Identificazione di nuovi interattori funzionali di BRAFV600E tramite screening genetico in lievito Saccharomyces cerevisiae

D

B

C

L

S

S

T

B

Identificazione di nuovi interattori funzionali di

BRAF

tramite screening genetico in lievito

Saccharomyces cerevisiae

Candidato: Relatori:

Simone Lubrano Dott.ssa Laura Poliseno

Dott.ssa Tiziana Cervelli

A nonno Mario

I

NDICE

R

………..5  

A

……….8  

1.

I

………...11  

           1.1.1  EPIDEMIOLOGIA  DEL  MELANOMA………...12  

           1.1.2  CLASSIFICAZIONE  DEL  MELANOMA……….……….12  

           1.1.3  FATTORI  DI  RISCHIO  DEL  MELANOMA……….………..…….14  

           1.1.4  TERAPIE  CONTRO  IL  MELANOMA……….……….15  

     1.2  IL  VEMURAFENIB………....17  

           1.2.1  IL  PATHWAY  DELLE  MAPK……….……...17  

           1.2.2  INIBIZIONE  DI  BRAF  MUTATO  DA  PARTE  DI  VEMURAFENIB………18  

           1.2.3  RESISTENZA  ACQUISITA  AL  VEMURAFENIB………20  

           1.2.4  MECCANISMI  DI  RESISTENZA  ACQUISITA  MEDIATA  DA  BRAF………...22  

     1.3  IL  LIEVITO  SACCHAROMYCES  CEREVISIAE  NELLA  RICERCA  MEDICA  E  NELLA                          GENETICA  UMANA………...24  

           1.3.1  IL  PATHWAY  DELLE  MAPK  NEL  SACCHAROMYCES  CEREVISIAE……….…...25  

           1.3.2  YEAST  DELETION  POOL………...26  

S

2.

M

…..……….…30  

     2.1  VETTORE  PLASMIDICO  PGEM-­‐T  EASY………..30  

     2.2  PCR  DI  BRAFV600E………....32  

     2.3  CLONAGGIO  DEL  PGEM……….………...33  

     2.4  VETTORE  PLASMIDICO  PYES2………...34  

     2.6  CEPPI  DI  SACCHAROMYCES  CEREVISIAE………...37  

     2.7  TERRENI  DI  COLTURA………...38  

           2.7.1  TERRENO  YAPD  (YEAST  EXTRACT  PEPTONE  DEXTROSE)  ………...……...38  

           2.7.2  TERRENI  SELETTIVI………...………...38  

     2.8  TRASFORMAZIONE  DI  S.  CEREVISIAE  CON  DNA  PLASMIDICO………...41  

     2.9  ESTRAZIONE  DELLE  PROTEINE  DI  LIEVITO...42  

     2.10  WESTERN  BLOT...43  

     2.11  ESTRAZIONE  DNA  DAL  LIEVITO...44  

     2.12  REAZIONE  DI  PCR  PER  IDENTIFICARE  I  CLONI  DELL’YEAST  DELETION  POOL...45  

     2.13  PURIFICAZIONE  E  SEQUENZIAMENTO  DI  PRODOTTI  DI  PCR...46  

     2.14  SPOTTING  ASSAY  IN  LIEVITO...46  

3.

R

…..……….……….47  

     3.1  ESPRESSIONE  DI  BRAFV600E  IN  LIEVITO  SACCHAROMYCES  CEREVISIAE...47

           3.1.1  EFFETTO  FENOTIPICO  DOVUTO  ALL’ESPRESSIONE  DI  BRAFV600E  NEL  LIEVITO  S.  CEREVISIAE………49

           3.1.2  EFFETTO  DELL’ESPRESSIONE  DI  BRAFV600E  SULLA  RISPOSTA  A  CONDIZIONI  DI  STRESS………50

     3.2  SCREENING  GENETICO  DELL’YEAST  DELETION  POOL...54  

           3.2.1  IDENTIFICAZIONE  DELLE  ORF  DELETE………56  

           3.2.2  SAGGI  PER  VALIDARE  I  CEPPI  IDENTIFICATI………60  

           3.2.3  IDENTIFICAZIONE  DI  INTERATTORI  FUNZIONALI  SPECIFICI  DI  BRAFV600E                                        TRAMITE  CROSS  EXPRESSION………..64

4.

D

…..……….………..69  

5.

C

…..………..76  

B

…..………...78

R

IASSUNTO

Il  melanoma  è  un  tumore  cutaneo  maligno  per  il  quale  non  esiste  ancora  una  cura   valida.  Il  50%  dei  pazienti  con  melanoma  presenta  una  specifica  mutazione  nel  gene  

BRAF,  il  quale  causa  un’alterata  regolazione  del  pathway  MAPK  (mitogen-­‐activated  

protein   kinase   o   RAS/RAF/MEK/ERK   pathway),   coinvolto   nella   divisione   e   differenziazione  cellulare.  Tale  mutazione  consiste  nella  sostituzione  di  una  valina   con   acido   glutammico   in   posizione   600   (BRAFV600E_{);   ciò   determina   un   cambio   di}  

conformazione,   responsabile   di   un’attivazione   costitutiva   della   proteina   anche   in   presenza   di   un   basso   livello   di   RAS,   il   suo   attivatore.   Recentemente   è   stato   sviluppato   un   farmaco,   Vemurafenib   (PLX4032),   in   grado   di   inibire   in   maniera   specifica   BRAFV600E   e   quindi   di   determinare   la   regressione   del   tumore   in   poche   settimane.   Purtroppo   però,   dopo   circa   6   mesi,   si   presenta   il   fenomeno   della   resistenza   acquisita,   con   ricomparsa   delle   metastasi   nel   paziente   e   una   nuova   progressione   del   tumore.   Un   meccanismo   di   resistenza   acquisita   noto   è   la   formazione  di  varianti  di  splicing  di  BRAFV600E,  tra  cui  la  forma  BRAFV600E∆[3-­‐10].

pazienti  affetti  da  melanoma  che  mostrano  tale  mutazione  di  BRAF.  

Per  fare  questo  ho  utilizzato  un  pool  di  cloni  di  lievito  S.  cerevisiae,  che  presentano   una  delezione  in  geni  non  essenziali  [Yeast  Deletion  pool  (4.741  cloni)].  Ogni  clone  è   identificabile   tramite   due   sequenze   specifiche   di   DNA   denominate   “barcode”.   Attraverso   l’uso   dell’Yeast   Deletion   pool   è   possibile   identificare   interattori   funzionali  di  proteine  legate  a  malattie  e  che  non  hanno  controparti  omologhe  nel   lievito,  come  BRAF.    

Per   fare   esprimere   le   varie   forme   di   BRAF   nell’Yeast   Deletion   pool,   ho   clonato   ciascuno   dei   tre   cDNA   di   BRAF   (BRAFV600E_{;   BRAF}V600E_{∆[3-­‐10];   BRAF   wild   type)   nel}  

vettore  pYES2  contenente  il  gene  di  lievito  URA3  come  marcatore  di  selezione  ed  il   promotore  inducibile  pGAL1  che  permette  l’espressione  di  proteine  eterologhe  solo  

in   galattosio   (in   quanto   il   gene   viene   clonato   a   valle   di   un   promotore   inducibile   pGAL1).  

