Come riportato in Tabella 15A, Grafico 10A, l’esposizione per 10 gg delle
cellule staminali CD34+ in presenza di un’elevata concentrazione di acidi grassi e
glucosio sembra modulare prevalentemente il processo di apoptosi. In particolare, sia nelle cellule di T1DM che di T2DM, il tasso di apoptosi è risultato significativamente maggiore rispetto ai ND, sia dopo coltura in presenza di FFA 0.5 mmol/l che Glucosio 22.2 mmol/l (*=p<0.05 vs 0 gg senza FFA o iperglicemia; #=p<0.05 vs ND. Test di Bonferroni). Alle nostre condizioni sperimentali, sia l’iperglicemia che l’ipernefemia non inducono variazioni significative nel tasso di necrosi (Tabella 15B, Grafico 10B).
# * # * # # *# #* 0 5 10 15 20 25 10gg 10gg + G 10gg + FFA Apo p to si (Ann e ssi n a, O. D ., Unità A rb itr ar ie ) ND T1DM T2DM
A Apoptosi (Annessina, O.D., Unità Arbitrarie)
10gg 10gg + Glucosio 22.2 mmol/l 10gg + FFA 0.5 mmol/l
ND 0.995 ± 0.118 0.925 ± 0.139 0.827 ± 0.074
T1DM 11.927 ± 0.322# 16.310 ± 0.064*# 21.42 ± 0.250*# T2DM 16.191 ± 0.151# 15.616 ± 1.114*# 17.31 ± 0.146*#
72
Tabelle 15 A e B , Grafico 9 A e B. Valutazione del tasso di apoptosi (tabella A, Grafico A) e necrosi (tabella B, Grafico B) in cellule CD34+ isolate da soggetti ND, T1DM e T2DM dopo 10gg di espansione nel terreno di coltura StemLine II in presenza o meno di FFA 0.5 mmol/l o Glucosio 22.2 mmol/l. Il tasso di apoptosi è significativamente maggiore rispetto ai ND, sia dopo coltura in presenza di FFA 0.5 mmol/l che Glucosio 22.2 mmol/l (*=p<0.05 vs 10 gg senza FFA o iperglicemia; #=p<0.05 vs ND. Test di Bonferroni). L’iperglicemia e l’ipernefemia, invece, non inducono variazioni significative nel tasso di necrosi. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 10gg 10gg + G 10gg + FFA N ec ro si ( Pr o p id io , O.D ., Un ità Ar b itr ar ie ) ND T1DM T2MD
B Necrosi (Propidio, O.D., Unità Arbitrarie) 10gg 10gg + Glucosio 22.2 mmol/l 10gg + FFA 0.5 mmol/l ND 0.192 ± 0.025 0.169 ± 0.022 0.127 ± 0.013 T1DM 0.35 ± 0.005 0.25 ± 0.004 0.30 ± 0.008 T2DM 0.047 ± 0.006 0.098 ± 0.025 0.081 ± 0.05
73
CAPITOLO 5 Conclusioni
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare il ruolo della lipotossicità e della glucotossicità, perturbazioni metaboliche tipiche del diabete mellito tipo 1
e 2, nell’attività proliferativa e nella vitalità di cellule staminali CD34+. Come
accennato precedentemente, l’ipotesi che stava alla base di questo studio era che alterazioni funzionali del pool di cellule staminali residenti negli organi e di quello circolante nel sangue, potessero essere fattori determinanti nell’insorgenza e sviluppo del diabete e delle sue complicanze. In particolare, in questo progetto, è stato studiato l’effetto della patologia diabetica e di perturbazioni metaboliche che potevano avere un ruolo negativo sulla replicazione di cellule multipotenti in grado, potenzialmente, di mantenere in vivo il numero di beta cellule pancreatiche che viene inesorabilmente ridotto nel diabete.
In questi ultimi anni, numerose ricerche hanno identificato una quantità di varianti genetiche che potrebbero predisporre all’insorgenza del diabete e alla ridotta funzionalità delle beta-cellule pancreatiche, ma questa predisposizione potrebbe essere aggravata dagli effetti tossici dell’iperglicemia (glucotossicità) e dell’ipernefemia (lipotossicità).
