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UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE
Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
“Creatinina ematica nel cane:
studio retrospettivo in tre anni di attività (2012–2014)”
Relatore:
Prof.ssa Grazia Guidi
Candidato:
Anna Kukharskaya
Correlatore:
Dott.ssa Ilaria Lippi
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INDICE
RIASSUNTO/ABSTRACT...4
INTRODUZIONE...6
PARTE GENERALE CAPITOLO 1. Definizione e caratteristiche principali della creatinina...8
1.1 Storia della scoperta della creatina e creatinina...9
1.2 Sintesi della creatina e creatinina...11
1.3 Il ruolo della creatina nel corpo...13
1.4 Eliminazione urinaria della creatinina ...14
1.5 Le proprietà diagnostiche di creatinina e dei suoi derivati...16
1.6 Metodi di determinazione della creatinina nel sangue e nelle urine...17
1.7 Determinazione della creatina a livello dei tessuti...18
CAPITOLO 2. Il valore della creatinina nel corpo del cane...19
2.1 Il tasso di creatinina nel contenuto del corpo del cane...19
2.2 Fattori di variazione...21 Sesso ed età. ...21 Peso/massa muscolare...21 Stile di vita...21 Stagione. ...21 Ritmi biologici...21
Sito anatomico del prelievo di sangue...22
Sforzo fisico...22
Effetti dei farmaci...22
2.3 La ricerca di livelli di creatinina nel plasma e nelle urine nel cane...24
2.3.1 La creatinina nel sangue...24
2.3.2. Creatinina nelle urine...26
CAPITOLO 3. La clearence renale e la sua misurazione...27
CAPITOLO 4. Le malattie dei cani, diagnosticate dal livello di creatinina...32
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4.2. Uroaddome...36
4.3. Nefropatia ereditaria...38
PARTE SPERIMENTALE CAPITOLO 5. Studio...40
5.1. Scopo della tesi...40
5.2. Materiali e metodi...40 5.3. Risultati...42 4.4. Discussione...161 4.5. Conclusioni...165 Bibliografia...166 Ringraziamenti
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Riassunto
Parole chiave: cane, creatinina, paziente con danno renale, funzionalità renale, studio retrospettivo.
Obiettivo: La creatina ha un importante ruolo fisiologico nell’organismo: è infatti l'indicatore più caratteristico per la ricerca delle malattie renali. La raccolta anamnestica e l’esame fisico nelle fasi iniziali della nefropatia cronica del cane è poco indicativa, soprattutto a causa dell'assenza di manifestazioni cliniche, a causa dell’enorme possibilità compensativa dei reni. Pertanto, un test diagnostico precoce della riduzione della funzionalità renale è una delle priorità della moderna nefrologia veterinaria. Ad oggi, la valutazione della creatinina sierica resta il gold standard per la diagnosi della malattia renale sia cronica che acuta. Questo studio retrospettivo ha lo scopo di confrontare la creatinina ematica nei cani e valutarne la variabilità in relazione all’eta, al peso e alla razza.
Materiali e metodi: In questo lavoro è stato eseguito uno studio retrospettivo su 2705 cani presso l’Ospedale Didattico Veterinario “M. Modenato” dell’Università di Pisa. Sono stati valutati i livelli di creatinina di 27 razze canine di diverse età, basandosi su dati raccolti tra il 2012 e il 2014. I cani sono stati divisi in razze e fascia di età: da 1 a 3 anni, da 4 a 7 anni e da 8 a 18 anni. Sono stati selezionati quei soggetti che avevano una concentrazione ematica di creatinina inferiore a 1,5mg/dl.
Risultati: Dalla valutazione statistica è emerso che non esiste alcuna correlazione tra i livelli sierici di creatinina e l’età dei cani inclusi nello studio. I risultati hanno evidenziato una correlazione positiva, sebbene molto debole, fra livelli di creatinina e peso in alcune razze (barboncino, pastore tedesco, beagle, carlino, cavalier king spaniel, dobermann e rottweiler); nelle altre razze invece, il peso non sembra influenzare i valori della creatinina. Infine, confrontando i valori di creatinina tra le varie razze, non emergono differenze statisticamente significative.
