il volume di reazione

Venz : il volume dei campioni testati.

L’attività di GST è stata espressa come nmol/min/mg proteine.

I lisati cellulari utilizzati per la determinazione dell’attività della GST sono stati ottenuti staccando le cellule dal supporto di plastica, con l'ausilio di un “cell scraper”, in 6 mL di PBS; le sospensioni cellulari così ottenute sono state centrifugate a 300xg per 10 minuti a 4°C ed il surnatante eliminato. Ai pellet sono stati aggiunti 150 µL di tampone di lisi (Cell Lytic and Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich Co.). I campioni sono stati mantenuti a 4°C per 60 minuti, vortexando ogni 10 minuti per favorire la lisi cellulare.

I campioni sono stati infine centrifugati a 12,000 g per 15 minuti per far precipitare i debris cellulari non lisati, il surnatante è stato rimosso, aliquotato e conservato a -80°C ed utilizzato entro una settimana.

6.3.2 Valutazione dell’attività dell’enzima glutatione reduttasi (GR)

Per la determinazione dell’attività della GR è stato impiegato un metodo che si basa sulla riduzione di GSSG (2mM) ad opera del NADPH (2mM) in presenza di glutatione reduttasi:

∆A340 /min=

340 340

Tempo di reazione (min)

= µmol/ ml/ min

A340 / min

*

*

GR

NADPH + H+ + GSSG NADP+ +2 GSH

Il glutatione ridotto formato può successivamente reagire in maniera spontanea con acido 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoico) (DTNB) (3mM) secondo la seguente reazione:

GSH + DTNB GS-TNB + TNB

La prima reazione può essere misurata attraverso una riduzione di assorbanza a 340 nm, provocata dalla diminuzione di NADPH, mentre la seconda attraverso un aumento di assorbanza a 412 nm, dato da un aumento di TNB.

In entrambi i casi le variazioni rilevate sono proporzionali all'attività dell'enzima GR.

L’attività dell’enzima è stata calcolata utilizzando la formula:

per NADPH εmM= 6.22 mM-1cm-1

per TNB εmM= 14.15 mM-1cm-1

Un’unità di GR è quella che causa la riduzione di 1 µmol di DTNB a TNB a 25°C, pH 7.5.

I lisati cellulari utilizzati per la determinazione dell’attività della GR sono stati ottenuti staccando le cellule dal supporto di plastica, con l'ausilio di un “cell scraper”, in 6 mL di PBS; le sospensioni cellulari così ottenute sono state centrifugate a 300xg per 10 minuti a 4°C ed il surnatante eliminato. Ai pellet sono stati aggiunti 150 µL di tampone di lisi (Cell Lytic and Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich

unità/ ml =

(∆Acampione - ∆Abianco )

*

Co.). I campioni sono stati mantenuti a 4°C per 60 minuti, vortexando ogni 10 minuti per favorire la lisi cellulare.

I campioni sono stati infine centrifugati a 12,000 g per 15 minuti per far precipitare i debris cellulari non lisati, il surnatante è stato rimosso, aliquotato e conservato a -80°C ed utilizzato entro una settimana.

6.3.3 Valutazione dell’attività dell’enzima glutatione perossidasi (GPx)

L’attività della GPx-1 è stata determinata con il metodo di Paglia e Valentine (1967), modificato da Gunzler et al. (1974), utilizzando terbutil-idroperossido (Sigma-Aldrich Co.) come substrato. E’ un metodo di determinazione enzimatica indiretta basato sull’ossidazione del GSH a GSSG, catalizzato dalla GPx. La rigenerazione del GSH è ottenuta accoppiando la precedente reazione a quella catalizzata dalla glutatione reduttasi (GR) che riduce il GSSG a GSH. La riduzione del GSSG si accompagna all’ossidazione del NADPH a NADP+. La diminuzione di assorbanza a 340 nm, lunghezza d’onda che rappresenta il massimo di assorbimento del NADPH, indica l’entità dell’ossidazione del NADPH a NADP+. Questo è indicativo dell’attività della GPx, poiché la reazione catalizzata dalla GPx rappresenta la tappa limitante l’intero processo catalitico.