Un aumento cronico di glucosio plasmatico danneggia sia l'azione che la secrezione di insulina e questi effetti sono stati dimostrati su modelli animali parzialmente pancreasectomizzati, dove solo con la somministrazione di un farmaco antiglicemico la secrezione e l’azione ormonale sono ritornati a valori
normali46. Il deleterio effetto della glucotossicità sembra essere mediato da un
aumento dello stress ossidativo dovuto a una maggiore produzione di specie
reattive dell'ossigeno47. Inoltre, isole pancreatiche dopo esposizione cronica a
iperglicemia hanno mostrato un aumento del tasso di apoptosi, frammentazione del DNA citoplasmatico e incremento dell’espressione genica della caspasi 3
74
(proteasi pro-apoptotica)48. Inoltre, i livelli plasmatici di nitrotirosina e 8-idrossi-
2'-deossiguanosina, due marker dello stress ossidativo, nei pazienti diabetici tipo
2 sono significativamente maggiori rispetto ai soggetti sani49, risultando
inversamente correlati alla secrezione insulinica indotta dal glucosio. Infine, la glucotossicità può indurre stress a livello del reticolo endoplasmatico in cellule beta-pancreatiche sensibili, anche se sembra che questo avvenga solo nei soggetti diabetici e non in quelli di controllo.
E’ stato ampiamente dimostrato come un’esposizione cronica delle cellule beta-pancreatiche a FFA susciti molteplici meccanismi di tossicità, tra cui accumulo di malonil-CoA, una maggiore ossidazione e esterificazione degli acidi grassi, aumento della sintesi di ceramide, incermenteo del tasso di apoptosi e
aumento dello stress ossidativo a livello del reticolo endoplasmatico50. In
particolare, un’esposizione prolungata a acidi grassi causa una frammentazione del DNA, un’attività maggiore della caspasi 3 e un aumento dell’espressione di geni pro-apoptotici, simile a quella osservata con l’iperglicemia. In particolare, sembra che l’effetto apoptotico degli FFA sia mediato da una diminuzione del messaggero per il gene anti-apoptotico BCl-2, senza variazioni significative per
BAX51.
Attualmente non sono presenti in letteratura studi riguardanti gli effetti degli FFA o dell’iperglicemia sull’espansione e vitalità delle cellule staminali. Come è noto, il potenziale delle terapie con cellule staminali per il trattamento del diabete rappresenta una delle principali linee di ricerca attuali in questo settore. Tuttavia, alcuni autori hanno osservato sia nei pazienti affetti da diabete mellito di tipo 1 che di tipo 2 una riduzione di circa il 40-50% nel numero delle
Cellule Progenitrici Endoteliali (EPCs) circolanti 52 , 53. Alle nostre condizioni
sperimentali, il pool di cellule staminali adulte isolabili da sangue periferico è del tutto simile nei pazienti diabetici rispetto a quelli sani: questo rappresenta un dato importante poiché dimostrerebbe che, in qualsiasi condizione patologica, si potrebbe essere in grado di avere a disposizione un numero sufficiente di cellule
75
beta-cellule. Allo stesso tempo siamo riusciti a replicare in vivo il pool iniziale e, anche in questo caso, l’andamento era simile sia per soggetti sani che diabetici. Il fatto che le staminali di donatori sani e diabetici si espandano alla stessa velocità e con lo stesso numero di cicli di replicazione, potrebbe significare che, un’eventuale differenza osservata in vivo, potrebbe essere dovuta al loro ambiente naturale in presenza di perturbazioni metaboliche associate, nel nostro caso, alla patologia del diabete. Per questo motivo, la seconda fase dello studio
ha riguardato l’esposizione in cronico di cellule CD34+ sia a elevata
concentrazione di acidi grassi liberi sia a iperglicemia. Il dato interessante è che, solo nei soggetti T2DM, la presenza di ipernefemia e iperglicemia induce a una riduzione del numero di cellule espanse, a indicare una maggiore suscettibilità rispetto sia ai soggetti sani che T1DM. Questo risultato potrebbe vedere gli FFA non come causa diretta ma come un cofattore che in grado di attivare una specifica via intracellulare. Tuttavia, l’effetto deleterio di FFA e glucosio lo abbiamo osservato sulla riduzione della vitalità cellulare: anche in questo caso, molto probabilmente, il dato potrebbe indicare l’attivazione, o l’inibizione, di più vie cellulari legate alla presenza in concentrazioni eccessive di glucosio o acidi grassi.
