Vaccini di seconda generazione

I vaccini di seconda generazione includono vaccini a subunita` costituiti da proteine sintetiche o ricombinanti, batteri o virus ricombinanti che esprimono antigeni di Leishmania (Yang et al., 1990; Gurunathan et al, 1997) o frazioni native purificate dai parassiti. Molte proteine di Leishmania sono state candidate come antigeni e scelte in base alla loro abbondanza e localizzazione sulla superficie (Handman et al., 1986), cloni di linfociti T, screening di pool antigenici (Melby et al., 2000) e screening di librerie d’espressione con sieri reattivi (Skeiky et al., 1995 Reed et al., 1987). Questi antigeni includono la glicoproteina 63 (gp63), la glicoproteina di membrana 46 (gp 46 o M-2), fucose- mannose ligand (FML), ), Leishmania homolog of receptors for activated C kinase (p36/LACK), NH36, Protein Q chimera, cistein proteasi A e B, GRP78, antigeni LD1, hydrophilic acylated surface protein B1 (HASPB1), LCR1, proteina salivare 15 (SP15), antigene superficiale di promastigote 2 (PSA-2), istone H1, MML, Leishmania

Dott.ssa Ilaria Michela Piras, Allestimento e trial clinico di un vaccino a DNA per il trattamento della leishmaniosi canina. Tesi di dottorato in Scienze Biomolecolari e Biotecnologiche.

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117 elongation and initiation factor (LeIF), L. major homolog of the eukaryotic stress inducible protein-1 (LmSTI1), L. major omologo di eukaryoticthiol- specific-antioxidant (TSA) and Leish-111f.

Il primo trial in fase III di un vaccine di seconda generazione, costituito da un liofilizzato proteico semipurificato di L. infantum, e` risultato fallimentare (Dunan et al., 1989) nonostante si fosse dimostrato efficace nel modello murino. Un’altro vaccino di seconda generazione sviluppato successivamente ha dimostrato efficacia in trial clinici di campo nel cane: il fucose-mannose ligand (FML) adiuvato con saponina derivante da Quillaja saponaria (Leishmune®; da Silva et al., 2001; Borja-Cabrera et al., 2002; Palatnik-de-Sousa et al., 2008). Nel 2003 il vaccino FML-saponina e` stato registrato per la profilassi contro la CanL in Brasile col nome di Leishmune®, e viene usato in Brasile sin dal 2004 e ha ottenuto la sua licenza definitiva nell’ottobre del 2011. Il FML si e` dimostrato antigenico nell’uomo ( Palatnik-de-Sousa et al., 1995) e nel cane (Borja-Cabrera et al., 1999) e la formulazione di Leishmune® si e` dimostrata essere immunogenica, immunoprofilattica e immunoterapeutica nel topo, nella cavia e nei trial di campo nel cane con dati di 92% d protezione e 72% di efficacia ( Palatnik-de-Sousa et al., 1994; Santos et al., 2002, 2003, 2007; Borja-Cabrera et al., 2004, 2008, 2010). La protezione conferita da

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118 Leishmune® e` durata almeno 3.5 anni ed e`stata concomitante ad una riduzione dell’incidenza delle malattia nell’uomo nella regione ( Borja- Cabrera et al., 2002). La vaccinazione oltre ad essersi dimostrata protettiva riduce il carico parassitario accessibile per i flebotomi come dimostrato dai risultati negativi delle PCR per il DNA di Leishmania da campioni di sangue e linfonodo e dalle razioni negative della all’immunoistochimica (Nogueira et al., 2005). Gli anticorpi anti-FML indotti dalla vaccinazione con sono Leishmune® prevalentememnte di di tipo IgG2 (Mendes et al., 2003) e sembrano responsabili di un blocco delle trasmissione della malattia dai flebotomi nelle prove di campo (Palatnik-de-Sousa et al., 2008). La risposta IgG2 anti-FML inoltre non e` sieroreattiva nei confronti dei test ufficiali usati per lo screening in Brasile, permettendo quindi di distinguere gli animali vaccinati dagli animali infetti (Palatnik-de-Sousa et al., 2009)