Conclusioni: Concludendo, i risultati ottenuti confermano l’alta variabilità all’interno del range fisiologico della creatinina in soggetti di diversa età, razza e grandezza. Per questo motivo si conferma quanto la creatinina sia altamente variabile e influenzabile da fattori diversi, pur essendo riconosciuta come test diagnostico di prima scelta nella diagnosi delle patologie renali.
Un’ulteriore ricerca sarebbe auspicabile in futuro, per ampliare la casistica e per selezionare pazienti sani, con stato d’idratazione normale e BCS nella norma.
Abstract
Key words: dog, creatinine, patient with renal failer, renal function, retrospective study.
Objective: A creatinine has an important physiological role in the organism: it is the most characteristic indicator of kidney disease research. Anamnesis and physical examination at the initial stages of dog’s chronic nephropathy is not indicative, mainly due to the absence of clinical manifestations due to the kidneys’ compensatory capacity. Therefore, an early diagnosis of renal failure is one of the priorities of modern veterinary nephrology. Nowadays, an evaluation of serum creatinine remains the gold standard for the diagnosis of both chronic and acute renal diseases. This retrospective study aims to compare the levels of blood creatinine in dogs and evaluate its variability in relation to age, weight, and breed.
Materials and Methods: 2705 canine patients presented to the "Mario Modenato" Veterinary Teaching Hospital of the Department of Veterinary Sciences, Pisa University, Italy were enrolled un this retrospective study. Creatinine levels of 27 dog breeds of different ages between the 2012 and 2014 were evaluated. The dogs were divided into breeds and age
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ranges: from 1 to 3 years, from 4 to 7 years and from 8 to 18 years. The animals with a creatinine blood concentration below 1.5mg/dl were considered in the study.
Results: The statistical analysis has shown no correlation between serum creatinine levels and age of the dogs included in the study. A positive, though very weak, correlation between creatinine and weight levels was obtained in some breeds (Poodle, German shepherd, Beagle, Pug, Cavalier king spaniel, Doberman and Rottweiler); in other breeds, weight does not seem to affect creatinine values. Finally, no statistically significant differences were found between creatinine levels in different breeds.
Conclusions: The results obtained confirm the creatinine’s high variability within the physiological range in animals of different ages, breeds and sizes. It confirms high creatinine variability and it dependence of different factors, although it’s recognized as a first-rate diagnostic test in the diagnosis of kidney disease. A further research should be made to extend the number of animals considering healthy patients with normal hydration and normal BCS status.
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Introduzione
La creatinina (1 metilglicotsiamidin) in tutti i vertebrati e gli esseri umani è uno dei prodotti finali del metabolismo dell'azoto e viene escreto con le urine. Nel corpo, la creatinina è prodotta a partire dalla creatina, una componente importante del metabolismo dell'azoto.
La creatina ha un importante ruolo fisiologico nell’organismo. Si lega al residuo di acido fosforico per formare il creatininfosfato, che è ricco di titoli ad alta energia. Nel tessuto muscolare, il creatinfosfato è utilizzato come fonte di energia per la contrazione muscolarie.
La creatina può essere introdotta con la dieta, mediante gli alimenti a base di carne, ma l’organismo è anche in grado di sintetizzarla a livello renale ed epatico.
La creatina, in laboratorio, viene utilizzata raramente come test diagnostico: più spesso si utilizza il suo derivato, la creatinina.
Quando il cane presenta sintomi riferibili a insufficienza renale come perdita di appetito, letargia, diarrea, vomito, perdita di peso, ulcere buccali, aumento della sete (polidipsia) o se si osserva mancata capacità di concentrazione delle urine da parte dell'animale, con relativo aumento del volume totale, si consiglia di eseguire un'analisi del sangue per determinare i livelli di creatinina e di azoto ureico.
