VARIANTI IDENTIFICATE NEI GENI GP1BA, GP1BB E GP9

Nei 120 pazienti sono stati analizzati i geni GP1BA, GP1BB e GP9 mediate PCR e sequenziamento Sanger. L’analisi ha permesso di individuare 13 varianti in eterozigosi: 5 nel gene GP1BA, 6 in GP1BB e 2 in GP9 (Tabella 5).

Delle 13 varianti identificate, quattro sono potenzialmente patogenetiche (1 nonsense, 2 frameshift e una a livello del codone di inizio), mentre le altre sono sostituzioni amminoacidiche.

La sola mutazione nonsense identificata è p.Lys483* che produce una subunità GP1bα tronca a livello della porzione extracellulare. Basandoci sui dati della letteratura [Ware et al., 1990; Kunishima et al., 1994; Yamamoto et al. 2013] è ipotizzabile che la proteina priva della

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porzione transmembrana sia incapace di assemblarsi nel complesso o di ancorarsi alla membrana con conseguente degradazione.

Potrebbe pertanto trattarsi di aploinsuffcienza anche se sarà importante capire perché la proteina prodotta dall’allele wild type non sia sufficiente a garantire un fenotipo sano come atteso nelle condizioni autosomiche recessive. Per questo motivo non è da escludere un effetto dominante negativo con interferenza della subunità mutata nella formazione del complesso, aspetto che solo gli studi funzionali potranno accertare.

Nel corso delle analisi sono state identificate 2 mutazioni di frameshift: la delezione di una base c.104del nel gene GP1BA (BSSA2_3) che colpisce il dominio proteico LRRNT e la duplicazione di una base c.491dup nel gene GP1BB (BSSA2_13), variante presente nella porzione transmembrana. Si tratta di mutazioni note, descritte in pazienti con BSSA1: in particolare la variante c.104del è stata riportata in tre affetti [Li et al., 1996; Savoia et al., 2014] mentre la c.491dup è stata ritrovata in omozigosi in un solo paziente [Savoia et al., 2011].

Nella famiglia BSSA2_3 (Figura 1) abbiamo analizzato 5 componenti della famiglia. In accordo con la segregazione, dall’analisi è emerso che la variante c.104del è presente solo negli individui affetti. Tra questi l’individuo II-1, che presenta un fenotipo più grave rispetto ai familiari ma non così grave come nelle forme BSSA1, abbiamo identificato una seconda variante c.13_15delCTC (p.Leu10del) che rimuove unamino acido nel peptide segnale. Poiché tale variante è stata trasmessa dalla madre I-2 anche all’individuo II-3, entrambi asintomatici, è probabile che la mutazione p.Leu10del sia una variante ipomorfica. Rimane comunque da chiarire se la delezione p.Leu10del in associazione con la mutazione frameshift possa aggravare il fenotipo della paziente II-1. Per rispondere a tale domanda è necessario prima di tutto approfondire gli esami clinici in tutta la famiglia e successivamente mettere a punto degli studi funzionali per capire l’effetto della variante p.Leu10del.

Nella famiglia del probando BSSA2_13 la variante c.491dup, presente nel gene GP1BB, è presente solo negli individui affetti. Visto che l’alterazione avviene a livello del dominio transmembrana, è plausibile ipotizzare un effetto dominante negativo, che anche in questo caso solo gli studi funzionali sveleranno.

Per la variante c.2T>G nel gene GP1BB sarà interessante determinare se la proteina è assente oppure se durante la traduzione sarà riconosciuto codone di inizio a valle per la sintesi di una subunità GPIbβ priva della porzione N-terminale, il cui significato biologico andrà successivamente indagato.

30 FIGURA 1. Albero genealogico della famiglia BSSA2_3. Le mutazioni sono presenti nel gene GP1BA. L’allele wild type è segnato con il simbolo +, la mutazione c.104del è indicata con Fs mentre la variante c.13_15del è indicata con Leu10del nell’albero. L’individuo II-1 presenta entrambe le varianti, , una ereditata dal padre piastrinopenico l’altra dalla madre asintomatica.

In 11 pazienti sono state identificate 9 varianti missense: 3 nel gene GP1BA, 4 nel gene GP1BB e 2 nel gene GP9. Tranne che per p.Asn89Thr (GP1BB) [Strassel et al.,2003], identificata in omozigosi in un paziente BSSA1, tutte le alterazioni non sono mai state descritte.