Leishmune® e`stato studiato anche in immunoterapia utilizzando una formulazione arricchita di saponina, dimostrando una riduzione della sintomatologia, dei decessi, e del numero dei parassiti nei linfonodi. La terapia integrata di allopurinolo, amphotericina B e Leishmune® promuove una guarigione sterile, convertendo i risultati delle PCR per il DNA di

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119 Tra il 2004 ed il 2006 sono stati condotti degli studi sull’incidenza della leishmaniosi nell’uomo in due regioni del Brasile dove la popolazione canina e` stata sottoposta ad una campagna di vaccinazione con Leishmune® . La diminuzione dell’abbattimento dei cani e dell’incidenza nella popolazione umana e` stata correlata significativamente con l’incremento degli animali vaccinati indicando che l’impatto profilattico del vaccino oltre ad una diminuzione delle infezioni sia nella popolazione umana che canina ha comportato una diminuzione dei cani sacrificati (Palatnik-de-Sousa et al., 2009). In particolare nella regione di Araçatuba una diminuzione dell’incidenza nei cani del 25% ha avuto un riflesso del 61% nella diminuzione della malattia nella popolazione umana ( Palatnik- de-Sousa et al., 2009).

Tra le altre formulazioni registrate esiste il vaccino chiamato Leish-Tec® che e` stato registrato in Brasile. E` composto dall`antigene A2 purificato da amastigoti di Leishmania e adiuvato son saponina. Di questo vaccino esiste unicamente uno studio sperimentale condotto nel cane ( Fernandes et al., 2008).

In Europa, una formulazione a base di LiESAp e` stata registrata per la commercializzazione con il nome di CaniLeish® nel 2011 ed e` stata lanciata in Portogallo, Spagna, Francia, Grecia e in Italia. Si tratta di un

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120 antigene peptidico composto da proteine Excreted–Secreted di L. Infantum con QA21 da Q. Saponaria come adiuvante (Virbac, 2011)

La capacita` di un vaccino di rispondere ad antigeni multipli e` una delle caratteristche essenziali delle sua efficacia. Numerosi antigeni sono inclusi nelle preparazioni vaccinali di prima generazione o in quelli di seconda generazione come Leishmune® or LiESAp ( Lemesre et al., 2007; Palatnik- de-Sousa et al., 2008) che hanno già dimostrato una grande efficacia nelle prove di campo. Nonostante questo, per l’industria produrre dei vaccini a partire dei protozoi presenta delle difficolta`. Far crescere i protozoi ed estrarre le loro proteine native e` laborioso, dispendioso e necessita l’utilizzo di prodotti di origine bovina che sono stati proibiti a seguito dell’emergenza delle encefalopatie spongiformi. Una soluzione a questi problemi e` rappresentata dai vaccini a subunita`, sviluppati numerosi a partire dagli antigeni di Leishmania e disponibili nella forma ricombinante (Palatnik-de- Sousa et al., 2008; Working Group on Research Priorities for Development of Leishmaniasis Vaccines et al., 2011). Questi antigeni sono interessanti nell’ottica di un vaccino ricombinante multiplo contro la CanL. I candidati più promettenti sono LACK, LeIF, TSA, LmSTI1, H1, Cpa + CPb, KMP11, and NH36 , di questi pero` nessuno ha raggiuntola fase tre di trial nel cane.

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121 La proteina di fusione Leish-111f contenente gli antigeni TSA, LmST1 e LeIF in una formulazione contenente MPL-SE o Adjuprime si e` dimostrata immunogena in cani nel challenge con L. chagasi. e L. infantum ( Fujiwara et al., 2005; Moreno et al., 2007) ma non si e`dimostrata efficace nel prevenire l’infezione naturale o la progressione della malattia nelle prove di campo (Gradoni et al., 2005). Comunque Leish-111f somministrato assieme a glucantime risulta efficace nel trattamento della CanL ( Miret et al., 2008).