VISUALIZZAZIONE DEI CROMATOGRAMM

A differenze delle altre tecniche cromatografiche le TLC offrono l’opportunità unica di visualizzare i risultati direttamente ad “occhio nudo” senza l’ausilio di particolare strumentazione.

Infatti le sostanze colorate si vedono direttamente sul piatto ed anche quelle che assorbono alla luce UV a 254 nm è possibile vederle grazie all’ausilio di un indicatore fluorescente che imbibisce la fase stazionaria (F254) e che può essere eccitato a fluorescere con una lampada UV.

Esistono anche piatti con indicatori a 366 nm e sostanze che non necessitano di derivatizzazione in quanto emettono a 366 nm se eccitate con una lampada UV.

In definitiva i cromatogrammi si possono valutare: All’interno del visibile

Alla luce UV 366 nm Alla luce UV 254 nm

5.11. DENSITOMETRIA

Il principale vantaggio di usare un apparecchio in grado di valutare la densità di una massa è dato dalla possibilità di poter quantificare le sostanze separate.

Questa è infatti la richiesta primaria per il salto di qualità che la cromatografia planare doveva fare per poter essere definita anche “moderna” e quindi uno strumento affidabile e confrontabile con altre tecniche maggiori come l’HPLC e la GC.

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Principi fisici di misura

Quando la luce colpisce la superficie di uno strato sottile, costituito da piccole, sferiche ed irregolari particelle di gel di silice può essere

Assorbita Riflessa Dispersa

Nel densitometro, un fascio di luce di forma e dimensione ben definite, colpisce lo strato sottile verticalmente.

Fig.27 Schema del sistema ottico del CAMAG TLC Scanner 3

Sorgenti luminose

Selettore della lampada

Sistema di lenti di ingresso: intervallo

di trasmissione 190 – 800 nm

Fenditura di ingresso del monocromatore

Momocromatore a reticolo di riflessione: ampiezza di banda

selezionabile 5 o 20 nm

Specchio

Disco con fenditure

Specchio

Sistema di lenti: selezionabile per

micro e macro fenditure

Fotomoltiplicatore di riferimento Separatore del raggio Fotomoltiplicatore di misura: riflettanza a 30°

Lastra cromatografica: viene

colpita perpendicolarmente

Fotodiodo di misura: per la

scansione in modalità trasmissione

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Il detector è disposto a 45° rispetto al fascio incidente e di tutta la luce che raggiunge il piatto solo una piccola ma costante porzione può essere misurata ed è quella che raggiunge il detector.

Questa modalità di misura è nota come remissione (riflessione).

Quando il piatto si muove, la porzione di luce che raggiunge il detector permette la registrazione di una linea di base in funzione della posizione; tale valore corrisponde al 100% di riflessione che per essere riportato su di un grafico bidimensionale come sono i cromatogrammi è convertito a zero. Se c’è una sostanza in grado di assorbire la luce incidente il segnale che si genera al detector è più basso e dopo inversione sul grafico si genera un picco con una altezza corrispondente al segnale ed il cui massimo corrisponde al massimo valore di assorbimento; questa modalità è definita absorption measurement.

L’assorbimento può essere misurato in riflettanza oppure in trasmissione, solo la prima modalità risulta utilizzabile in quanto la trasmittanza risente molto della irregolarità dello strato sottile e del supporto di vetro che non permette il passaggio della luce UV.

Se invece le sostanze da analizzare sono eccitabili alla fluorescenza con luce ultravioletta si passa alla modalità fluorescence measurement.

In questo caso, un filtro (passband o cut-off) è posto tra lo strato ed il detector.

La luce monocromatica che proviene dalla sorgente (in genere si tratta di lampade al mercurio o deuterio) raggiunge lo strato ma la porzione che viene riflessa in direzione del detector viene bloccata ad opera del filtro. Con questa modalità la linea di base ha un segnale pari a zero e nel momento in cui c’è emissione in fluorescenza il fascio luminoso, che possiede una lunghezza d’onda maggiore, bassa attraverso il filtro e raggiunge il detector.

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Esiste anche la modalità transmition measurement che è utilizzata più di rado, in cui il detector è posto sotto il piatto e misura la luce non assorbita dalla sostanza e dal supporto.

Misure quantitative

Per poter correlare il segnale elettrico prodotto dal detector alla quantità di sostanza separata sullo strato sottile, si deve riuscire a trovare una relazione funzionale tra le due grandezze.

Diversamente dalle misure che si fanno per analiti contenuti in una soluzione, in cui il campione è omogeneamente distribuito in una cuvetta, in TLC il campione si trova legato allo strato sottile e non è omogeneamente distribuito.

In soluzione vale la famosa legge di Lambert-Beer

E

ε · C · d

In cui ε è il coefficiente di estinzione, C la concentrazione della soluzione e D la lunghezza della cuvetta.

In TLC, le misure di adsorbimento sono più complicate, in quanto la luce riflessa non è solo quella che proviene dallo strato superficiale del supporto, ma esiste anche la componente generata dagli strati più profondi.

La relazione di Kulbeka-Munk di seguito riportata dimostra l’assenza di linearità tra la luce riflessa R e la concentrazione C

1

R

2 · R

2.303ε · C S

In cui R è la luce riflessa, ε è il coefficiente di estinzione, C è la concentrazione della sostanza ed S è il coefficiente di scattering.

Nonostante ciò, si osserva un aumento del segnale all’aumentare della quantità della sostanza, quindi se un set di sostanze standard è presente

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sullo stesso strato sottile dei campioni, è possibile costruire una funzione che permette una calibrazione e quindi un’analisi di tipo quantitativo.

In absortion measurement i dati sono preferibilmente fittati da una funzione polinomiale, mentre una linearizzazione della funzione di Kulbeka-Munk generalmente non produce una accuratezza migliore nei risultati; in fluorescence measurement è applicabile una funzione lineare in quanto in fluorescenza il segnale è proporzionale alla intensità della luce usata per l’eccitazione e tale proporzionalità è riportata nella seguente relazione:

F

k · I · ε · C

Dove F è la fluorescenza, l’intensità della radiazione, ε il coefficiente di estinzione, C la concentrazione della sostanza e k è una costante.

Normalmente per la fluorescenza si utilizza una lampada al mercurio in quanto le sue linee spettrali di emissione risultano molto intense.

Densitometro

Questa apparecchiatura offre la modalità più accurata per eseguire una quantitativa in HPTLC grazie alla possibilità di selezionare luce monocromatica nell’intervallo 190-800 nm, che può essere regolata al massimo valore di assorbimento o fluorescenza delle sostanze di interesse, di modo che la determinazione risulti la più sensibile possibile.

I limiti di rivelabilità sono, per l’assorbimento, al livello dei nanogrammi mentre per la fluorescenza si può arrivare sino ai picogrammi.

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