omogeneizzare il composto e favorire l’azione dell’acido. Successivamente, la miscela è stata messa su piastra, a temperatura di 110-140 °C per 3-4 ore e fatta evaporare, fino ad incipiente secchezza. Nel secondo step, il composto è stato ripreso con 2 ml di HNO3 e qualche millilitro di H2O. Infine, la miscela è stata portata a volume in un matraccio da 100 ml, con acqua milliQ®. In ogni soluzione è stato inserito uno standard interno multi-elementare, costituito da Re, Rh, a concentrazione di 10 ppb, per il controllo e la correzione della deriva strumentale (Fig.16).

Fig. 16 Schema descrittivo del procedimento di dissoluzione del succo

Residuo Solido

Il residuo solido è stato diviso in due aliquote: uno come “Fresh Weight”, con sigla FW (campione umido), l’altro come “Freezy-Drying”, con sigla FD (campione secco). Il “fresh

weight” indica il campione tal quale, mentre i campioni FD prevedono una particolare procedura. La parte FW è stata sottoposta direttamente a trattamento wet digestion, mentre la parte FD è stata prima liofilizzata e poi trattata con il medesimo metodo. Il processo di liofilizzazione o “Freeze Drying” , infatti, consiste nella disidratazione del campione,

Succo • ~4 ml I Step • 3 ml HNO3 • 2 ml H2O2 II Step • 2 ml HNO3

• 0,1ml di soluzione standard interno Rh e Re a 10 ppm

condotta a bassa temperatura (-30, -40 °C) e sottovuoto, in modo da lasciare inalterata la struttura e le proprietà chimiche. I campioni sono stati inseriti in appositi contenitori, pesati ed inseriti nel liofilizzatore, per un ciclo di 72h, al fine di ottenere un campione secco. I campioni liofilizzati, in seguito, sono stati omogenizzati tramite un mortaio d’agata. Ad entrambi i gruppi (FW, FD) è stato applicato lo stesso trattamento chimico: wet

digestion in sistema aperto su piastra calda. Dai campioni FW è stata prelevata una quantità pari a circa 2.5 g, a garanzia di una buona rappresentatività anche in presenza di una certa eterogeneità , mentre solo 0.5 g per la frazione da FD, la quale risulta essere ben più omogenea.

Prima di sottoporre il composto al trattamento ad ultrasuoni (circa 1-2 ore) per l’omogeneizzazione del campione, la miscela residuo solido/acidi è stata trattata con 4 ml di HNO3 (acido nitrico concentrato 65% Merck Suprapur ) e 3 ml di H2O2 (acqua ossigenata Merck Suprapur). I becher, in seguito, sono stati messi su piastra a 150-180 °C, per circa 3-4 ore. Nella decomposizione del residuo è stato necessario un successivo step, rispetto alla dissoluzione del succo, con aggiunta di 3 ml di HNO3. Anche in questo caso, dopo alcune ore, raggiunta l’incipiente secchezza, il residuo solido è stato ripreso con 2 ml di HNO3 e qualche mml di H2O milliQ®.

Come nel caso precedente, il trattamento si è concluso portando a volume la miscela in un matraccio da 100 ml con acqua milliQ®, previo inserimento della soluzione di standard interno (Fig. 17).

Fig. 17 Schema descrittivo del procedimento di dissoluzione del residuo.

Residuo •~2.5 g FW •~0.5 g FD I Step •4 ml HNO3 •3 ml H2O2 II Step • 3 ml HNO3 III Step •2 ml HNO3

•0,1ml di soluzione standard interno Rh e Re a 10 ppm

Vino

Per quanto riguarda le analisi in ICP-MS del vino, i campioni sono stati semplicemente diluiti. La procedura di diluizione ha previsto 1 ml di campione, 8 ml di acqua acidificata (acqua milliQ con 2% di HNO3 concentrato 65% Merck Suprapur ) e 1 ml di standard interno multi-elementare costituito da Re, Rh, a concentrazione di 100 ppb ( Fig.18).

Fig.18 Schema descrittivo del procedimento di diluzione del vino