Poiché   i   pathway   delle   MAPK   sono   coinvolti   nella   risposta   a   stress,   ho   verificato   cosa   accade   in   diverse   condizioni   di   stress.   Ho   potuto   costatare   che,   nel   caso   di   quello  salino,  le  cellule  che  esprimono  BRAFV600E  _{crescono  meglio  rispetto  a  quelle}  

trasformate   con   il   plasmide   vuoto   pYES2.   Questo   vantaggio   di   crescita   suggerisce   che  probabilmente  la  presenza  di  BRAFV600E  _{interferisce  con  il  pathway  delle  MAPK}  

del  lievito.  

Una  volta  accertata  l’espressione  di  BRAFV600E  _{nel  ceppo  di  lievito  e  dimostrato  un}  

suo  effetto  nel  pathway  delle  MAPK,  ho  proseguito  il  lavoro  andando  ad  effettuare   uno  screening  genetico  per  identificare  proteine  che  interagiscono  funzionalmente   con  BRAFV600E.  

Per  fare  questo  ho  trasformato  il  plasmide  contenente  BRAFV600E  nell’Yeast  Deletion   Pool.  Ho  quindi  piastrato  i  ceppi  trasformati  in  un  terreno  selettivo  privo  di  uracile,   per  identificare  i  cloni  che  hanno  il  plasmide,  per  poi  replicarli  in  un  terreno  sempre   selettivo  ma  contenente  galattosio  così  da  indurre  l’espressione  del  gene  BRAFV600E.   I  cloni  che  hanno  difficoltà  di  crescita  in  presenza  di  BRAFV600E  sono  quei  cloni  la  cui   funzione  genica  mancante  rappresenta  un  interattore  funzionale  di  BRAFV600E.     Dopo   aver   trasformato   l’intera   library   8   volte,   ho   individuato   50   cloni   di   cui   ho   sequenziato  il  genoma  per  identificare  la  funzione  genica  mancante.  

Al   netto   dei   cloni   doppi,   ho   ottenuto   che:   5   geni   deleti   sono   ORF   coinvolte   nel   metabolismo  del  galattosio,  la  cui  delezione  motiva  l’assenza  di  crescita  nel  terreno   selettivo  SC-­‐URA+Gal;  6  hanno  l’ortologo  nell’uomo;  gli  altri  16  sono  deleti  per  geni   che,  anche  se  non  abbiano  l’ortologo  umano,  possono  essere  coinvolti  in  pathway   che  vanno  ad  interagire  direttamente  o  indirettamente  con  BRAFV600E_.    

I  6  cloni  con  ortologhi  umani  deleti  sono  stati  ulteriormente  caratterizzati  mediante   western  blot  e  spot  assay  per  valutare  l’effettiva  alterazione  della  crescita.  Inoltre   ho   trasformato   i   6   ceppi,   con   delezione   in   geni   che   hanno   un   ortologo   umano,   utilizzando  i  vettori  per  l’espressione  di  BRAFwt  e  BRAFV600E  _{[∆3-­‐10]  per  vedere  se}  

ottenuto  indica  che  queste  forme  di  BRAF  non  influenzano  la  crescita  e  che  quindi  il   fenotipo   osservato,   dei   ceppi   deleti   che   abbiamo   ottenuto,   è   specifico   per   BRAFV600E_.  

Gli  scenari  di  possibili  indagini  che  si  aprono  grazie  a  questi  risultati  sono  assai  vasti:   per  ciascun  gene  trovato  che  ha  l’omologo  nell’uomo  possiamo  infatti  disegnare  dei   primer   per   andare   così   a   verificare   il   loro   livello   di   espressione   in   diverse   linee   di   melanoma.  

Per   ampliare   il   numero   di   geni   da   investigare   ripeteremo   lo   screening,   andando   però   a   trasformare   l’YDP   con   i   plasmidi   contenti   il   BRAFwt   e   la   forma   di   BRAF   responsabile   della   resistenza   al   farmaco   Vemurafenib.   Potremo   successivamente   riproporre  esperimenti  di  cross  expression  per  i  differenti  cloni  individuati  nei  vari   screening,  andando  così  a  stilare  una  lista  di  nuovi  interattori,  isoforma-­‐specifici  e   non,  potenzialmente  utilizzabili  nella  terapia  del  melanoma.  

A

BSTRACT

Melanoma  is  a  malignant  skin  cancer  for  which  there  is  not  yet  a  valid  cure.  50%  of   patients  with  melanoma  present  with  a  specific  mutation  in  the  BRAF  gene,  which   causes   an   altered   regulation   of   the   MAPK   pathway   (mitogen-­‐activated   protein   kinase   or   RAS   /   RAF   /   MEK   /   ERK   pathway),   involved   in   cell   division   and   differentiation.  This  mutation  consists  of  the  substitution  of  a  valine  with  glutamic   acid  at  position  600  (V600E);  this  causes  a  change  in  conformation,  responsible  for  a   constitutive  activation  of  the  protein  even  in  the  presence  of  a  low  level  of  RAS,  its   activator.   Recently   the   drug   Vemurafenib   (PLX4032)   has   been   developed,   able   to   inhibit  specifically  BRAFV600E  and  thus  determine  the  regression  of  the  tumor  in  a   few   weeks.   Unfortunately,   after   about   6   months,   occurs   the   phenomenon   of   acquired   resistance   in   patients   with   metastasis   and   recurrence   of   a   new   tumor   progression.  A  mechanism  of  acquired  resistance  known  is  the  formation  of  splice   variants  of  BRAFV600E,  including  the  form  BRAFV600EΔ  [3-­‐10].    

The   aim   of   my   thesis   is   to   identify   new   functional   interactors   of   BRAF   V600E   in   order   to   allow   the   development   of   new   therapeutic   strategies   for   patients   with   melanoma    that  shows  BRAF  mutation.    

To  do  this,  I  used  a  pool  of  clones  of  yeast  S.  cerevisiae,  which  have  a  deletion  in   non-­‐essential  genes  [yeast  deletion  pool  (4,741  clones)].  Each  clone  is  identifiable   by  means  of  two  specific  DNA  sequences  called  "barcode".  Through  the  use  of  yeast   deletion  pool,  it  is  possible  to  identify  functional  interactors  of  proteins  related  to   diseases  which  do  not  have  homologous  counterparts  in  yeast,  such  as  BRAF.     To  express  the  various  forms  of  BRAF  in  the  yeast  deletion  pool,  I  cloned  each  of  the   three  cDNA  BRAF  (V600E;  BRAFV600EΔ  [3-­‐10];  BRAF  wild  type)  in  the  vector  pYES2   containing  the  yeast  URA3  gene  as  a  selection  marker  and  the  inducible  promoter   pGAL1  that  allows  the  expression  of  heterologous  proteins  only  in  galactose  (as  the   gene  is  cloned  downstream  of  a  promoter  inducible  pGAL1).    

Because   the   MAPK   pathway   are   involved   in   the   response   to   stress   I   checked   the   effects   of   different   conditions   of   stress.   I   have   found   that,   in   the   case   of   saline   stress,   cells   expressing   BRAFV600E   grow   better   than   those   transformed   with   the   empty  plasmid  pYES2.  This  growth  advantage  suggests  that  probably  the  presence   of  BRAFV600E  interferes  with  the  MAPK  pathway  of  yeast.    

