Valutazione dei miRNA tramite “Vote-counting”

I dati, relativi ai miRNA recuperati dalla letteratura, sono stati analizzati con un approccio a due fasi. Nella prima fase, un vote-counting di tipo tradizionale è stato applicato al pool di tutti i 213 miRNA come riportato nella (Tabella 4 e Tabella supplementare 4). Questo metodo ha permesso di identificare i miRNA riportati più frequentemente e quelli riportati nel maggior numero di studi e di categorie di comparazione (a, b, c, d).

Nella seconda fase, un più spinto strategia conteggio dei voti, è stato appositamente ideato metodo di vote-counting più rigoroso ed è stato applicato al pool dei 41 miRNA validati da qRT-PCR riportati in Tabella 5. Informazioni dettagliate su questa strategia sono riportate nel sottoparagrafo seguente. I risultati sono riportati in un diagramma “degli estremi e dei quartili” (chiamato anche “box and

whiskers plot” oppure “box-plot”) in cui ogni punto rappresenta un miRNA (Figura 13). I miRNA

appartenenti a gruppi Q3 e Max sono stati considerati come i più significativi. Il ranking dei miRNA in quartili ed il box and whiskers plot sono stati ottenuti utilizzando Microsoft Excel e Plotly disponibile all’indirizzo https://plot.ly/.

3.1.4.1. Dettagli sulla strategia di conteggio dei voti appositamente ideata per l’analisi dei

miRNAs in assenza di raw data.

Il metodo considera la direzione di deregolazione di ogni miRNA, nonché le seguenti 4 caratteristiche: il numero di studi che riportano ogni miRNA come deregolato; il numero totale di campioni di MM; il numero totale di campioni normali; e il numero di serie di qRT-PCR condotte per valutare ogni miRNA. Quest’ultima caratteristica è stata presa in considerazione in quanto alcuni autori hanno effettuato la validazione in qRT-PCR in diverse coorti di campioni (ad esempio nel “discovery set”, successivamente nel “Training set” ed infine nel “Validation set” [Kirschner MB et

al., 2015], (si veda il disegno dello studio in Tabella suplementare 3) e quindi arrivando

all’esecuzione di più di una serie di qRT-PCR per valutare l’espressione di un miRNA nell’ambito dello stesso studio. Quindi è stato attribuito un valore a ciascun miRNA assegnando un punteggio a

ciascuna delle 4 caratteristiche. Abbiamo adottato poi la suddivisione in quartili, che permette di dividere una serie ordinata di dati in quattro parti uguali, per settare una scala di valori a cinque punti per assegnare un punteggio al numero di campioni utilizzati per la controparte sana e malata. In breve, ad ogni caratteristica è stato dato un punteggio in base a quale quartile della distribuzione occupava: 0, per il valore più basso (Min); 1, per il quartile inferiore (Q1); 2, per il quartile indicante la mediana (Q2); 3, per il quartile superiore (Q3); e 4, per il valore più alto (Max). Tuttavia, poiché i quartili sono tipicamente calcolati per liste con un minimo di 20 elementi, ranking in quartili è stato utilizzato solo per assegnare uno score al numero di campioni di MM o di campioni normali utilizzati per l’analisi di ogni miRNA. Per assegnare un punteggio al numero di saggi qRT-PCR eseguiti è stat utilizzata una scala 0-4, assegnando il valore 0 ad 1 saggio di qRT-PCR; il valore 1 a 2 saggi di qRT-PCR; il valore 2 a 4 saggi di qRT-PCR; il valore 3 a 5 saggi di qRT-PCR; ed il valore 4 a 6 saggi di qRT- PCR. Infine, per considerare il numero di studi che avevano riportano lo stesso miRNA, è stato assegnato 1 punto se il miRNA era stato riportato come differenzialmente espresso in un solo lavoro, e 2 punti se era stato riportato da due lavori. I punteggi ottenuti nella valutazione delle quattro caratteristiche sono stati sommati per ottenere il valore finale di ogni miRNA ed in seguito è stata nuovamente calcolata la suddivisione in quartili della distribuzione dei valori ottenuti. Le seguenti tabelle (Tabella 2 e 3) mostrano il metodo di scoring appena illustrato rispettivamente per i miRNA tissutali e miRNA circolanti. I risultati sono riportati in un diagramma box and whiskers plot, in cui ogni punto rappresenta un miRNA (Figura 13). I miRNA appartenenti a gruppi Q3 e Max sono stati considerati come i più significativi. Le caratteristiche del metodo sono state stabilite a priori da tre ricercatori.

Tabella 2. “Scoring table” dei miRNA da campioni tissutali ottenuti da qRT-PCR.

Note: I miRNA sono stati valutati in base al numero totale dei campioni, sani e tumorali, impiegati nell’analisi tramite

qRT-PCR, in base al numero di saggi di qRT-PCR effettuati ed, in fine, in base al numero di articoli che riportavano lo stesso miRNA. Pero ogni miRNA sono riportati l’Accession Number e l’identificativo unico (ID) in accord all’ultima release di miRBase (miRBase v21).

No. of qRT-PCR: numero totale delle analisi di qRT-PCR descritte negli studi e lo score corrispondente (qRT-PCR score); MM: numero dei campioni di MM usati nell’analisi di qRT-PCR e lo score corrispondente (MM score); H:

numero dei campioni sani usati nell’analisi di qRT-PCR e lo score corrispondente (H score); Ref: numero del riferimento bibliografico degli articoli che fanno mensione dello stesso miRNA e lo score corrispondente (Ref score), I riferimenti bibliografici in parentesi sono numerate come nell’articolo originale da poco pubblicato [Micolucci L. et al., 2016];

miRNA Vote: score finale ottenuto per ogni miRNA addizionando I punteggi ottenuti valutando le caratteristiche sopra

Tabella 3. “Scoring table” dei miRNA da campioni ematici ottenuti da qRT-PCR.

Note: I miRNA sono stati valutati in base al numero totale dei campioni, sani e tumorali, impiegati nell’analisi tramite

qRT-PCR, in base al numero di saggi di qRT-PCR effettuati ed, in fine, in base al numero di articoli che riportavano lo stesso miRNA. Pero ogni miRNA sono riportati l’Accession Number e l’identificativo unico (ID) in accord all’ultima release di miRBase (miRBase v21).

No. of qRT-PCR: numero totale delle analisi di qRT-PCR descritte negli studi e lo score corrispondente (qRT-PCR score); MM: numero dei campioni di MM usati nell’analisi di qRT-PCR e lo score corrispondente (MM score); H:

numero dei campioni sani usati nell’analisi di qRT-PCR e lo score corrispondente (H score); Ref: numero del riferimento bibliografico degli articoli che fanno mensione dello stesso miRNA e lo score corrispondente (Ref score), I riferimenti bibliografici in parentesi sono numerate come nell’articolo originale da poco pubblicato [Micolucci L. et al., 2016];

miRNA Vote: score finale ottenuto per ogni miRNA addizionando I punteggi ottenuti valutando le caratteristiche sopra

descritte [Micolucci L et al., 2016].