La creatinina è infatti l'indicatore più caratteristico per la ricerca delle malattie renali. Di solito, si può sospettare una patologia renale, quando il livello della creatinina è superiore alla norma (il livello normale è di solito circa 1,6 mg/dL o 141 µmol/l). Tuttavia, questo parametro non fornisce indicazioni sulla tipologia di problema in corso (acuto o cronico), né sulla causa o tantomeno sulla terapia da intraprendere. Tuttavia ci dimostra chiaramente che i reni dell’animale sono in sofferenza e che è necessario agire prontamente per porre rimedio.
La precisione nella determinazione della creatinina plasmatica è influenzata da diversi fattori. Per esempio, la maggior parte dei mangimi per cani contiene una certa quantità di creatinina, quindi nel periodo immediatamente post-prandiale la concentrazione della creatinina sierica potrebbe aumentare sopra i livelli normali e questo potrebbe falsare la lettura dei risultati del test. Perciò i campioni di sangue devono essere presi a stomaco vuoto: nel cane viene di solito ritenuto sufficiente un digiuno di 12 ore durante la notte.
I dati pubblicati sul valore ammissibile di creatinina nel plasma sanguigno del cane sono molto variabili (Lefebvre HP, Watson ADJ, Toutain PL, Braun JP., 1998). Non è quindi raccomandato utilizzare i dati o soglie indicate in letteratura, ma quelli intervalli di
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riferimento del laboratorio (Braun J. P. , Lefebvre H. P. , Watson A. D.J., 2003). Nell'interpretazione dei risultati è necessario ricordare che ciò è dipendente in parte dalle caratteristiche delle popolazioni di cani testate e alla variabilità fisiologica dei livelli di creatinina in base all’età, alla razza e ad altri fattori. Il livello di creatinina ad esempio, è superiore nei soggetti adulti rispetto ai cuccioli; inoltre, cani con una importante massa muscolare e che svolgano molta attività fisica presentano livelli basali di creatinina superiori. Il livello sierico di creatinina è sensibile anche al contenuto di proteine nella dieta: il livello basale di creatinina è maggiore nei cani alimentati a base di carne cruda, rispetto ai cani che mangiano mangime secco.
I veterinari, nella loro pratica clinica, dovrebbero tener conto di quanto detto ed interpretare perciò con molta cautela un leggero eccesso di creatinina. E' comunque importante ricordare che si può anche verificare un’insufficienza renale con concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno entro i limiti normali.
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PARTE GENERALE
CAPITOLO 1. Definizione e caratteristiche principali della creatinina
La creatinina è una piccola molecola (massa molecolare 113 dalton), molto solubile in acqua (~ 750 mmol/L, ~ 85 g/L), prodotto da ciclizzazione da creatinfosfato e creatina (Figura 1). Creatina e creatinina derivano soprattutto dalla biosintesi degli amminoacidi glicina, arginina e metionina, ma parzialmente anche dell’elevata concentrazione di creatina (e in misura minore della creatinina) nella carne.
Creatinfosfato Creatina Creatinina Figura 1. Struttura della creatinfosfato, creatina, e creatinina.
La concentrazione di creatina è alta nella carne, mentre la concentrazione di creatinina è di circa 10 volte inferiore, con valori di 30–45 micromoli/g e 2–4 mmol/g, rispettivamente, misurate nella carne di manzo (Harris RC, Lowe JA, Warnes K, 1997).
Tra il 20% e il 65% della creatina si trasforma in creatinina durante la cottura. Nell’alimentazione commerciale, le concentrazioni di creatina sono infatti molto più basse, in genere in 0,5–2,0 mmol/g, rispetto alla carne cruda (Harris RC, Lowe JA,Warnes K, 1997).
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1.1 Storia della scoperta della creatina e creatinina
1832 La creatina viene scoperta per la prima volta, nelle carni rosse, dallo scienziato
francese Chevreul che trovò una sostanza nei muscoli scheletrici, non ancora conosciuta, che chiamò creatina, dal greco “kreas”, che significa “carne” (Balsom et al., 1994; Feldman, 1999).).