GPx L-OOH + 2GSH L-OH + GSSG + H2O GR GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Al termine di ogni esperimento le cellule sono state lavate con PBS e ad ogni piatto sono stati aggiunti 2 mL di tampone potassio fosfato 50 nM, pH 8, contenente EDTA 0.5 mM (Sigma-Aldrich Co.). Le cellule, mantenute in ghiaccio, sono state rimosse dal supporto di plastica mediante l’utilizzo di un “cell scraper”. La sospensione di cellule così ottenuta è stata omogenata utilizzando un potter a bassissima velocità.

I campioni sono stati centrifugati a 4°C a 2000 g per 25 minuti ed è stato prelevato il sovranatante. L’attività della GPx è stata valutata spettrofotometricamente su aliquote del surnatante ottenuto dai diversi campioni in presenza di NADPH 5 mM, GSH 42 mM e 10 U/mL di glutatione reduttasi. La reazione è stata infine avviata con l’aggiunta di 10 µL di terbutil-idroperossido 30 mM.

L’attività della GPx-1 è stata espressa come mU/mg di proteina. La concentrazione proteica è stata valutata utilizzando il metodo di Bradford (1976).

Un’unità di GPx è la quantità di enzima in grado di determinare la formazione di 1 µmol/min di NADP+ _{a pH 8.0, ad una temperatura di} 25°C in presenza di GSH, glutatione reduttasi e terbutil-idroperossido 30 mM.

6.3.4 Valutazione dell’attività dell’enzima superossido dismutasi (SOD)

Per la determinazione dell’attività della SOD è stato impiegato un metodo che sfrutta la capacità del sale monosodico 2-(4-Iodofenil)-3- (4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio (WST-1), solubile in acqua, di formare un sale di formazano, che assorbe alla lunghezza d’onda di 450 nm quando reagisce in presenza di anione superossido (O2.-). Il sistema di reazione utilizza come fonte di O2.- la reazione tra xantina e xantina ossidasi. La SOD, presente nel campione, sequestra parte di O2.- prodotto riducendolo ad acqua ossigenata (H2O2) e ossigeno (O2), impedendogli di reagire con WST-1 e formare il sale di formazano colorato. L’assorbanza è stata misurata utilizzando un lettore di piastre multipozzetto (VICTOR3 V™ Multilabel Counter, Perkin Elmer).

Al termine di ogni esperimento le cellule sono state lavate con PBS e ad ogni piatto sono stati aggiunti 1 mL di tampone potassio fosfato 100 mM, pH 7.5, contenente EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich Co.). Le cellule, mantenute in ghiaccio, sono state rimosse dal supporto di plastica mediante l’utilizzo di un “cell scraper”. La sospensione di

favorire la lisi cellulare. I campioni sono stati centrifugati a 4°C a 12,000 g per 15 minuti ed è stato prelevato il surnatante su cui è stata effettuata la determinazione enzimatica.

L’attività della SOD, è stata calcolata come percentuale d’inibizione rispetto al bianco.

% inibizione = [(Abianco – Acampione)/Abianco] x 100

Costruendo una retta di taratura utilizzando concentrazioni note di SOD (Sigma) è possibile calcolare l’attività dei campioni in U/mg di proteina:

dove:

y intercetta: valore di intersezione tra la retta di taratura e l’asse delle

ordinate

pendenza: coefficiente angolare della retta di taratura mgp: mg di proteine contenute nel campione

Il sistema di reazione è schematizzato in figura 6.2a, mentre la reazione di formazione del sale di formazano è riportata in figura 6.2b. Un’unità di SOD inibisce del 50% la riduzione del citocromo c in un sistema accoppiato con XO a pH 7,8 e temperatura di 25°C.

= U/mgp

Pendenza * Venz(ml)

(a)

(b)

Figura 6.2: determinazione dell’attività della SOD. (a)

schematizzazione del sistema di reazione per la determinazione dell’attività della SOD. Si può notare come la SOD sottraendo anione superossido al sistema impedisca l’ossidazione di WST-1 a formazano determinando così una riduzione dell’assorbimento della soluzione a 450nm. (b) modificazione della struttura del WST-1 in seguito alla

reazione con O2-.

6.3.5 Valutazione dell’attività dell’enzima catalasi (CAT)

Il metodo si basa sulla reazione della CAT con il metanolo (CH3OH) in presenza di una concentrazione ottimale di acqua ossigenata (H2O2):

CH3OH + H2O2 HCHO + H2O