Visualizzazione dell’attività elettrocatalitica di Blu di Prussia in presenza di enzima GOx (GC/PB/GOx)

Lo stesso principio descritto nel precedente paragrafo, ossia rivelazione di H2O2 alla tip per ossidazione e competizione da parte di PB per riduzione, è stato applicato ad un campione più complesso. L’idea di base era quella di produrre H2O2 localmente, invece di aggiungerla a PBS prima dell’inizio della scansione. Questo obiettivo poteva essere raggiunto immobilizzando un enzima appartenente alla classe delle ossidasi direttamente sullo spot di PB: in presenza di O2, l’ossidazione del substrato enzimatico avrebbe portato localmente alla formazione di H2O2. Come elemento biologico è stato scelto un enzima modello, la glucosio ossidasi (GOx).

Per immobilizzare stabilmente l’enzima ed impedire che venisse rilasciato in soluzione per effetto della lunga permanenza in soluzione (i tempi di scansione nella SECM spesso superano le 2 ore) e degli effetti convettivi, seppur minimi, causati dal movimento della tip, è stato impiegato il polimero commerciale Resydrol.

L’obiettivo consisteva nel verificare come l’attività elettrocatalitica del PB sottostante l’enzima influenzasse la quantità di H2O2 in grado di raggiungere la tip. Per riuscire a visualizzare l’effetto della competizione da parte dello spot attivo di PB, si è pensato di istituire un confronto fra due scansioni sequenziali. Nella prima prova si sarebbe applicato al campione un potenziale a cui il Blu di Prussia non fosse attivo: in questo caso, per aggiunta di glucosio, era prevedibile che la quantità di H2O2 rivelata alla tip fosse la massima possibile. Questo schema coincide, in pratica, con quello di un esperimento SECM in modalità SG/TC. Nella seconda prova si sarebbe applicato un

potenziale a cui lo spot fosse elettrocataliticamente molto attivo, quindi esercitasse una energica azione di competizione nei confronti della tip: ci si attendeva una corrente di ossidazione inferiore, rispetto a quella della prima prova (Figura 4.46).

L’informazione sulla attività elettrocatalitica può essere estratta solo per confronto fra le due prove, perchè l’incremento di corrente atteso in corrispondenza dello spot è differente, ma il profilo di corrente è identico.

Figura 4.46 – Sinistra: rappresentazione schematica della modalità RC-SECM impiegata per la visualizzazione dell’attività elettrocatalitica di PB, depositato su GC in presenza di GOx. Destra: profili di corrente attesi.

Sono state testate diverse condizioni sperimentali, fino a giungere ad un risultato soddisfacente, in pieno accordo con le previsioni teoriche formulate:

1. Rivelazione con potenziale costante

Alla tip è stato applicato un potenziale costante pari a +0.6 V vs. Ag/AgCl. Al substrato sono stati applicati i potenziali di +0.25 V, a cui il PB è inattivo, e -0.05 V, a cui il PB esercita l’azione di competizione verso la tip.

Le scansioni effettuate per i due diversi valori di potenziale applicato al substrato e il confronto degli incrementi di corrente attraverso lo spot sono riportati nelle Figure 4.47 - 4.49.

Figura 4.47 – Scansione SECM (corretta per sottrazione di background) di spot di PB depositato su GC

in presenza di GOx. EGC = +0.25 V vs. Ag/AgCl; ET = +0.6 V = costante. Soluzione: PBS 0.1 M a pH 6.0

+ glucosio 10 mM. Distanza tip/substrato = 10 μm, velocità di scansione = 40 μm/s, RG tip = 4.5.

Figura 4.48 – Scansione SECM (corretta per sottrazione di background) di spot di PB depositato su GC

in presenza di GOx. EGC = -0.05 V vs. Ag/AgC; ET = +0.6 V = costante. Soluzione: PBS 0.1 M a pH 6.0

0 200 400 600 800 1000 1200 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ico rr (nA) X (µm) E_GC = +0.25 V E_GC = -0.05 V

Figura 4.49 – Confronto dei profili di corrente registrati attraverso gli spot di PB per EGC = -0.05 V

(triangoli) e +0.25 V (cerchi) vs. Ag/AgCl.

2. Rivelazione con profilo di potenziale a impulsi

Dopo il primo promettente risultato, si è passati alla rivelazione di H2O2 alla tip con un profilo di impulsi di potenziale semplice, già impiegato in precedenza, costituito da un potenziale di base e uno di acquisizione.

L’immagine ottenuta dopo una scansione non ha, però, evidenziato alcuna variazione di corrente, rispetto a quella di background.

Questo risultato può essere facilmente compreso pensando che la tip, posizionata a piccola distanza dalla superficie del campione, esercita una azione di “schermo” per la diffusione dei reagenti verso l’enzima (Figura 4.50). Nelle condizioni sperimentali adottate, la concentrazione di O2 (co-substrato enzimatico) disciolto in soluzione era bassa e l’accesso del glucosio (substrato enzimatico) al sito attivo della GOx difficoltoso: la velocità di reazione era limitata e la quantità di H2O2 che riusciva a raggiungere la tip scarsa.

Figura 4.50 – Rappresentazione schematica dell’effetto di schermo esercitato dall’involucro di vetro

3. Rivelazione con profilo di potenziale a impulsi modificato e concentrazione di glucosio incrementata

Per le motivazioni esposte, le condizioni sperimentali sono state modificate, aumentando la concentrazione di glucosio in soluzione da 10 a 100 mM. Anche lo schema di rivelazione è stato migliorato (Figura 4.51): un breve impulso di potenziale a +1.2 V (Einj) è stato aggiunto prima della fase di acquisizione, per fornire una “iniezione locale” di O2 per ossidazione dell’acqua.

Figura 4.51 – Profilo di impulsi di potenziale ottimizzato per la visualizzazione dell’attività elettrocatalitica di spot di PB+GOx in modalità RC-SECM.

I potenziali applicati al substrato sono +0.4 V (PB inattivo) e -0.05 V (PB attivo). Le scansioni SECM ottenute in queste condizioni sperimentali e i profili di corrente corrispondenti sono riportati nelle Figure 4.52 – 4.54.

Figura 4.52 – Scansione SECM (corretta per sottrazione di background) di spot di PB depositato su GC

in presenza di GOx. EGC = +0.40 V vs. Ag/AgCl. Soluzione: PBS 0.1 M a pH 6.0 + glucosio 100 mM.

Figura 4.53 – Scansione SECM (corretta per sottrazione di background) di spot di PB depositato su GC

in presenza di GOx. EGC = -0.05 V vs. Ag/AgCl. Soluzione: PBS 0.1 M a pH 6.0 + glucosio 100 mM.

Distanza tip/substrato = 10 μm, velocità di scansione = 25 μm/s, RG tip = 4.5.

0 400 800 1200 1600 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 i (nA ) X (µm) E_GC = +0.40 V E_GC = -0.05 V

Figura 4.54 – Confronto dei profili di corrente registrati attraverso gli spot di PB+GOx per EGC = -0.05

V (triangoli) e +0.40 V (cerchi) vs. Ag/AgCl.