1847 Justus von Lieberg confermò che la creatina era un normale costituente della
carne e osservò che la carne di volpi selvatiche conteneva una quantità di creatina dieci volte superiore alla concentrazione presente in quella delle volpi tenute in cattività. Ipotizzò così che l’attività motoria comportasse un incremento della concentrazione muscolare di creatina. Circa nello stesso periodo, i ricercatori Heintz e Pettenkofer, evidenziarono nelle urine una sostanza che Lieberg confermò essere la creatinina. Sulla base dell’osservazione che l’escrezione urinaria di creatinina era correlata alla massa muscolare, si pensò che essa fosse un prodotto metabolico della creatina contenuta nei muscoli (Nancy Romanchak, Melanie Johns Cupp, 2003).
1886 Jaffè descrisse il metodo per determinare la creatinina (Sheshadri Narayanan,
Advances in clinical chemistry, 1992, vol.29, p.146).
1900 Nei primi anni del XX° secolo, estraendo la creatina dalla carne e dalle urine, si
notò che non tutta la sostanza somministrata all’animale o all’uomo veniva poi evidenziata nelle urine sottoforma di creatinina. Si arrivò perciò a pensare che parte della creatina potesse essere trattenuta nell’organismo per scopi plastici o energetici (Nancy Romanchak, Melanie Johns Cupp, 2003).
1912-1914 Studi condotti dai ricercatori Folin e Denis, dimostrarono che il suo
contenuto muscolare poteva essere incrementato con assunzioni supplementari di creatina nella dieta. Nei gatti venne infatti riscontrato un aumento della sua concentrazione a livello di tessuto muscolare fino al 70% (Nancy Romanchak, Melanie Johns Cupp, 2003).
1923 Hahn e Meyer stimarono che per un uomo di 70 Kg il contenuto totale di creatina
fosse di circa 140 g (2 g/Kg).
1927 I ricercatori Fiske e Subbarow scoprirono l’esistenza della fosfocreatina (o
creatinfosfato), molecola di creatina e fosfato unita mediante un legame chimico e immagazzinate nei tessuti muscolari (Fiske, Cyrus H.; Subbarow, Yellapragada, 1927).
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Si scoprì poi che questa sostanza aveva un ruolo fondamentale nella contrazione muscolare.
Oggi la creatina è uno degli integratori alimentari più utilizzati da tutti gli atleti. Dal 1992 la creatinina è divenuto un additivo alimentare ampiamente utilizzato nell’ambito del bodybuilding.
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1.2 Sintesi della creatina e creatinina
Il processo metabolico di sintesi della creatina avviene in due fasi:
1. All’inizio, nei reni e nel pancreas si forma guanidinoacetato come risultato del trasferimento del gruppo ammidico dall’arginina alla glicina (una reazione che viene catalizzata da un enzima L-arginina: glicina amidinotransferasi (AGAT) (Komarov F.I., Korovkin B.F. e Menshikov V.V., 1981). Anche se la presenza di AGAT è stata confermata nel fegato di alcuni mammiferi, come i bovini e gli esseri umani, non è stato tuttavia rilevato nel fegato canino.
2. Nel fegato e nel pancreas avviene il processo di metilazione del guanidinoacetato, (reazione catalizzata dalla guanidinoacetate metiltransferasi (GAMT) utilizzando gruppi metilici donati dalla S-adenosilmetionina, portando alla produzione di creatina, che non ha nessuna funzione attualmente conosciuta a livello degli epatociti.
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La creatinina viene sintetizzata nelle cellule muscolari a partire da creatina e creatinfosfato. Questa reazione è un esempio di re-sintesi di ATP e si verifica nel muscolo attivo.
