Vitalità Cellulare, Livelli Intracellulari Di ROS e Danno Ossidativo al DNA In HDF

Nel presente lavoro di tesi è stato valutato l’effetto della radiazione UVA , in vitro su cellule di derma umano neonatali (HDF, Human dermal fibroblast). Nello specifico sono stati valutati in esperimenti di dose risposta come diversi tempi di irraggiamento influenzavano la vitalità, la propensione all’apoptosi ed il contenuto intracellulare di ROS. Questi dati sono stati poi impiegati per identificare le dosi ottimali per valutare il danno al DNA indotto dalla radiazione UV, in termini di rotture al doppio filamento e come due composti innovativi fossero in grado di contrastarlo: un estratto idroalcolico di il polline (standardizzato in contenuto di polifonoli, ed espresso nei risultati come mg/mL di equivalenti di acido gallico) e la 5-tioistidina, un composto tiolico isolato e purificato dalle uova del riccio di mare.

A tal proposito, preliminarmente all’analisi dell’efficacia dei due composti, è stato messo a punto il modello di insulto ossidativo, valutando la vitalità cellulare, i livelli intracellulari delle specie reattive dell’ossigeno e il danno ossidativo al DNA indotti dalla sola esposizione ai raggi UVA delle HDF.

L’analisi citofluorimetrica della vitalità cellulare è stata effettuata tramite l’impiego di un’apposita miscela di due fluorocromi (ViaCount), in grado di discriminare le cellule vive da quelle apoptotiche e morte, con l’obiettivo di identificare il tempo ottimale di irraggiamento, in corrispondenza del quale si verifica una significativa diminuzione della vitalità cellulare rispetto al controllo non irraggiato. L’analisi è stata eseguita utilizzando un modello in vitro di cellule neonatali di derma umano, 24 ore dopo l’esposizione delle stesse ad una scala temporale di irraggiamento con raggi UVA per 5-15 minuti corrispondenti a 27.3 J/cm² e 9,1 J/cm² impiegando una lampada UVA (Philips Original Home Solarium). Come mostra la figura 7.1, a partire da 10 minuti di irraggiamento è possibile osservare una diminuzione significativa (-19.8 %; *p<0.05) della percentuale di cellule vitali (barre verdi) e un aumento altrettanto significativo di quella delle cellule apoptotiche (barre gialle), (+525%; *p<0.05), che aumenta in maniera dose dipendente fino a 15 minuti di

irraggiamento accompagnato da una diminuzione del -30.2% (*p<0.05) di quelle vitali rispetto al campione non irraggiato (0 minuti).

Figura 7.1 Vitalità cellulare espressa come percentuale (%) di cellule vive, apoptotiche e morte, analizzata in seguito a irraggiamento con lampada UVA per 5, 7, 10, 12 e 15 minuti. I dati sono espressi come media ± SEM. a=0 minuti; b=10 minuti; c=12 minuti; *p<0.05; **p<0.01.

Contemporaneamente all’analisi della vitalità cellulare e con le stesse condizioni sperimentali, sono stati analizzati al citofluorimetro anche i livelli intracellulari delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), utilizzando la sonda leuco (DCFDH2), una forma ridotta di fluoresceina la cui intensità di fluorescenza risulta direttamente proporzionale alla quantità di radicali liberi presenti all’interno delle cellule vitali, a loro volta discriminate tramite il simultaneo impiego di ViaCount. Per mettere meglio in evidenza la produzione dei ROS in seguito all’insulto ossidativo, rappresentato dall’irraggiamento a diversi tempi con raggi UVA, la popolazione cellulare è stata suddivisa in cellule con un basso (barre verdi), medio (barre gialle) e alto (barre rosse) contenuto di ROS. Le regioni sono state stabilite arbitrariamente, definendo su una popolazione non irraggiata (controllo negativo), la regione con alto contenuto ROS pari al 10% e quella con basso contenuto di ROS pari al 50% della popolazione totale. La figura 7.2 mostra come, al contrario della vitalità cellulare, l’aumento della percentuale di cellule con un alto contenuto di ROS è risultato significativo già a partire da 5 minuti di irraggiamento (+61.5%; **p<0.05), diventando altamente significativo (+115.4%;

***p<0.001) a partire da 10 minuti di irraggiamento, raggiungendo un massimo di +223.1% a 15 minuti, rispetto al campione di controllo non irraggiato (0 minuti).