Once   the   expression   of   BRAF   V600E   was   verified   in   the   yeast   strain   and   demonstrated  its  effect  in  the  MAPK  pathway,  I  continued  the  work  by  carrying  out   a  genetic  screen  to  identify  proteins  that  interact  functionally  with  BRAF  V600E.     To  do  this  I  trasformed  the  plasmid  containing  BRAF  V600E  nell'yeast  deletion  pool.   I   then   plated   the   transformed   strains   in   a   selective   medium   lacking   uracil,   to   identify   clones   that   have   the   plasmid,   and   then   replicated   them   in   a   medium   containing  galactose  but  always  selective  so  as  to  induce  the  expression  of  the  gene   BRAFV600E.    

The   clones   that   have   difficulty   growing   in   the   presence   of   BRAFV600E   are   those   clones   whose   gene   function   missing   represents   a   functional   interactor   of   BRAFV600E.    

After   transforming   the   entire   library   8   times,   I   identified   50   clones   which   I   have   sequenced  the  genome  to  identify  gene  function  missing.    

Net  of  double  clones,  I’ve  got:  ORF  5  gene  knockouts  are  involved  in  the  metabolism   of  galactose,  whose  deletion  motivates  the  lack  of  growth  in  selective  medium  SC-­‐ URA  +  Gal;  6  have  an  ortholog  in  humans;  the  other  16  are  deleted  for  genes  that,   although  not  having  the  human  ortholog,  may  be  involved  in  pathways  that  go  to   interact  directly  or  indirectly  with  BRAFV600E.    

The   6   clones   with   orthologous   human-­‐deleted   were   further   characterized   by   western   blot   and   spot   assay   to   evaluate   the   effective   alteration   of   growth.   I   also   transformed  the  6  strains  with  deletion  in  genes  that  have  a  human  ortholog,  using   the  vectors  for  the  expression  of  BRAFwt  and  BRAFV600EΔ3-­‐10  to  see  if  even  these   forms   of   BRAF   V600E   are   slow   growth.   The   obtained   results   indicate   that   these   forms  of  BRAF  do  not  affect  the  growth  and  that  the  phenotype  observed,-­‐deleted   strains  that  we  have  obtained  is  specific  to  BRAFV600E.    

The  scenarios  of  possible  investigations  that  start  with  these  results  are  very  broad:   for  each  gene  founded  we  can  indeed  draw  the  primers  of  the  human  homologue   to  check  their  level  of  expression  in  different  melanoma  cell  lines.    

To   expand   the   number   of   genes   to   investigate   we   can   repeat   screening,   going   to   transform   the   YDP   with   plasmids   glad   the   BRAF   wt   and   the   form   of   the   BRAF   responsible   for   resistance   to   the   drug   Vemurafenib.   We   can   then   repeat   the   experiments   of   cross   expression   for   the   different   clones   identified   in   the   various   screening,   so   going   to   make   a   list   of   new   interactors,   isoform-­‐specific   and   potentially  useful  in  the  therapy  of  melanoma.  

1.

I

NTRODUZIONE

1.1

Il  melanoma  

I  melanociti,  che  si  trovano  nello  strato  basale  dell’epidermide,  hanno  il  compito  di   produrre   melanina:   pigmento   che   dà   colore   alla   pelle   e   protegge   dagli   effetti   dannosi  dei  raggi  del  sole.  Queste  cellule  danno  origine,  sulla  superficie  della  pelle,   a  nevi  i  quali  non  sono  altro  che  un  raggruppamento  di  melanina  scura.  

I  melanociti  sono  le  cellule  della  pelle  da  cui  il  melanoma  ha  origine,  ed  è  appunto   da  queste  che  prende  il  suo  nome  (Fig.  1.1).  

Il  melanoma,  tumore  cutaneo  maligno,  può  manifestarsi  sia  sulla  cute  sana  sia  da  un   nevo   acquisito   o   congenito.   Attraverso   la   circolazione   linfatica   ed   ematica   può   diffondere  cellule  maligne  ad  ogni  tessuto  dell’organismo;  infatti,  il  melanoma,  ha   un’altissima  predisposizione  allo  sviluppo  di  metastasi.  

©Mayo  foundation  for  Mediacl  Education  and  research

Fig.  1.1  Raffigurazione  di  una  sezione  cutanea    

           1.1.1  Epidemiologia  del  melanoma  

Il   melanoma   cutaneo   rappresenta   il   3-­‐5%   dei   tumori   della   pelle   ed   è   quello   più   pericoloso   poiché   ha   un’alta   tendenza   alla   metastatizzazione   attraverso   la   circolazione   ematica   e   linfatica1.   Il   melanoma   è   responsabile   infatti   del   65%   delle   morti   causate   da   tumore   alla   pelle   e   la   sua   rilevanza   è   aumentata   notevolmente   negli  ultimi  40-­‐50  anni,  principalmente  tra  i  giovani  (35-­‐50  anni).  L’Organizzazione   Mondiale  della  Sanità  ha  appurato  che  nel  mondo,  ogni  anno  si  verificano  132.000   nuovi  casi  di  melanoma  cutaneo  con  48.000  morti  da  esso  causate.  L’incidenza  in   Europa   è   di   circa   12   casi/100.000   abitanti,   in   Australia   supera   i   40   casi/100.000   abitanti  e  ciò  è  dovuto  a  fattori  geografici  e  genetici.  

La  frequenza  di  questo  tumore  è  molto  più  elevata  nei  Caucasici  rispetto  ad  altre   popolazioni.2   _{Nel   mondo   il   tasso   di   rilevanza   maggiore   lo   troviamo   in   aree}  

soleggiate  come  Nuova  Zelanda  e  Australia  dove  la  maggior  parte  della  popolazione   è  di  origine  europea.    

           1.1.2  Classificazione  del  melanoma  

Il   melanoma   può   originarsi   in   qualsiasi   parte   del   corpo   che   contenga   melanociti.   Viene   chiamato   solitamente   tumore   della   pelle   ma   è   stato   trovato   anche   in   altre   parti   del   corpo,   per   esempio   nella   mucosa   intestinale   e   nell’occhio,   dove   viene   chiamato  melanoma  uveale.  

Classificazione  istologica  del  melanoma  

I  melanomi  possono  distinguersi  nei  seguenti  tipi:  a  diffusione  superficiale  (60-­‐70%   melanomi);   lentigo   maligna;   acro   lentigginoso;   muco-­‐cutaneo;   nodulare;   della   coroide.  

Classificazione  clinica  del  melanoma:    

-­‐ Fase  0.  Melanomi  in  cui  le  cellule  cancerose  non  hanno  superato  l’epidermide.  

L’asportazione  chirurgica  del  tumore  porta  a  guarigione  in  quasi  tutti  i  casi.  

-­‐ Fase  I.  I  melanomi  iniziano  a  svilupparsi  verticalmente  con  uno  spessore  di  0,1-­‐

1  mm.  In  seguito  alla  rimozione  del  tumore  si  ha  una  sopravvivenza  a  10  anni   del  90%.    