Per stabile quali sono le varianti potenzialmente patogenetiche abbiamo condotto degli studi in silico e di segregazione. Per prima cosa abbiamo verificato che le varianti non fossero riportate come SNP. Le uniche varianti presenti nel dbSNP sono la p.Val31Ala nel gene GP1BA (rs201827537) e la p.Pro123Leu nel gene GP9 (rs202229101) entrambe però rare e prive del valore di MAF (Minor Allele Frequency). Abbiamo inoltre utilizzato dei programmi predittivi, quali Mutation Assessor, Mutation Taster, PolyPhen2, SIFT. I programmi utilizzano diversi algoritmi di predizione e per tale motivo è stato convertito ogni risultato in un valore compreso tra 0 e 2 (Vedi Materiali e Metodi). Lo score di patogenicità è stato poi calcolato sommando i valori ottenuti dall’applicazione dei programmi predittivi, considerando patogenetiche le varianti con score ≥4. Dall’analisi bioinformatica è emerso che 8 delle 9 varianti missense presentano uno score maggiore di 4 e quindi risultano potenzialmente patogenetiche, la variante p.Pro123Leu è invece considerata benigna (Tabella 5).

Stabilita la patogenicità delle varianti con i tools bioinformatici, abbiamo eseguito lo studio di segregazione. Per i probandi BSSA2_2, BSSA2_9, BSSA2_10, BSSA2_11, BSSA2_14 e BSSA2_15 non è stato possibile reperire il DNA dei famigliari . La segregazione è confermata nelle famiglie dei probandi, BSSA2_5, BSSA2_7, BSSA2_8, BSSA2_12 ma non in BSSA2_1

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e BSSA2_4 . Infatti se osserviamo l’albero genealogico della famiglia BSSA2_1, (figura 2) il probando BSSA2_1 (II-2) ha ereditato la variante p.Val31Ala dalla madre I-2 che però risulta sana (conta piastrinica 177x10⁹/L) considerando la soglia di 150x10⁹/L 150. La stessa variante è trasmessa alla sorella II-3, anche lei sana (conta piastrinica 200x10⁹/L). E’ noto però che il numero delle piastrine è più elevato nelle femmine rispetto ai maschi e nei giovani rispetto agli adulti e agli anziani (Balduini et al., 2014), aspetto che dovrebbe essere valutato nella definizione della condizione piastrinopenica.

Nella famiglia BSSA2_4 invece, la p.Pro46Leu è presente nel probando (I-1) e in tutti i figli affetti (II-2, II-4) tranne nella figlia II-3 che ha un numero di piastrine inferiore alla soglia (Figura 2). E’ quindi possibile che il gene che causa la piastrinopenia in questa famiglia non sia GP1BA.

Figura 2. Alberi genealogici delle famiglie BSSA2_1 e BSSA2_4. In entrambe le famiglie le varianti sono presenti nel gene GP1BA. Il probando è indicato con la freccia, mentre il nucleotide mutato è in grassetto rosso. Osservando gli alberi di entrambe le famiglie si osserva come le varianti non segregano negli individui affetti.

L’utilizzo dei programmi predittivi e contemporaneamente lo studio di segregazione si rivelano degli utili strumenti per la valutazione della patogenicità di una variante missense. Tra quelle identificate in questo studio, 8 sono state indicate come patogenetiche dai programmi. In 5 famiglie sono stati condotti gli studi di segregazione che hanno confermato la patogenicità solo in tre casi. Osservando i dati raccolti nella tabella 4, p.Ile203Thr (GPIbα), come pure p.Leu60Pro e p.Tyr131Cys (GPIbβ), possono essere considerate varianti patogenetiche in quanto sia il dato bioinformatico sia quello genetico concordano.

Per p.Leu75Gln e p.Asn89Thr, anche se i dati di segregazione non sono disponibili, lo score predittivo di patogenicità è elevato. Inoltre la variante p.Asn89Thr era stata identificata in un paziente BSSA1, nel quale la proteina risultava stabile nel reticolo endoplasmatico ma non espressa sulla superficie della cellula [Strassel et al.,2003].

