Il Triolo altera la funzione e la biogenesi mitocondriale in un modello cellulare di steatosi.

La misura del consumo di ossigeno su epatociti primari isolati da fegato di ratto in seguito a incubazioni per 24h con acido palmitico 50µM + acido oleico 2mM + Triolo 10 µM mostra una riduzione dell’attività respiratoria mitocondriale (Figura 20).

Lo studio dell’espressione genica dei regolatori principali della biogenesi mitocondriale mostra che i livelli di mRNA di PGC1α, TFAM e NRF1 erano simili quando gli epatociti primari erano incubati o solo con acidi grassi o solo con Triolo, mentre era down-regolata quando le cellule erano incubate con Triolo + palmitato + oleato, suggerendo l’effetto tossico di questo ossisterolo (Figura 21).

% o C T R L CTRL PA 5 0uM PA+T riol 1 0uM PA+T riol 1 00uM OA 2 mM OA+T riol 1 0uM OA+T riol 1 00uM _PA+O A PA+O A+Tr iol 1 0uM PA+O A+Tr iol 1 00uM 0 50 100 150 * *

M it o ch o n d ri al /c el lu la r re s p ir a ti o n ( % ) CTRL Trio l 10u M PA+O A PA+O A+T 0 20 40 60 80 100 * *= p < 0.05 vs CTRL

Fig. 20 Consumo di ossigeno di epatociti primari controllo e dopo incubazione per 24h con Triolo 10 µM, palmitato+ oleato ( 50 µM + 2 mM, rispettivamente), palmitato + oleato + Triolo.

PGC1a F o ld C h a n g e (% o f C T R L ) CTRL Trio l OA OA + Trio l PA + OA PA + OA + T 0 50 100 150 200 *,^ TFAM F o ld C h a n g e ( % o f C T R L ) CTRL Trio l OA OA + Tr iol PA + OA PA + OA + T 0 50 100 150 ^ NRF1 F o ld C h a n g e ( % o f C T R L ) CTRL Trio l OA OA + Trio l PA + OA PA + OA + T 0 50 100 150 ^ *= p < 0.05 vs CTRL ^ = p < 0.05 vs HF

Fig 21 Real-time PCR dei geni PGC1-α, TFAM e NRF1 su epatociti primari controllo e dopo trattamento con acidi grassi e Triolo.

5. DISCUSSIONE

Il fegato gioca un ruolo centrale nel metabolismo dei lipidi, dal momento della captazione degli acidi grassi liberi dal siero fino alla sintesi, all’immagazzinamento ed alla dismissione delle lipoproteine nella circolazione ematica. I meccanismi fisiopatologici che portano alla NAFLD non sono completamente noti, in particolare non sono ben chiari i fattori che conducono al progressivo danno degli epatociti a seguito dell’accumulo dei lipidi al loro interno. Sembra che alterazioni di fattori locali e sistemici, ed in particolare l’insulino-resistenza, siano alla base del processo patologico, a causa del controllo che questi esercitano sul bilancio tra l’afflusso e la sintesi di lipidi epatici e la loro esportazione od ossidazione. Il fegato steatosico sarebbe, quindi, più vulnerabile ad insulti secondari che determinano infiammazione e fibrosi, quali gli ormoni derivati dall’organo adiposo (adipocitochine), lo stress ossidativo ed endotossine batteriche di provenienza intestinale ( Browning DJ et al.,2004).

Sebbene la patogenesi della NASH non sia ancora ben chiara, è ormai confermato il ruolo centrale svolto dall’accumulo di lipidi nel fegato ( Day CP et al.,1998; Ferre N et al.,2009). In particolare, l’accumulo di colesterolo libero a livello epatico può agire direttamente sugli epatociti alterando l’integrità delle membrane mitocondriali e del reticolo endoplasmatico ( Tabas., 2002) o mediante la generazione di stress ossidativo ( Montero J et al., 2010; Gentile CL et al.,2011) e promuovendo la generazione di ossisteroli tossici (Garenc C et al., 2010) o ancora ,indirettamente, inducendo disfunzione del tessuto adiposo ( Duval C et al., 2010; Yu BL et al., 2010).

L’accumulo a livello epatico di LDL ossidate può portare all’attivazione delle cellule di Kupffer e alla loro trasformazione fenotipica in cellule stellate, promuovendo infiammazione e fibrogenesi. ( You Q et al., 2008; Leroux A et al., 2012).