-­‐ Fase  II.  I  melanomi  continuano  a  svilupparsi  in  senso  verticale  con  uno  spessore  

di   1,1-­‐2   mm   fino   a   raggiungere   il   derma.   La   sopravvivenza   a   10   anni   dalla   rimozione  del  tumore  è  del  70%.    

-­‐ Fase  III.  Le  cellule  cancerose  raggiungono  il  circolo  linfatico  fino  ad  arrivare  ai  

linfonodi  regionali,  ossia  quelli  che  drenano  la  zona  cutanea  dove  si  è  originato   il  tumore.  La  terapia  migliore  è  ancora  la  rimozione  chirurgica.  

-­‐ Fase  IV  (melanoma  metastatico).  Le  cellule  cancerose  colonizzano  altri  tessuti  

corporei   attraverso   il   sangue   o   il   sistema   linfatico   dando   metastasi   diffuse   a   livello  di  vari  organi  interni,  frequentemente  ai  linfonodi  extraregionali  (59%),   al  polmone  (36%),  al  fegato  e  al  cervello  (20%)  e  all’osso  (17%).  In  questa  fase   l’aspettativa  di  vita  di  un  paziente  è  di  circa  6  mesi.  

           1.1.3  Fattori  di  rischio  del  melanoma  

Lo   sviluppo   del   melanoma   dipende   da   più   fattori   di   rischio,   tra   cui:   carnagione   chiara,   ipersensibilità   al   sole,   storia   familiare   di   melanoma,   eccessiva   esposizione   solare   nell’infanzia,   presenza   di   nevi   che   si   evolvono,   età   e   un   elevato   numero   di   nevi.3    

Fattori  ambientali  

Studi   dimostrano   che   lo   sviluppo   del   melanoma   sia   dovuto   ad   un’intensa   ed   intermittente  esposizione  al  sole,  soprattutto  durante  l’infanzia  o  l’adolescenza.4,5    

Fattori  genetici  

Un   altro   fattore   di   rischio   è   la   predisposizione   genetica,   infatti,   da   alcuni   studi   è   emerso   che   vi   sono   mutazioni   nella   linea   germinale   legate   all’insorgenza   di   melanoma.  Le  mutazioni  nella  linea  germinale  sono  quelle  che  si  trasmettono  nelle   generazioni  e  le  più  rilevanti  nel  melanoma  sono  a  carico  del  gene  CDKN2A  (Cyclin-­‐ Dependent-­‐Kinase   Inhibitor   2A)6,7,   soppressore   tumorale,   che   codifica   per   p16,   proteina  responsabile  del  blocco  del  ciclo  cellulare  in  fase  G1.  Un’altra  mutazione   genica   presente   nella   linea   germinale,   che   può   essere   un   fattore   di   rischio   nello   sviluppo   del   melanoma,   è   MCR1   gene   che   codifica   per   il   Recettore   1   della   melanocortina,  coinvolto  nel  processo  di  sintesi  della  melanina.  

Altre   alterazioni   riguardano   geni   che   controllano   le   vie   di   trasduzione   dei   segnali   proliferativi  dalla  superficie  cellulare  al  nucleo,  come  i  geni  NRAS  (Neuroblastoma   RAS   viral   (v-­‐ras)   oncogene   homolog),   BRAF   (V-­‐raf   murine   sarcoma   viral   oncogene   homolog   B1)   e   PTEN   (Phosphatase   and   Tensin   homolog).8-­‐12   Da   un   punto   di   vista   patogenetico   le   mutazioni   dei   geni   NRAS   e   BRAF   comparirebbero   in   una   fase   precoce  della  malattia,  mentre  quelle  a  carico  del  gene  PTEN  in  una  fase  più  tardiva   della  progressione  tumorale.  BRAF  mutato  è  stato  osservato  nel  50%  dei  melanomi.    

           1.1.4  Terapie  contro  il  melanoma  

Poiché   la   mortalità   dovuta   al   melanoma   è   piuttosto   alta,   nei   paesi   Occidentali   è   sempre  più  in  espansione  il  controllo  periodico  dei  nei  per  avere,  nell’eventualità,   una  diagnosi  precoce.  

Con  questa  pratica  la  mortalità  causata  dal  melanoma  si  è  abbassata  notevolmente.   Nelle  prime  fasi  della  malattia,  infatti,  quando  il  melanoma  è  ancora  localizzato  in   prossimità  dell’epidermide,  l’asportazione  chirurgica  del  tumore  porta  a  guarigione   del   paziente   nell’80%   dei   casi.   Tuttavia   il   75%   dei   pazienti,   con   profonde   lesioni   primarie,  svilupperà  recidive  o  metastasi  a  distanza  (stadio  IV  della  malattia)  e  avrà   una   prognosi   molto   sfavorevole,   con   una   sopravvivenza   media   di   6   mesi   e   una   probabilità  di  sopravvivere  5  anni  inferiore  al  5%.  L’intervento  chirurgico  spesso  può   richiedere   l’utilizzo   di   una   terapia   coadiuvante,   rappresentata   dalla   somministrazione  di  alte  dosi  di  interferone,  il  quale  ha  gravi  effetti  collaterali  ma   può  migliorare  la  prognosi  del  paziente.13  

In  stadi  tardivi,  quando  la  malattia  raggiunge  la  fase  metastatica,  le  uniche  opzioni   di  cura  sono  terapie  di  tipo  farmacologico,  che  però  hanno  scarso  effetto.  

Farmaci   antitumorali   non   specifici,   come   la   dacarbazina   ed   elevate   dosi   di   Interleuchina-­‐2  (HD  IL-­‐2),  sono  stati  utilizzati  a  partire  dagli  anni  ’70,  nella  terapia   contro   il   melanoma   metastatico,   ma   entrambi   hanno   mostrato   un   basso   tasso   di   risposta   (dacarbazina   r.r.   10-­‐15%,   IL-­‐2   r.r.6-­‐   10%   )   e   la   comparsa   di   molti   effetti   collaterali.14,15   Recentemente,   studi   di   profiling   di   melanoma,   hanno   permesso   di   scoprire   che   il   56%   dei   melanomi   ha   una   mutazione   sul   gene   BRAF   che   causa   un’alterata   regolazione   del   pathway   MAPK   (mitogen-­‐activated   protein   kinase   o   RAS/RAF/MEK/ERK   pathway).   Questa   scoperta   ha   permesso   di   sviluppare   una   nuova  classe  di  molecole,  gli  inibitori  di  BRAF  mutato,  fra  i  quali  il  Vemurafenib.16   (Vedi  paragrafo  1.2)  

La   ricerca   di   nuove   terapie   nella   cura   del   melanoma   metastatico   ha   portato   allo   sviluppo  anche  di  farmaci  di  tipo  immunologico  come  l’Ipilimumab.  L’Ipilimumab  è   un   anticorpo   monoclonale   umano   (IgG1)   che   blocca   CTLA-­‐4.   L’antigene   CTLA-­‐4  

viene  normalmente  espresso  dalla  cellula  per  controllare  l’attivazione  delle  cellule-­‐ T.   Il   melanoma   è   un   tumore   altamente   immunogenico   e   l’inibizione   di   questo   antigene  permette  una  elevata  attivazione  delle  cellule-­‐T  del  sistema  immunitario,   che  aggrediscono  le  cellule  del  melanoma  impedendone  la  proliferazione17,18_.  

