In questo lavoro di tesi sono stati effettuati saggi per valutare se l’effetto antitumorale in vitro osservato per i composti di nuova sintesi fosse dovuto all’attivazione della morte cellulare programmata. Inizialmente, è stato valutato se il trattamento delle cellule tumorali con i composti di nuova sintesi inducesse aumento di morte cellulare. A tal fine, sono state contate il numero delle cellule morte in seguito a trattamento con i composti risultati più attivi nello screening iniziale, sia con concentrazioni crescenti dopo 1 giorno di trattamento, che con una concentrazione fissa (IC50) dopo vari tempi di esposizione (Fig.26). I grafici nella figura mostrano che i composti EB54 e EB56 inducono un aumento della percentuale delle cellule U87MG morte, rispetto alle cellule di controllo, sia in maniera tempo- che dose dipendente.
EB54 DMS O 100 nM 1 uM 2.5 uM 5 uM 10 u M 0 20 40 60 80 100 *** ***
a
* C e ll u le U 8 7 M G m o rt e (%v s c o n tr o ll o ) TRATTAMENTI DOSE-DIPENDENTI57 DMS O 4h 12h 24h 0 1 2 3 EB 54 5uM ** *** C e ll u le U 8 7 M G m o rt e
Per verificare che la morte osservata fosse dovuta all’attivazione di morte programmata abbiamo effettuato un analisi cito fluorimetrica con due fluorocromi che vengono comunemente utilizzati per rilevare i vari stadi di apoptosi.
EB56 5um DMS O 4h 12h 24h 0 1 2 3 * *** *** C e ll u le U 8 7 M G m o rt e
Fig. 26 Valutazione dell’induzione di morte cellulare in seguito al trattamento delle cellule U87MG con i composti EB54 o EB56: Le figure 22a e 22b mostrano le
percentuali delle cellule morte in seguito al trattamento con EB 54 o EB 56 rispetto alle cellule di controllo a cui è stato attribuito il valore uguale ad 1. Le percentuali delle cellule morte nel campione di controllo non superava il 5% delle cellule totali a ciascun tempo di incubazione. I valori medi sono stati confrontati con ANOVA e il test Bonferroni p<0.05 (*); p<0.005 (**);p<0.0005 (***).
TRATTAMENTI TEMPO-DIPENDENTI
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Fig.27 Il grafico mostra la distribuzione delle celle cellule rispetto alle condizioni vitali:
cellule vive, cellule in apoptosi precoce, cellule in apoptosi tardiva e cellule morte a causa di processi non apoptotici.
In seguito al trattamento di 24 ore delle cellule tumorali con i composti di nuova sintesi è stata osservata una riduzione nel numero delle cellule vive dopo trattamento con EB54. Dal momento che la precedente analisi del ciclo cellulare aveva evidenziato un arresto del ciclo in fase G2/M per le cellule trattate con tale composto, è logico supporre che la riduzione nel numero delle cellule vive per ml sia imputata ad arresto del ciclo. Il composto EB54, infatti, non ha indotto un aumento nel numero di cellule apototiche a 24 ore, né in fase precoce né in fase tardiva rispetto al controllo. Al momento si stanno effettuando prove a tempi più brevi di esposizione, per verificare se si realizzi il pathway apoptotico prima delle 24 ore.
Il composto EB56, in modo paragonabile a Nutlina-3, ha evidenziato un aumento di cellule in fase di apoptosi avanzata rispetto al controllo. Anche in questo caso sono in corso ulteriori esperimenti per poter valutare la significatività statistica del risultato ottenuto.
24 h
Cont rollo EB54 EB56 Nutli na-3 0 100000 200000 300000 EarlyApo LateApo Living C Dead C C e ll/m l Apoptosi precoce. Apoptosi avanzata. Cellule vive. Cellule morte.59
In conclusione, nel presente lavoro di tesi, è stato evidenziato che i composti di nuova sintesi a struttura fenil indol-gliossilammidica, EB54 ed EB56, sono risultati in grado di riattivare la funzione di transattivazione genica di geni target di p53, quale p21 e MDM2, nella linea cellulare di GBM umano U87MG. In seguito all’esposizione delle cellule tumorali con entrambi i composti è stata evidenziata una riduzione dose e tempo- dipendente della sopravvivenza/proliferazione cellulare. L’analisi del ciclo cellulare ha evidenziato che i composti portano le cellule ad un blocco del ciclo in fase G2/M, in particolare il composto EB54. Tale blocco non è irreversibile in quanto in seguito al trattamento con i composti di nuova sintesi non sono stati osservati marker di senescenza cellulare, diversamente dallo standard Nutlina-3. Infine, gli esperimenti di valutazione della morte apoptotica hanno evidenziato come, in particolare, il composto EB56 sia in grado di indirizzare le cellule verso un processo di morte programmata.
L’insieme di questi dati, indirizza il proseguimento delle indagini sia dal punto di vista sintetico che biochimico utilizzando i composti EB quali lead per lo sviluppo di nuovi derivati variamente sostituiti e funzionalizzati.
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