Per questo motivo, abbiamo voluto indagare attraverso quali vie potessero agire FFA e glucosio e i dati presentati in questa tesi hanno dimostrato, per la
prima volta, che cellule staminali CD34+ esprimono un recettore di membrana
specifico per gli FFA: il GPR40. Questa proteina transmembranale è stata studiata, nel nostro laboratorio, in isole pancreatiche umane e la sua espressione sembra essere direttamente correlata sia alla funzionalità che la vitalità della beta cellula. Infatti, nelle isole pancreatiche di pazienti diabetici tipo 2, il messaggero è marcatamente ridotto rispetto ai soggetti sani e inversamente
correlabile alla secrezione insulinica e al tasso di apoptosi54. Nel nostro modello
cellulare, la presenza degli acidi grassi induce un aumento significativo del messaggero per GPR40 solo nei soggetti con diabete mellito tipo 2, rispetto ai controlli. Questo potrebbe essere associato a una condizione di ipernefemia che,
76
in vivo, è frequentemente presente in questo tipo di pazienti, cosa che, generalmente, non si verifica per il tipo 1: in questo senso, molto probabilmente, incide anche una componente genetica fortemente presente nel diabete mellito insulino-indipendente.
Parallelamente al dato del recettore di membrana abbiamo valutato la modulazione, da parte degli acidi grassi, di un recettore nucleare, il Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma2 (PPAR-gamma 2), la cui espressione su
cellule stromali e mesenchimali è stata già parzialmente dimostrata da altri 55,56
(BIBLIO). Questo recettore è un membro della famiglia di fattori di trascrizione nucleare, un gruppo ampio e diversificato di proteine che mediano l’attivazione e l’inibizione di molti fattori di trascrizione. Il PPAR-gamma 2 svolge un ruolo importante nel controllo dello sviluppo degli adipociti e nel metabolismo degli
acidi grassi e del glucosio57. Alterazioni a livello di queste vie intracellulari
possono portare allo sviluppo di obesità, insulino-resistenza e diabete di tipo 2 58.
L'attivazione di questo recettore, inoltre, è essenziale per i processi vitali e può
modulare proliferazione, differenziamento e trasformazione neoplastica59.
Questo recettore nucleare ha come ligando specifico gli FFA ed è presente nelle isole pancreatiche umane: l’esposizione in cronico ad elevate concentrazioni di acidi grassi liberi induce una riduzione significativa dell’espressione di questo recettore e, parallelamente, un diminuzione della sintesi di insulina e un aumento del tasso di apoptosi. Quello che abbiamo osservato noi è in linea con la letteratura ma, allo stesso tempo, sorprendente: l’esposizione delle staminali a ipernefemia induce una significativa riduzione dell’espressione genica solo nelle cellule isolate da soggetti T1DM. Questo risultato ci induce a pensare che le vie attraverso cui agiscono, o potrebbero agire, gli acidi grassi sono differenti fra i pazienti T1DM e T2DM.
Per quanto riguarda l’iperglicemia, nelle CD34+ è presente il
glucotrasportatore GLUT2, ma quello che abbiamo osservato è che questo non sembra essere modulato da un’esposizione cronica ad elevate concentrazioni di
77
glucosio. Molto probabilmente, visti gli effetti osservati sulle cellule, questa non è l’unica via con cui il glucosio passa la membrana cellulare.