     1.2  Il  Vemurafenib  

Il   Vemurafenib   è   un   farmaco   di   ultima   generazione   in   grado   di   inibire   il   pathway   delle  MAPK  quando  BRAF  ha  la  mutazione  V600E.  

           1.2.1  Il  Pathway  delle  MAPK  

Il  pathway  delle  MAPK  (Mitogen-­‐Activated  Protein  Kinase)  è  una  via  di  trasduzione   del   segnale   che,   in   seguito   a   stimoli   esterni,   regola   diversi   processi   cellulari,   soprattutto   la   sopravvivenza,   il   differenziamento   e   la   proliferazione   cellulare.   Tuttavia,  spesso,  questo  pathway  è  disregolato  nei  tumori.  

Il  pathway  viene  attivato  quando  i  fattori  di  crescita  si  legano  ai  recettori  tirosina-­‐ chinasi  (TKR)  che  si  trovano  sulla  membrana  plasmatica.  Una  volta  attivati,  questi   recettori  determinano  l’attivazione  di  RAS,  piccola  proteina  posta  sul  lato  citosolico   della   membrana   plasmatica.   RAS   attivata   è   legata   al   GTP   e,   in   questo   modo,   è   in   grado  di  legare  e  attivare  altri  fattori  nel  pathway.  Tra  questi  fattori  troviamo  RAF,   una  chinasi  che  va  ad  attivare  MEK,  questa  è  così  in  grado  di  attivare  ERK,  effettore   finale   della   cascata   delle   MAPK.   ERK   fosforilato   è   in   grado   di   entrare   nel   nucleo   dove   attiva   fattori   di   trascrizione   coinvolti   nella   proliferazione,   sopravvivenza   e   differenziamento  cellulare  (Fig.  1.3).  

Questo  pathway  è  molto  conservato  tra  le  specie  e,  nei  tumori,  sono  state  trovate   mutazioni  a  carico  di  uno  o  più  geni  coinvolti  in  questa  via.  Ad  esempio  sono  state   trovate  mutazioni  in  RAS  nel  15%  dei  tumori  umani.  Esistono  tre  isoforme  di  RAS   molto  simili  dal  punto  di  vista  strutturale:  NRAS,  KRAS  e  HRAS,  ma  nel  melanoma   sono   maggiormente   riscontrate   mutazioni   a   carico   di   NRAS   (15-­‐30%   dei   casi).19-­‐21   Altre  mutazioni  frequenti  si  ritrovano  in  RAF,  la  quale  fa  parte  di  una  famiglia  a  cui   appartengono  tre  isoforme:  ARAF,  BRAF  e  CRAF.  RAS  è  in  grado  di  riconoscere  tutte   e   tre   le   isoforme   e   determina   la   dimerizzazione   di   RAF   attivandolo.   È   stato   dimostrato  che  queste  mutazioni  hanno  un  carattere  mutualmente  esclusivo.  

amminoacidica   della   Valina   con   l’Acido   Glutammico   in   posizione   600   (V600E).   Questa  mutazione  fa  sì  che  la  proteina  BRAF  sia  costitutivamente  attiva  e  svolga  la   sua   attività   in   forma   monomerica,   inducendo   la   proliferazione   cellulare   anche   in   assenza   della   sua   attivazione   da   parte   di   RAS9,22-­‐26_{.   Questa   mutazione   è   stata}  

osservata  anche  in  altri  tumori  come  quello  al  colon-­‐retto.    

Fig.  1.3  Il  pathway  delle  MAPK.  Gibney27  

           1.2.2  Inibizione  di  BRAF  mutato  da  parte  di  Vemurafenib  

Il  vemurafenib  (PLX4032),  è  un  farmaco  approvato  per  l’utilizzo  negli  USA  nel  2011  e   in  Europa  nel  2012.  Consiste  in  una  piccola  molecola  che  mima  la  struttura  dell’ATP   andando   a   legarsi   in   prossimità   del   sito   attivo   di   BRAF   V600E   (Fig.   1.4).   Il   vemurafenib   è   un   inibitore   specifico   di   BRAF   nella   forma   mutata   V600,   la   sua   particolarità,   infatti,   è   che   mostra   una   specificità   elevata   per   la   proteina   BRAF   V600E  e  molto  bassa  per  BRAF.28  

Fig.  1.4  Struttura  chimica  del  Vemurafenib  e  rappresentazione  3D  della  sua  localizzazione   nel  sito  attivo  di  BRAFV600E  

Esperimenti   in   vitro,   condotti   su   linee   cellulari   con   BRAF   V600E,   mostrano   una   diminuzione  del  signaling  di  MAPK  in  seguito  al  trattamento  con  vemurafenib.  Nel   corso  degli  stessi  studi  si  riscontra  una  riduzione  della  fosforilazione  di  MEK  ed  ERK   anche   in   linee   cellulari   con   mutazioni,   in   corrispondenza   dell’amminoacido   600,   diverse   da   V600E.   Il   vemurafenib   si   dimostra   quindi   un   efficace   inibitore   sia   della   proteina   mutata   BRAF   V600E   che   di   BRAF   V600D,   BRAF   V600R   e   BRAF   V600K.   È   stato  però  osservato  che  la  somministrazione  della  molecola  a  linee  BRAF  wild-­‐type   fornisce   un   vantaggio   proliferativo,   causato   da   un’iperattivazione   del   pathway   MAPK  tramite  effetto  paradosso  (Fig.  1.5)29-­‐32_{.  Il  farmaco  infatti  può  legarsi  a  bassa}  

affinità   in   uno   dei   due   siti   chinasici   dell’omodimero   BRAF-­‐BRAF   wild-­‐type,   determinando   una   trans-­‐attivazione   del   sito   chinasico   libero   con   il   risultato   di   attivare  MEK  e  l’intero  pathway  MAPK.    

Tale   effetto   paradosso   è   la   causa   di   alcuni   degli   effetti   collaterali   del   farmaco.   Infatti,   nel   trattamento   del   paziente   con   il   farmaco,   avviene   una   riduzione   del   tumore  accompagnata  a  volte  dalla  comparsa  di  lesioni  della  pelle  come  carcinoma   squamoso  cellulare  e  cheratoacantomi  (KA)33_{,  le  quali  si  originano  da  cellule  della}  

pelle  BRAF  wild  type.  

Fig.  1.5  Schema  della  diversa  risposta  al  vemurafenib  di  BRAF  (transattivazione)  e  BRAFV600E  

(inibizione).34  

           1.2.3  Resistenza  acquisita  al  Vemurafenib  

Nei  pazienti  con  melanoma  metastatico  BRAFV600E,  i  trial  clinici  del  trattamento  con   Vemurafenib  indicano  che,  nel  50%  dei  malati  trattati,  si  osserva  una  diminuzione   della  crescita  della  metastasi  e/o  del  tumore  stesso.  