Dal fegato e dal pancreas, la creatina entra nel flusso sanguigno e passa ad altri organi. Tramite un trasportatore “Na+/Cl- dipendente”, penetra nel cervello e nelle cellule muscolari dove viene fosforilata in creatinfosfato da parte dell’enzima creatin-chinasi. Come risultato della disidratazione non enzimatica, circa il 2% di creatina viene convertita in creatinina ed escreta nelle urine. La quota di creatinina che si ritrova nelle urine dipende dal grado di sviluppo della massa muscolare. Quindi è opportuno sottolineare che l'urea, la creatinina ed i sali di ammonio sono il prodotto finale del metabolismo degli aminoacidi e che la loro determinazione nelle urine è un indicatore diagnostico. (Narayanan S, Appleton HD, 1980, Wyss M, Kaddurah-Daouk R. 2000, Kaneko JJ, Harvey JW, Bruss ML, 1997).
La creatinina è il prodotto della disidratazione interna della creatina e della defosforilazione del creatinfosfato. Nel cane sano di razza Beagle, con velocità di filtrazione glomerulare o GFR (Glomerular Filtration Rate) (media ± SD) di 3,3 ± 0,23 ml/min/kg, è stato stimato che la produzione endogena di creatinina è di 380 ± 45 mmol/kg/gg, la concentrazione della creatinina plasmatica (P-creatinina) di 80 ± 12 mmol/L, e la creatinina nell’urina giornaliera (dU-creatinina) di 425 ± 45 μmol/kg/d. La produzione endogena della creatinina si è rivelata inferiore (300 ± 27 mmol/kg/ die) in cani con riduzione sperimentale del 60% della funzionalità renale, ma non era correlata in modo chiaro con il peso corporeo ridotto (Watson ADJ, Lefebvre HP, Concordet D, et al. 2002).
La creatinina è stata trovata anche a bassa concentrazione (< 80 mm/l) nel liquido peritoneale, (Bjorling DE, Latimer KS, Rawlings CA, Kolata RJ, Crowe DT. 1983; Burrows CF, Bovée KC, 1974), nel liquido sinoviale (Damyanovich AZ, Staples JR, Marshall KW, 1999), e nel liquido di lavaggio broncoalveolare (Maden M, Altunok V, Birdane FM, Aslan V, Nizamlioglu M, 2001). Uno studio nel 1950s e 1960 ha mostrato che la piccola quantità della creatinina fu trovata nel vomito e le feci delle persone con uremia.
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1.3 Il ruolo della creatina nel corpo
Nel muscolo scheletrico e nel tessuto cerebrale si forma il creatinfosfato come risultato della reazione reversibile del trasferimento dall'ATP alla creatina. Il creatinfosfato agisce come donatore di energia necessaria per la contrazione muscolare, per il trasporto attivo di ioni nel tessuto nervoso e ad altri tessuti (White А. et al. 1981.). Il suo ruolo è importante all’inizio dello sforzo fisico intenso e di breve durata, perché è in questo momento che il muscolo riceve energia a partire dell’ATP, che è l’incaricato della sua liberazione. La creatina favorisce l’aumento di massa muscolare. Questo si deve al fatto che la creatina genera un aumento del volume delle cellule per via della ritenzione idrica all’interno di ognuna di esse. Questo, allo stesso tempo, stimola i processi di rigenerazione cellulare e ipertrofia, la quale facilita la sintesi di proteine durante le fasi di recupero nell’attività fisica. La creatina accelera la contrazione ed il rilassamento del muscolo, facilitando la liberazione di calcio dal reticolo sarcoplasmico che si trova in ogni cellula. Questo è dovuto al fatto che i ponti di actomiosina che si sono formati, si separano con maggiore rapidità, permettendo alla fibra muscolare di autostimolarsi.