Per verificare il possibile coinvolgimento degli ossisteroli nella patogenesi della steatosi epatica non alcolica e il loro impatto sulla biogenesi e funzionalità mitocondriale, abbiamo utilizzato modelli murini alimentati con una dieta ricca di acidi grassi (HF), ricca di colesterolo (HC) e una dieta combinata HC + HF. L’analisi istochimica dei campioni epatici evidenzia che, mentre il modello HF determinava steatosi epatica semplice, il modello HC era caratterizzato da degenerazione balloniforme degli epatociti mentre quello combinato presentava tutte le caratteristiche istologiche della NASH ovvero, steatosi epatica associata a necrosi epatocellulare e infiltrazione infiammatoria. Dunque, le diete ad alto contenuto di acidi grassi o di colesterolo inducono NAFL ma solo la dieta combinata provoca NASH.

L’analisi dei lipidi epatici nei modelli studiati ha, invece, evidenziato un aumento del colesterolo libero nel modello HC, mentre nel modello HF+ HC si riscontravano livelli epatici aumentati sia di colesterolo libero che di acidi grassi liberi. Per quanto riguarda gli ossisteroli epatici, ciò che abbiamo osservato è stato un incremento di ossisteroli generati da vie in cui sono coinvolte le specie reattive dell’ossigeno nei modelli HC e HF+HC, rispetto al controllo e alla dieta HF.

L’analisi dell’attività respiratoria mitocondriale su modello animale ha ,invece, evidenziato una riduzione del consumo di ossigeno nelle diete HC e HF+HC, rispetto

alla dieta HF. Tutto ciò dimostra che, l’eccesso di colesterolo ma non di acidi grassi nelle diete è associato ad una incrementata formazione di ossisteroli generati da radicali liberi e a disfunzione mitocondriale.

L’analisi dei complessi della catena respiratoria mediante BLUE NATIVE PAGE evidenzia una riduzione a livello del complesso V nella dieta HC e a livello dei complessi I, IV e V nella dieta HF+HC, rispetto al controllo e al gruppo HF. Lo studio, mediante Real Time PCR, dei tre principali geni regolatori della mitocondriogenesi PGC1-α, TFAM e NRF1 evidenzia una riduzione dell’espressione genica nel modello HF+HC, rispetto agli altri modelli sperimentali. Dunque, l’eccesso di acidi grassi e colesterolo è responsabile della compromissione della biogenesi mitocondriale.

La disfunzione mitocondriale produce radicali liberi, che sono stati quantificati misurando il tasso di produzione di perossido di idrogeno. I mitocondri di fegato relativi ai gruppi HC e HF+HC ( ma non HF), presentavano un più alto tasso di produzione di perossido di idrogeno rispetto al controllo, indipendentemente dal substrato ossidato.

L’ipotesi è quindi, che, l’associazione tra eccesso di acidi grassi liberi ed eccesso di colesterolo libero, sia in qualche modo responsabile del danno mitocondriale nella NASH, attraverso una incrementata formazione di ossisteroli tossici generati da radicali liberi.

Per verificare se il 7-Keto e il Triolo avessero un impatto negativo sulla respirazione mitocondriale, abbiamo misurato il tasso di consumo di ossigeno su epatociti primari

isolati da fegato di ratto in seguito ad incubazione con concentrazioni crescenti di questi due ossisteroli. Ciò che abbiamo osservato è che, il 7-keto non aveva effetti sulla respirazione mitocondriale al contrario del Triolo, dove abbiamo osservato una riduzione dose-dipendente della respirazione mitocondriale, ragion per cui si è scelto di proseguire lo studio utilizzando solo questo ossisterolo.

Per verificare il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione mitocondriale e nella tossicità epatocellulare, abbiamo esposto cellule immortalizzate di epatocarcinoma HuH7 e colture primarie di epatociti isolati da fegato di ratto all’acido palmitico come acido grasso saturo e all’acido oleico come acido grasso insaturo, con e senza Triolo. Ciò che abbiamo osservato è che, tale ossisterolo induceva apoptosi in cellule co-esposte con i due acidi grassi e ciò era associato ad una alterazione dell’attività respiratoria mitocondriale e ad una down-regolazione dei geni PGC1-α, TFAM e NRF1, coinvolti nella mitocondriogenesi.

Dunque i nostri dati mostrano che, la dieta ad alto contenuto di colesterolo induce danno epatico che è aggravato dall’eccesso di acidi grassi e la cui severità è associata ad una alterazione della biogenesi e funzionalità mitocondriale; tutto ciò si associa ad una incrementata formazione di ossisteroli generati da vie in cui sono coinvolte le specie reattive dell’ossigeno. In particolare, l’ossisterolo 5α-cholestane-3β,5,6β-triol (Triolo), si è rivelato essere determinante nell’alterazione della biogenesi e della funzione mitocondriale, contribuendo alla patologia epatica della NASH.

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