Ciononostante,  dopo  alcuni  mesi  di  trattamento,  si  nota  che  tutti  i  pazienti  hanno   una  ricaduta  con  ricomparsa  delle  metastasi  e  una  nuova  progressione  del  tumore;   questo  fenomeno  è  noto  come  Resistenza  Acquisita  al  farmaco  (Fig.  1.6).    

La  resistenza  acquisita  verso  un  farmaco  target-­‐specifico  può  essere  provocata  da   mutazioni   secondarie   a   livello   del   target   farmacologico   che   rendono   inattivo   il  

normale   meccanismo   d’azione   del   farmaco   contro   il   suo   target,   impedendone   il   legame   con   il   sito   attivo;   oppure   all’attivazione   di   pathway   alternativi   che   permettono  di  bypassare  l’azione  del  farmaco35_.  

Fig.  1.6  Resistenza  acquisita  al  Vemurafenib  

Sono  stati  fatti  molti  studi  per  capire  quali  fossero  i  meccanismi  che  conferiscono   resistenza   acquisita   al   Vemurafenib.   I   meccanismi   identificati   possono   essere   classificati  in  due  categorie:  

-­‐  Meccanismi  causati  da  una  riattivazione  del  pathway  MAPK  stesso   -­‐  Meccanismi  causati  da  un’iperattivazione  di  altri  pathways.  

I   meccanismi   più   comuni   che   portano   alla   riattivazione   del   pathway   MAPK   sono   mutazioni   a   carico   di   RAS36_{,   transattivazione   ad   opera   di   CRAF}21_{,   attivazione   di}  

MEK1  dovuta  a  mutazione35,  splicing  alternativo  di  BRAF34,  amplificazione  genica  di   BRAF37_.              

           1.2.4  Meccanismi  di  resistenza  acquisita  mediati  da  BRAF  

Uno  dei  meccanismi  di  resistenza  frequentemente  osservati,  sia  nei  pazienti  trattati   con   il   Vemurafenib   che   giungono   a   resistenza,   che   in   esperimenti   in   vitro,   è   la   presenza  di  varianti  di  splicing  di  BRAF.  In  tutte  le  varianti  di  splicing  identificate  è   stata  riscontrata  la  mancanza  di  alcuni  esoni  al  5’  dell’RNA  che  includono  il  dominio   di  interazione  di  BRAF  con  RAS  (RAS  Binding  Domain,  RBD)34,  codificato  dagli  esoni   3-­‐5   (Fig.   1.7).   In   letteratura   ancora   non   è   nota   la   mutazione   o   il   meccanismo   epigenetico   responsabile   dell’espressione   delle   varianti   di   splicing   di   BRAF,   ma   è   stato  visto  che  la  forma  tronca  di  BRAFV600E  è  in  grado  di  esplicare  la  sua  funzione   agendo  come  dimero  (come  BRAF  wt)  e  non  come  monomero  (come  BRAFV600E  _Full  

Lenght).   La   dimerizzazione   di   due   varianti   di   splicing   rende   le   cellule   resistenti   all’inibitore  perché  il  farmaco,  legandosi  ad  uno  dei  due  protomeri,  determina  una   variazione   allosterica   del   secondo   che   di   conseguenza   riduce   la   sua   affinità   per   l’inibitore  di  RAF38  _{(Fig.  1.8).  In  questo  modo,  anche  in  presenza  del  farmaco,  non  si}  

ha   l’inibizione   dell’attività   di   BRAF   e   il   pathway   delle   MAPK   diviene   nuovamente   attivo.  

Fig.  1.8  Meccanismo  di  resistenza  acquisita  di  BRAFV600E  38  

Un  altro  meccanismo  di  resistenza  acquisita  al  Vemurafenib  è  dovuto  a  un  aumento   del  numero  di  copie  di  BRAFV600E  a  causa  di  eventi  di  duplicazione  genica.  Questo   tipo  di  meccanismo  è  stato  trovato  nel  20%  dei  pazienti  oggetto  di  uno  studio  nel   201037_.                                      

     1.3  Il  lievito  Saccharomyces  cerevisiae  nella  ricerca  medica  e    

                   nella  genetica  umana  

Il  lievito  Saccharomyces  cerevisiae  risulta  essere  ottimo  come  organismo  modello  in   quanto   è   un   eucariote   unicellulare   di   ridotte   dimensioni   (diametro   5-­‐10   μm);   possiede  un  tempo  di  generazione  breve  (tempo  di  raddoppio  1,5-­‐2  ore  a  30°C)  e   quindi  può  essere  facilmente  coltivato;  può  essere  geneticamente  manipolato  con   facilità.   Inoltre,   la   capacità   di   crescere   ceppi   aploidi   di   Saccharomyces   cerevisiae   semplifica  la  creazione  di  ceppi  knock-­‐out  per  specifici  geni.  

Il   lievito   Saccharomyces   cerevisiae   rappresenta   un   ottimo   modello   per   studiare   pathways   alterati   in   malattie   umane,   in   quanto   condivide   circa   il   31%   del   suo   genoma   con   l'uomo   e   viceversa,   quasi   il   50%   dei   geni   umani   coinvolti   in   malattie   ereditarie  presentano  i  loro  omologhi  nel  lievito39.  Molte  proteine  importanti  nella   biologia  umana,  sono  state  scoperte  studiando  le  proteine  omologhe  presenti  nel   lievito.  Queste  proteine  includono  proteine  di  segnalazione  e  proteine  implicate  nel   ciclo  cellulare.  

L’utilizzo   del   lievito   Saccharomyces   cerevisiae   ha   permesso   di   dare   un   contributo   anche   riguardo   la   scoperta   dei   meccanismi   molecolari   coinvolti   nello   sviluppo   del   cancro.  

Le  cellule  tumorali  presentano  molteplici  alterazioni  nel  loro  genoma,  e  per  questo   è  difficile  comprendere  il  contributo  specifico  che  ogni  modifica  dà  alle  cellule.  Per   questo  motivo  sistemi  modello  isogenici,  come  il  lievito  Saccharomyces  cerevisiae,   hanno  contribuito  alla  scoperta  degli  aspetti  molecolari  collegati  direttamente  allo   sviluppo  del  cancro,  e  alla  determinazione  di  quali  siano  i  contesti  genetici  associati   alla   sensibilità   o   alla   resistenza   delle   cellule   cancerose   nei   confronti   dei   farmaci   antitumorali40_.  

Per  fare  alcuni  esempi,  screening  genetici  in  lievito  Saccharomyces  cerevisiae  hanno   permesso   di   chiarire   aspetti   importanti   su   malattie   come:   il   diabete   di   tipo   2   (riferimento);   cancro   al   colon   (riferimento);   neurofibromatosi   di   tipo   I;   Atassia  

telangiectasia  e  la  sindrome  di  Werner  (riferimento).  Sono  stati  scoperti  inoltre  dei   geni   coinvolti   in   un’ampia   varietà   di   disordini   neurodegenerativi   causati   dal   misfolding   di   proteine,   come   ad   esempio   l’Alzheimer,   la   Chorea   di   Huntington   e   malattie  dovute  a  difetti  mitocondriali41_.    

