Ai miei genitori
Fonte di inesauribile amore
Esempio di sapienza e di conoscenza
La tesi ha come oggetto di studio la caratterizzazione genomica e funzionale di regioni instabili presenti nel genoma umano contenenti duplicazione segmentali, dette anche low-copy repeats (LCR). Le LCR sono sequenze ripetute di DNA di dimensioni varianti da 10 a 400 Kb; esse si ritrovano in più copie nel genoma sullo stesso cromosoma e/o su cromosomi diversi, con un’ omologia molto alta (95-99%). Contengono tipi diversi di sequenze, tra cui geni e pseudo geni. Un aspetto rilevante è che le LCR sono siti hot-spot per riarrangiamenti cromosomici, essendo target di duplicazioni, delezioni e traslocazioni , spesso associate a disordini genetici congeniti.
Lo scopo della tesi è quello di studiare i meccanismi coinvolti nella instabilità di alcune LCR di rilevante interesse per la patologia umana, attraverso l'analisi dello stato replicativo delle regioni che le compongono e il rilevamento di specifiche caratteristiche genomiche.
Recenti studi hanno infatti evidenziato che siti di instabilità genomica associati a patologie sono spesso caratterizzati da zone di transizione del tempo di replicazione. Si ritiene che in questi loci lo switch del tempo di replicazione sia legato ad un passaggio della cromatina da una struttura aperta, trascrizionalmente attiva, ad una struttura chiusa, trascrizionalmente non attiva. Ciò comporterebbe uno stallo della forca replicativa e l'aumentata probabilità di rotture del filamento di DNA e conseguenti riarrangiamenti cromosomici.
La prima parte del lavoro è stata dedicata all'analisi genomica. Con l'uso di database genomici (UCSC, Human Genome Segmental Duplication Database) sono state identificate le duplicazioni segmentali presenti nelle regioni cromosomiche 2q13, 5q13, 6p21, 17q11.2, 17p11.2, Xq28 e 7q11.23 rispettivamente associate alle patologie: nefronoftisi giovanile familiare, atrofia muscolare spinale, iperplasia adrenale congenita III, neurofibromatosi, sindrome di Smith-Magenis, daltonismo rosso verde e sindrome di Williams-Beuren. Utilizzando un software appositamente messo a punto è stata determinata per le regioni di interesse la flessibilità del DNA, per evidenziare l'eventuale presenza di picchi di flessibilità, cosa che caratterizza altre regioni instabili, quali i siti fragili cromosomici. I dati citati sono stati integrati con dati ChIP-chip pubblicati relativi alle modificazioni degli istoni ed altri marcatori dello stato della cromatina.
In base all’analisi genomica è stata individuata le regione 7q11.23, come la più idonea per effettuare l’analisi sperimentale sul tempo di replicazione. Questa regione presenta duplicazioni segmentali con un’identità molto elevata ed è anche associata a variazioni interessanti della flessibilità. Substrato di riarrangiamenti cromosomici, in particolare di una delezione, è associata alla sindrome di Williams-Beuren.
Il tempo di replicazione di regioni diverse, esterne o interne alle LCR, è stato analizzato utilizzando la metodica FISH (ibridazione in situ fluorescente) con sonde BAC locus-specifiche selezionate anche
in relazione alla posizione di mappa rispetto ai picchi di flessibilità. La FISH è stata effettuata su preparati interfasici ottenuti da linfociti di sangue periferico provenienti da tre soggetti diversi. Alcune di queste colture cellulari sono state anche trattate con afidicolina, un sostanza che interferisce con la replicazione del DNA e quindi promuove l’instabilità genomica. Si è così andati a studiare il tempo di replicazione della regione 7q11.23 per identificare l’eventuale presenza di zone di transizione del tempo di replicazione, di modificazioni epigenetiche come l‘ asincronismo replicativo, e di suscettibilità allo stress replicativo. I dati ottenuti dall'analisi in silico e sperimentale sono stati interpolati per evidenziare l'esistenza di una associazione posizionale tra gli elementi citati.