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L’alterazione p.Gly129Ser invece, ha uno score di 5 ma è priva del dato di segregazione e quindi di più difficile interpretazione. Delle altre tre varianti, due p.Val31Ala e p.Pro46Leu, nonostante uno score di patogenicità di 5 non segregano perfettamente nelle rispettive famiglie. Infine, con uno score molto basso e in assenza del dato di segregazione, consideriamo p.Pro123Leu non patogenetica. In conclusione, sei delle 9 varianti missense sono probabilmente responsabili della piastrinopenia.

Solo gli studi funzionali ci consentono di stabilire con accuratezza il ruolo delle varianti nella malattia e per questo è necessario procedere in questo senso. Sono stati generati i costrutti mutati ai singoli loci per le transfezioni in cellule CHO che esprimo stabilmente i geni del complesso. Gli esperimenti sono in corso e quindi non sono disponibili dei dati. Tuttavia se gli studi funzionali, in combinazione con i dati clinici, dovessero confermare la patogenicità almeno delle sei varianti designate come patogenetiche sulla base dei dati bioinformatici e/o di segregazione, 11 su 120 probandi (9%) sarebbero da considerarsi affetti da BSSA2. Questo rappresenta l’unico lavoro che sta cercando di stabilire la frequenza di BSSA2 tra le forme di piastrinopenia ereditaria. Se i dati fossero confermati, considerando anche l’ elevata frequenza della mutazione p.Ala172Val, la BSSA2 risulterebbe una tra le forma di piastrinopenia ereditaria più frequente in Italia.

33 Family ID ^{GP1BA NM_000173.5}

cDNA mutation

Protein

in GPIbα ^Mutation type

Pathogenicity score using bioinformatic

tools

Pathogenicity

on genetic basis ^Reference

BSSA2-1 _{(rs201827537)} ^c.92T>C p.Val31Ala missense 5 NP Novel

BSSA2_2 _{(rs201827537)} ^c.92T>C p.Val31Ala missense 5 ND Novel

BSSA2_3 c.104delA p.Lys35Argfs*4 frameshift P Li et al., 1996

BSSA2_4 c.137C>T p.Pro46Leu missense 5 NP Novel

BSSA2_5 c.608T>C, p.Ile203Thr missense 7 P Novel

BSSA2_6 c.1447A>T p.Lys483* nonsense ND Novel

Family ID ^{GP1BB NM_000407.4} cDNA mutation

Protein

in GPIbβ ^Mutation type ^Reference

BSSA2_7 c.2T>G p.Met1? start codon P Novel

BSSA2_8 c.179T>C p.Leu60Pro missense 8 P Novel

BSSA2_9 c.179T>C p.Leu60Pro missense 8 ND Novel

BSSA2_10 c.224T>A p.Leu75Gln missense 7 ND Novel

BSSA2_11 c.266A>C p.Asn89Thr missense 7 ND Strassel et al., 2003

BSSA2_12 c.394A>G p.Tyr131Cys missense 6 P Novel

BSSA2_13 c.491dup p.His164Glnfs*145 frameshift P Savoia et al, 2011

Family ID ^{GP9 NM_000174.3} cDNA mutation Protein in GPIX Mutation type ^Reference

BSSA2_14 _{(rs202229101)} ^c.368C>T p.Pro123Leu missense 2 ND Novel

BSSA2_15 c.385G>A p.Gly129Ser missense 5 ND Novel

Tabella 5. Varianti identificate nei pazienti con sospetta diagnosi di BSSA2. Le varianti p.Val 31Ala nel gene GP1BA e p.Pro123Leu nel gene GP9 presentano un rs in quanto sono presenti nel dbSNPs. La colonna Pathogenicity score riporta gli score solo per le 9 varianti missense. I dati di segregazione sono disponibili per 8 famiglie, in particolare in due famiglie (BSSA2_1, BSSA2_4) la variante non segrega negli affetti. La maggior parte sono mutazioni nuove mai descritte tranne per la mutazione c.104del nel gene GP1BA descritta in Li et al., 1996, e le mutazioni la p.Asn89Thr e c.491dup del gene GP1BB presenti rispettivamente in Strassel et al., 2003 e Savoia et al. ,2011. [P=patogenetica, NP=non patogenetic, ND=non determinata].

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