           1.3.1  Il  pathway  delle  MAPK  nel  Saccharomyces  Cerevisiae  

Le  proteine  del  pathway  delle  MAPK  sono  conservate  in  tutte  le  cellule  eucariotiche   e   il   lievito   probabilmente   rappresenta   l’organismo   modello   dove   la   loro   l’organizzazione   e   regolazione   sono   maggiormente   comprese.   In   Saccharomyces  

cerevisiae,   sono   stati   infatti   caratterizzati   cinque   pathway   delle   MAPK,   che   sono  

coinvolti   nel   rimodellamento   della   parete   cellulare,   nella   nutrient   deprivation   e   nella  risposta  a  stress  (come  variazione  di  osmolarità).  Tutti  i  membri  componenti   dei   pathway   del   lievito   hanno   la   loro   controparte   conservata   nelle   cellule   di   mammifero.42  _{Un  esempio  è  la  proteina  PBS2,  coinvolta  nella  risposta  alle  variazioni}  

di  osmolarità,  ortologo  della  proteina  MEK1  nell’uomo43  (Fig.  1.9)  

Fig.  1.9  Schema  dei  pathway  delle  MAPK  in  mammiferi  e  lievito44  

Nei  mammiferi  il  pathway  comprende  Raf,  MEK1;  mentre  in  lievito,  in  risposta  a  stress  salino,   troviamo  l’attivazione  del  pathway  con  i  relativi  ortologhi  Ste11  e  Pbs2  

   1.3.2  Yeast  Deletion  Pool  

Nel  1996,  il  “Saccharomyces  Genome  Project”  identificò  più  di  6.000  Open  Reading   Frame   (ORFs)   nel   genoma   di   Saccharomyces   cerevisiae.   Il   18,2%   di   questi   ha   un   ruolo  “essenziale”  per  la  crescita;  mentre  del  30%    di  queste  ORF  non  conosciamo   ancora  la  funzione  molecolare  precisa.    

Una   delle   pietre   miliari   nel   campo   della   genomica   funzionale   di   lievito   è   stata   la   costruzione  di  un  set  completo  di  mutanti,  che  presentano  delezioni  per  geni  non   essenziali.  Questa  serie  di  mutanti  nulli  ha  consentito  per  la  prima  volta  un'analisi   funzionale  completa  del  genoma  del  lievito45.  L’utilizzo  di  tali  librerie  ha  permesso   inoltre   di   identificare   possibili   farmaci   o   interattori   di   geni   che   sono   stati   trovati   mutati   nelle   cellule   tumorali.   Inoltre   con   questo   metodo   si   possono   identificare   composti   che   interferiscono   con   gli   effetti   tossici   dovuti   all’espressione   di   una   proteina  nel  lievito.  

Lo   scopo   della   creazione   di   questo   set   completo   di   mutanti   è   stato   quello   di   generare   un   insieme   più   completo   possibile   di   ceppi   di   lievito   deleti   per   ciascuna   delle   diverse   ORF,   con   l'obiettivo   generale   di   scoprire   le   funzioni   di   questi   ORF   attraverso  l'analisi  fenotipica  dei  mutanti.  

Il  metodo  utilizzato  per  riuscire  ad  eliminare  ogni  ORF  in  questione  è  basato  su  PCR.     Ogni  gene  è  stato  deleto  venendo  sostituito  con  un  modulo  KanMX,  che  conferisce   la  resistenza  alla  Geneticina  (G418)  a  quei  cloni  che  hanno  integrato  il  frammento.   KanMX  ha,  a  ciascuno  dei  suoi  lati,  una  sequenza  di  20  bp  detta  “Barcode”.  Questi   barcode  sono  diversi  per  ogni  clone  e  quindi  identificano  la  sequenza  specifica  del   gene  che  è  stato  deleto.  A  sua  volta,  ai  lati  di  ognuna  di  queste  due  sequenze,  ci   sono   4   sequenze   riconoscibili   da   2   coppie   di   primer   diversi   (U1,   Kan   B   e   Kan   C,   D1)  (Fig.  1.10)  

Fig.  1.10  Costruzione  del  pool  di  ceppi  di  lievito  deleti  mediante  la  tecnica  della  MULTIPLE   PCR  

Ogni  cassetta  è  stata  costruita  utilizzando  due  reazioni  sequenziali  di  amplificazione   mediante  PCR.  Nella  prima  reazione  di  amplificazione,  sono  stati  utilizzati  un  UPTAG  

primer   di  74  bp  e  un  DNTAG   primer   di  74  bp  per  amplificare  il  gene  KanMX4  dal  

plasmide   pFA6-­‐kanMX4   DNA.   I   primer   sono   così   costituiti:   18   bp   di   sequenza   genomica  che  fiancheggiano  la  regione  5'  e  la  3'  della  ORF  da  eliminare;  18  e  17  bp   di   sequenza   comune   a   tutte   le   interruzioni   del   gene   (U1:   5'-­‐ GATGTCCACGAGGTCTCT-­‐   3'   o   D1:   5'-­‐CGGTGTCGGTCTCGTAG-­‐3');   una   sequenza   unica   di   20   bp   che   rappresenta   la   sequenza   “Barcode”;   e   19   bp   di   sequenza   omologa   alla   cassetta   KanMX4   (U2:   5'-­‐CGTACGCTGCAGGTCGAC-­‐3'   e   D2:5'-­‐ ATCGATGAATTCGAGCTCG-­‐3').  

Nella  seconda  reazione  PCR  vengono  utilizzati  due  oligonucleotidi  da  45  bp  (UP_45   e   DOWN_45)   specifici   nei   confronti   della   ORF   da   eliminare.   Sono   necessari   per   estendere   la   regione   di   omologia   specifica   per   la   ORF,   aumentando   così   la   specificità  di  targeting  della  cassetta  grazie  al  fenomeno  di  ricombinazione  omologa  

presente  nel  lievito  Saccharomyces  cerevisiae.  

Le  U1/D1  e  U2/D2  sono  sequenze  comuni  a  tutti  i  ceppi  deleti  con  questa  metodica;   sono   utilizzate   per   amplificare   la   regione   barcode   tramite   la   reazione   di   amplificazione   della   PCR   per   riuscire   ad   identificare   quale   sia   il   gene   deleto   del   clone  sotto  studio.  

Così   facendo   sono   state   generate   quattro   diverse   collezioni   di   mutanti:   aploidi,   diploidi  omozigoti  per  geni  non  essenziali  e  diploidi  eterozigoti,  che  contengono  le   ORF  essenziali  e  non  essenziali  delete.  

Nel   nostro   caso,   la   libreria   utilizzata   è   costituita   dal   ceppo   diploide   BY4743;   essa   consiste  in  4.741  cloni  diploidi  omozigoti  MATa/MATα  .    