Da quanto visto in letteratura, all’alterazione del numero di cellule progenitrici circolanti, si associa l’accumulo di cellule senescenti che potrebbero giocare un ruolo importante sulle cellule staminali. La senescenza cellulare è regolata dai telomeri, specifiche strutture nucleo-proteiche alle estremità dei cromosomi eucariotici che svolgono almeno due funzioni essenziali: controbilanciano la replicazione incompleta del DNA terminale e proteggono le estremità cromosomiche da eventi di degradazione e fusione (capping), permettendo alla cellula di distinguere le porzioni terminali dei cromosomi da siti di rottura del DNA. Questi sono mantenuti a una lunghezza costante grazie alla telomerasi, una trascrittasi inversa specializzata che utilizza la sua componente ad RNA come stampo per allungare le eliche ricche in G. In questa tesi abbiamo
osservato, per la prima volta su cellule CD34+, un significativo accorciamento
telomerico nelle cellule isolate da pazienti T1DM e T2DM esposte, in cronico, a iperglicemia e ipernefemia. Parallelamente, anche la subunità catalitica dell’enzima telomerasi, che controlla la lunghezza dei telomeri, era marcatamente ridotta nelle staminali di pazienti diabetici esposte a perturbazioni metaboliche. Questo risultato, secondo noi, è molto interessante perché potrebbe giustificare la riduzione del pool di staminali che, molti autori, hanno dimostrato essere presente in vivo nei soggetti diabetici. Un accorciamento dei telomeri e un accumulo di cellule senescenti potrebbe esaurire i tessuti dei pool delle cellule staminali, o delle cellule progenitrici, e distruggere il loro microambiente, alterandone la proliferazione, la differenziazione e la mobilizzazione. Effetto, peraltro, parzialmente osservato in questo studio.
Al fine di completare il quadro del possibile ruolo dell’iperglicemia e dell’ipernefemia sulle cellule staminali, abbiamo indagato gli effetti su stress ossidativo e vitalità cellulare. Negli ultimi anni è stato ampiamente dimostrato il ruolo dello stress ossidativo nella regolazione del differenziamento cellulare, sia attraverso la produzione di specie chimiche derivanti sia dal danno per stress
78
ossidativo sia attraverso la regolazione di tioli critici di proteine quali recettori e fattori di crescita, condizioni particolarmente importanti per quanto riguarda le
cellule staminali 60. Allo stesso tempo, negli ultimi anni è stato evidenziato il
ruolo degli FFA e dell’iperglicemia nello sviluppo dello stress ossidativo e
nell’incremento del tasso di apoptosi nelle cellule staminali61. Alle nostre
condizioni sperimentali, solo gli acidi grassi sembrano modulare lo stress ossidativo nei soggetti diabetici, con un aumento significativo rispetto ai controlli. Questo risultato potrebbe essere spiegato con l’attivazione dei recettori nucleari PPAR-gamma 2 che, fra le altre cose, sembrano essere direttamente correlati con un aumento delle specie radicaliche dell’ossigeno.
Infine, il tasso di apoptosi è stato trovato essere significativamente più
elevato nelle cellule CD34+ di soggetti tipo 1 e tipo 2, rispetto a quelli sani. Anche
se il dato, di per se, poteva essere parzialmente atteso, quello che sorprende è la suscettibilità di queste cellule alle perturbazioni metaboliche tipiche del diabete, con un incremento del tasso di apoptosi dopo esposizione cronica a iperglicemia e ipernefemia. Per quanto riguarda l’esposizione a acidi grassi, l’effetto
sicuramente viene modulato attraverso l’attivazione dei recettori
transmembranali, GPR40, e nucleari, PPAR-gamma 2: il dato ancora da chiarire riguarda il meccanismo attraverso il quale agisce il glucosio poiché, nel nostro modello cellulare, non abbiamo osservato variazioni dell’espressione del glucotrasportatore GLUT2. Poiché in letteratura non ci sono dati certi riguardo
all’isoforma del GLUT presente su cellule CD34+, saranno necessari ulteriori studi
per indagare la via attraverso la quale l’iperglicemia esercita gli effetti negativi sulle cellule staminali.
In conclusione, lo studio portato avanti in questa tesi dimostra, per la prima volta, come un cattivo controllo metabolico nei pazienti diabetici potrebbe
alterare la replicazione e la funzionalità di cellule staminali CD34+. Come abbiamo
accennato, alcuni ricercatori pensano sia possibile attivare le cellule staminali già presenti nel pancreas del paziente per dare origine a nuove cellule beta: quello che abbiamo dimostrato noi è che, molto probabilmente, la presenza di
79
perturbazioni metaboliche rallenta o inibisce questo potenziale processo di sostituzione delle cellule dell’isola pancreatica. In particolare, questo effetto sembra essere mediato dagli acidi grassi. I risultati ottenuti in questo studio, anche se necessitano di ulteriori approfondimenti, aprono nuovi potenziali scenari di studio per la cura del diabete mellito.
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