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Figura 7.2 Livelli intracellulari di specie reattive dell’ossigeno (ROS), espressi come percentuale (%) di cellule con un basso, medio e alto contenuto di ROS, analizzati in seguito a irraggiamento con lampada UVA per 5, 7, 10, 12 e 15 minuti. I dati sono espressi come media ± SEM. a=0 minuti; b=5 minuti; c=7 minuti;

d=10 minuti; e=12 minuti; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.

E’ stato altresì valutato, nelle medesime condizioni sperimentali, anche il danno ossidativo del DNA indotto dall’irraggiamento, mediante la metodica del Comet assay, al fine di individuare la dose (minuti di irraggiamento) di raggi UVA, necessaria per generare un aumento significativo del danno ossidativo a carico del DNA. La figura 7.3 mostra come in questo caso l’aumento del danno, espresso come percentuale di DNA contenuto nella coda della cometa (tail intensity), sia altamente significativo (***p<0.001) a partire da 18 minuti di esposizione ai raggi UVA, con un aumento del danno del 93.2% rispetto al campione di controllo non irraggiato. Questi dati si riferiscono al Comet assay alcalino condotto a pH 13, che è in grado di risolvere le rotture sul singolo, doppio filamento e sui siti alcali labili ma non sulle basi ossidate.

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I r r a g g ia m e n t o U V A ( m in )

Figura 7.3 Livelli di danno ossidativo, espressi come percentuale (%) di tail intensity, analizzati in seguito a irraggiamento con lampada UVA per 15, 18, 21 e 24 minuti. I dati sono espressi come distribuzione della popolazione sottoforma di Box Plot che individua i valori minimo, massimo, il 25%, il 75% percentile e la mediana. a=0 minuti; ***p<0.001.

Vista la diversa dose risposta tra l’aumento significativo dei livelli intracellulari di ROS e il danno ossidativo al DNA, risultati significativi rispettivamente a 15 e 18 minuti, il danno al DNA dovuto alla semplice esposizione ai raggi UVA, è stato valutato anche mediante l’adozione di una versione modificata del comet assay, che prevede l’impiego di specifici enzimi in grado di rilevare il danno ossidativo al DNA. A tal proposito, è stato utilizzato l’enzima FPG in grado di riconoscere il danno a carico della base purinica ossidata quantitativamente più rappresentativa (7,8-diidro-8-ossiguanina) che viene convertita nella rottura del filamento, aumentando quindi la sensibilità del classico saggio che in condizioni neutre permette di evidenziare solo rotture a singolo (Single Strand Break), a doppio filamento (Double Strand Break) e i siti alcali labili. La figura 7.4 mostra infatti come ad una stessa dose di irraggiamento (15 minuti di UVA) la presenza nel saggio dell’enzima (UVA 15 min + FPG) sia in grado mettere in evidenza un danno ossidativo del DNA significativo che diversamente non viene invece osservato (UVA 15 min –FPG).

% Tail intensity

0 m in U VA 1 5 m in (-F P G) U VA 1 5 m in (+ F P G) 0

2 0 4 0 6 0 8 0

1 0 0 a * * *

Figura 7.4 Livelli di danno ossidativo, espressi come percentuale (%) di tail intensity, analizzati in seguito a irraggiamento con lampada UVA per 15 minuti e con e senza l’enzima FPG nella procedura del comet assay.

I dati sono espressi come distribuzione della popolazione sottoforma di Box Plot che individua i valori minimo, massimo, il 25%, il 75% percentile e la mediana. a=0 minuti; ***p<0.001.