S

COPO  DELLA  TESI

L’identificazione  di  proteine  che  regolano    l’attività  della  proteina  BRAFV600E  _risulta  

essere    importante  non  solo  per  riuscire  a  comprendere  i  meccanismi  di  resistenza   acquisita  al  vemurafenib  ma  anche  al  fine  di  identificare  nuovi  target  terapeutici  per   i   melanomi   con   BRAFV600E_{.   Il   lievito   Saccharomyces   cerevisiae   è   stato   largamente}  

usato  come  modello  per  l’identificazione  di  pathway  coinvolti  in  malattie  umane  e,   in  particolare  l’Yeast  Deletion  pool  (collezione  di  ceppi  di  lievito  deleti  in  geni  non   essenziali),   si   è   rivelato   essere   un   ottimo   strumento   per   identificare   interattori   funzionali   di   proteine   umane.   Lo   scopo   del   mio   progetto   è   stato   quello   di   identificare   geni   che,   se   deleti,   possano   determinare   morte   o   rallentamento   di   crescita,  delle  cellule  di  lievito,  in  presenza  della  forma  mutata  di  BRAF  (BRAFV600E)   effettuando  uno  screening  sull’Yeast  Deletion  pool  trasformato  con  BRAFV600E.  Tali   geni  possono  essere  considerati  interattori  funzionali  di  BRAFV600E,  ovvero  proteine   che  se  alterate  nella  loro  espressione  possono  alterare  l’attività  di  BRAFV600E  anche   se  non  interagiscono  fisicamente  con  BRAFV600E.  

2.

M

ATERIALI  E  METODI

     2.1  Vettore  plasmidico  pGEM-­‐T  Easy  

Prima   di   clonare   il   gene   BRAFV600E   _{nel   plasmide   pYES2,   l’ho   amplificato   per   PCR   e}  

clonato  nel  vettore  pGEM-­‐  T  easy.  Questo  è  un  vettore  linearizzato  con  una  singola   timidina  3’-­‐terminale  ad  entrambe  le  estremità.  Le  code  di  T  nel  sito  di  inserzione   migliorano  notevolmente  l'efficienza  della  ligation  dei  prodotti  di  PCR,  impedendo   la   richiusura   del   vettore   e   fornendo   una   sporgenza   compatibile   per   prodotti   PCR   generati   da   polimerasi   termostabili.   I   vettori   pGEM-­‐T   Easy   (Fig.   2.1)   contengono   promotori  RNA  polimerasi  T7  e  SP6  che  fiancheggiano  un  sito  multiplo  di  clonaggio   all’interno   della   regione   codificante   l’α-­‐peptide   dell’enzima   β-­‐galattosidasi.   Se   il   gene   di   nostro   interesse   si   inserisce   nel   MCS,   il   gene   lacZ   viene   interrotto   ed   il   substrato  X-­‐  GAL  aggiunto  nelle  piastre  non  può  più  essere  metabolizzato;  quindi  i   cloni   trasformati   sono   selezionati   per   la   presenza   dell’inserto   in   quanto   formano   colonie   di   colore   bianco,   contenenti   il   plasmide   con   l’inserto,   o   blu,   contenenti   il   plasmide  senza  inserto.    

Il  vettore  contiene  i  seguenti  elementi:   § Promotore  T7  RNA  polimerasi  

§ sito  d’inizio  della  trascrizione  per  la  T7  RNA  polimerasi:   § Sito  multiplo  di  clonaggio    

§ promotore  per  SP6  RNA  Polimerasi    

§ sito  d’inizio  della  trascrizione  per  la  RNA  polimerasi  SP6     § il  gene  lacZ    (β-­‐lactamase):  

§ phage  f1  region   § lac  operon  sequences    

Figura  2.1  Caratteristiche  del  vettore  pGEM-­‐T  easy  

     2.2  PCR  di  BRAF

A   partire   dal   cDNA   ho   amplificato   per   PCR   la   sequenza   codificante   di   BRAFV600E_.  

Seguendo   il   protocollo   fornito   dal   produttore,   ho   eseguito   la   retrotrascrizione   dell’mRNA  totale  a  cDNA  con  il  kit  iScriptTM  cDNA  Synthesis  (Biorad®).    

Ho   condotto   l’amplificazione   di   BRAFV600E   _{per   PCR   utilizzando   la   Taq   polimerasi}  

proof  reading  “Phusion  Flash  High-­‐Fidelity  PCR  Master  Mix”  (Thermo  Scientific®).  Le   condizioni  e  i  primers  utilizzati  sono  riportati  nello  schema  seguente:  

         98°C        (10’’)        98°C          (  1’’)    55-­‐65°C  (  5’’  )                35  cicli          72°C        (40’’)       Master  Mix  2X              10  µl   DNA  (10  ng/µl)              2  µl   Primer  F  Hind  III          1  µl       Primer  R  Sac  I                  1  µl   H2O                                                      6  µl  

-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐                                                Tot  =  20  µl    

Ho  separato  i  prodotti  di  PCR  su  gel  d’agarosio  all’1%,  e  successivamente  ho  tagliato   e   purificato   da   gel   le   bande   di   interesse   utilizzando   QIAquick   Gel   Extraction   Kit   (Qiagen®)            

     2.3  Clonaggio  del  pGEM  

All’estremità   delle   bande   di   PCR   purificate   ho   aggiunto   una   coda   di   poly-­‐Adenina   (polyA)  incubando  poi  30  minuti  a  70°C  con  la  polimerasi  GoTaq  (Promega®),  GoTaq   Buffer  5X  e  dATPs  4mM.    

Successivamente   ho   clonato   i   prodotti   di   PCR   poliadenilati   nel   plasmide   pGEM®-­‐T   Easy   (Promega®)   seguendo   il   protocollo   fornito   dal   produttore,   e   trasformato   il   vettore  pGEM-­‐BRAFV600E  _{in  cellule  competenti  DH5α.}  

     2.4  Vettore  plasmidico  pYES2  

Per   esprimere   in   lievito   il   gene   BRAFV600E_{,   ho   utilizzato   il   vettore   pYES2   (Fig.   2.2).}  

Questo   vettore,   progettato   per   l’espressione   di   proteine   ricombinanti   in  

Saccharomyces   cerevisiae,   è   lungo   5.9   kb.   Le   caratteristiche   di   questo   vettore  

permettono   di   clonare   facilmente   geni   di   interesse   e   selezionare   le   cellule   trasformate  grazie  alla  presenza  del  gene  URA3,  codificante  un  enzima  della  catena   biosintetica  dell’uracile.    

Il  vettore  contiene  i  seguenti  elementi:  

§ Promotore   GAL1:   essenziale   per   avere   un   alto   livello   di   espressione   di  

proteina  inducibile  (in  lievito)  tramite  galattosio46  

§ Promotore   per   la   T7   RNA   polimerasi   e   sito   d’inizio   della   trascrizione:  

permette  la  trascrizione  in  vitro  con  orientamento  senso  e  sequenziamento   dell’inserto  

§ Sito  multiplo  di  clonaggio:  consente  l’inserzione  del  nostro  gene  in  pYES2  

§ Terminatore   trascrizionale   CYC1:   permette   un’efficiente   terminazione   e  

stabilizzazione  dell’mRNA  

§ Origine  pUC:  origine  di  replicazione  batterica  in  E.  coli  

§ Gene  resistente  all’ampicillina:  selezione  dei  trasformati  in  E.  coli  

§ Gene   URA3:   per   selezionare   i   trasformanti   in   ceppi   di   lievito   ospitanti   con  

genotipo  ura3  

§ Origine  2μ:  origine  di  replicazione  del  lievito  

§ Origine   f1:   origine   di   replicazione   del   fago   f1   -­‐   recupero   del   DNA   single-­‐