1.6 CSB interagisce con p53 e regola la sua degradazione
2. SCOPO DELLA TES
3.4 Validazione dei risultati della co-purificazione mediante co immunoprecipitazione
Per ciascuna delle proteine co-purificate abbiamo deciso di verificare l’interazione con CSB mediante co-immunoprecipitazione. Per far questo abbiamo creato delle proteine ricombinanti con i tag FLAG e MYC al fine di sovraesprimere le proteine di interesse ed effettuare delle analisi di immunoprecipitazione specifiche contro i tag. Il primo passo è stato creare una linea CS1AN che esprime in modo stabile la proteina di fusione CSB-Flag e che indicheremo come CS1AN CSB-Flag. Le cellule
CS1AN sono state quindi trasfettate sia con il vettore 3X-FLAG CMV10 che con il vettore 3X-FLAG-CSB. La selezione della linea stabile è stata ottenuta con l’antibiotico G418 800 ug/mL successivamente diminuita a 400 ug/mL per il mantenimento.
La metodica della co-immunoprecipitazione (co-IP) è stata ampliamente utilizzata in
vitro per verificare associazioni proteiche identificate con altre tecniche [28-30].
Per verificare i dati ottenuti mediante gli esperimenti di TAP, abbiamo immunoprecipitato gli estratti proteici da cellule CS1AN CSB-Flag in cui sono stati trasfettati uno alla volta i plasmidi esprimenti 36 delle 45 proteine identificate come nel saggio TAP. Queste proteine sono state espresse in fusione con il tag Myc. L’immunoprecipitazione è stata effettuata sia con l’anticorpo anti-Flag che con quello anti-Myc e gli immunoprecipitati sono stati analizzati mediante western blot utilizzando gli anticorpi anti-Flag e anti-Myc.
Per verificare che le interazioni ottenute dagli esperimenti di co- immunoprecipitazione non fossero influenzate dalla presenza dei tag o delle biglie abbiamo allestito degli esperimenti di controllo. Nella linea CS1AN CSB-Flag abbiamo trasfettato il vettore che esprime solo il tag Myc e la successiva analisi di western blot ha rivelato che nell’immunoprecipitato anti-Myc non è presente la proteina CSB-Flag (Figura 15 A). Allo stesso modo, nella linea stabile CS1AN Flag in cui è stato trasfettato il vettore che esprime una proteina Myc-tagged (abbiamo scelto SMARCA2-Myc), l’analisi di western blot ha rivelato che nell’eluato dell’immunoprecipitazione specifica contro il tag Flag non è presente SMARCA2- MYC (Figura 15 B). Come atteso, quindi, CSB-Flag non immunoprecipita in presenza del solo tag Myc, cosi come la proteina Myc-tagged non immunoprecipita in presenza del solo tag Flag.
Gli esperimenti di co-IP hanno confermato che CAND1, CSTF1, DDX3X, DDX5, DDX17, DDX23, DHX36, HDAC1, HNRNPU, MTA2, PRPF3, PSMD3, RBBP4, SFPQ, SMARCA1, SMARCA2, TOP1, USP7 e XRCC5 interagiscono con CSB sia quando l’IP è effettuata contro il tag Flag che contro il tag Myc (Figura 16).
Inoltre abbiamo stabilito che COPS3, COPS4, COPS6, DDX1, DDX41, GATAD2B, PRPF4, PSMC5 e SF3B2 interagiscono con CSB quando l’IP è effettuata
utilizzando l’anticorpo anti-Myc ma non con l’anticorpo anti-Flag (Figura 17). D’altro canto, CTR9, GATAD2A, NONO, PSMD12 e TOPO IIA interagiscono con CSB solo quando l’IP è effettuata contro il tag Flag (Figura 18 A-E). Nei casi in cui la co-precipitazione è rivelata solo per l’IP contro il tag Flag o solo per l’IP contro il tag Myc, abbiamo speculato che l’anticorpo non sia in grado di riconoscere il rispettivo epitopo perché nascosto dall’interazione tra le due proteine. Infine, EFTUD2, HLTF E PSMD2 non interagiscono con CSB né utilizzando l’anticorpo anti-Flag né anti-Myc (Figura 18 F-H).
Per riassumere, un totale di 33 nuove interazioni identificate negli esperimenti di TAP sono state confermate mediante co-IP. Tuttavia, ulteriori studi saranno necessari per comprendere la rilevanza funzionale di queste interazioni.
Figura 15│Western Blot relativi ai controlli degli esperimenti di immunoprecipitazione.
I controlli effettuati hanno mostrato che la presenza dei tag FLAG e MYC non influenza la precipitazione rispettivamente delle proteine Myc-tagged e di CSB-Flag.
(A) In cellule CS1ANCSB-Flag trasfettate con il vettore che esprime solo il tag MYC,
l’immunoprecipitazione effettuata contro il tag MYC non determina la precipitazione di CSB-Flag.
(B) In cellule CS1AN Flag trasfettatate con il vettore che esprime la proteina Myc-tagged,
l’immunoprecipitazione effettuata contro il tag Flag non determina la precipitazione della proteina Myc-tagged (abbiamo utilizzato la proteina SMARCA2-Myc).
Figura 16│Western Blot relativi agli esperimenti di immunoprecipitazione.
Gli estratti cellulari totali (WCE) ottenuti da cellule CS1AN che esprimono in modo stabile la proteina CSB Flag e in modo transiente le proteine indicate sono stati immunoprecipitati sia con l’anticorpo anti-Flag che anti-Myc. L’analisi di western blot ha rivelato l’avvenuta interazione in entrambi gli esperimenti di immunoprecipitazione.
Figura 17│Western Blot relativi agli esperimenti di immunoprecipitazione.
Gli estratti cellulari totali (WCE) ottenuti da cellule CS1AN che esprimono in modo stabile la proteina CSB Flag e in modo transiente le proteine indicate sono stati immunoprecipitati sia con l’anticorpo anti-Flag che anti-Myc. L’analisi di western blot ha rivelato l’avvenuta interazione solo nel caso dell’immunoprecipitazione contro il tag Myc.
Figura 18│Western Blot relativi agli esperimenti di immunoprecipitazione.
Gli estratti cellulari totali (WCE) ottenuti da cellule CS1AN che esprimono in modo stabile la proteina CSB Flag e in modo transiente le proteine indicate sono stati immunoprecipitati sia con l’anticorpo anti-Flag che anti-Myc. L’analisi di western blot ha rivelato l’avvenuta interazione solo nel caso dell’immunoprecipitazione contro il tag Flag. Tre delle proteine analizzate (F-H) non ha mostrato interazione con CSB.