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1.4 Eliminazione urinaria della creatinina
La creatinina viene eliminata dall’organismo mediante le urine. La creatinuria di solito accompagna l’ipercreatinemia, in cui la concentrazione della creatina nel plasma sanguigno supera 122,0 mmol/l (1,6 mg/100 ml). Nel caso di una dieta priva di creatina, come avviene ad esempio nei soggetti vegetariani, il fabbisogno giornaliero è coperto dalla sola sintesi endogena e l’eliminazione urinaria della creatinina risulta molto limitata. Non tutta la creatina somministrata all’animale o all’uomo si ritrova comunque nelle urine, suggerendo che, come accennato in precedenza, parte della creatina possa essere trattenuta dall’organismo a scopi plastici o energetici.
La creatinina viene totalmente filtrata attraverso il glomerulo e non viene riassorbita né secreta dal tubulo (O’Connell JMB, Romeo JA, Mudge GH. 1962, Shannon JA, Jolliffe N,Smith HW., 1932). Per tali ragioni, la creatinina viene generalmente considerata un buon indicatore della velocità di filtrazione glomerulare (Hervè Lefebvre, Jean-Pierre Beaun, 2009; O’Connell JMB, Romeo JA, Mudge GH, 1962).
Una piccola quantità di creatinina è escreta anche nell’intestino tenue e viene degradata dalla flora intestinale; si accumula una quantità piccola, ma non è considerata alterante al confronto con le concentrazioni sieriche di creatinina. Nel cane, nel gatto e nel cavallo la creatinina viene anche escreta dal tratto alimentare, perché essa è diffusibile attraverso la maggior parte delle membrane cellulari.
Alcuni autori segnalano che una secrezione tubulare di creatinina di trascurabile entità sia stata osservata nel cane maschio, mentre altri studi non evidenziano alcuna differenza nell'eliminazione della creatinina secondo il sesso (McCaw DL, Knapp DW, Hewett JE., 1985; Jergens AE, McCaw DL, Hewett JE., 1987). La concentrazione della creatinina urinaria (U-creatinina) ha mostrato differenze tra giorno e notte (McCaw DL, Knapp DW, Hewett JE., 1985), mentre sembra non essere influenzata dal tempo intercorso rispetto al pasto (Jergens AE, McCaw DL, Hewett JE., 1987). L’escrezione totale di U-creatinina è molto diversa nei vari studi, con valori medi di 170–425 μmol/kg/d (Barsanti JA, Finco DR., 1979; Uechi M, Uechi H, Nakayama T, Wakao Y, Takahashi M., 1997).
Queste differenze possono essere dovute alla composizione degli alimenti: i cani nutriti con una dieta a base di carne (31,4% di proteine) eliminano infatti più creatinina rispetto a cani nutriti con una dieta a base di caseina (10,4% di proteine). La variazione della
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concentrazione di U-creatinina è ancora più ampia, varia soprattutto a causa dei cambiamenti nella diluizione delle urine (da 4,7 a 42,0 mmol/L). (Barsanti JA, Finco DR., 1979; Center SA, Wilkinson E, Smith CA, Lewis RM., 1985).
A causa del suo riequilibrio lento, la dialisi è meno efficace nel ridurre la concentrazione di creatinina sierica di quanto lo sia per la concentrazione di BUN. Terapeuticamente, la diuresi del paziente è clinicamente importante per ridurre la concentrazione di creatinina nel siero, ma è anche importante migliorare il flusso ematico renale alla fine di ridurre al massimo possibile la concentrazione di creatinina sierica (Watson AD, Lefebvre HP, 2003).
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1.5 Le proprietà diagnostiche di creatinina e dei suoi derivati
Esistono diverse condizioni fisiologiche in cui si può osservare un aumento della concentrazione di creatinina nelle urine: ad esempio nei cuccioli, nei soggetti in gravidanza e allattamento, così come nel caso di consumo eccessivo di carne, pesce e fegato. L’eccessivo rilascio di creatina può essere anche un segno indicativo di un certo numero di condizioni patologiche: distrofia muscolare progressiva, miastenia gravis, miosite, ipertiroidismo, acromegalia, malattia di Cushing, diabete, patologie del fegato, nefrite, artrite reumatoide, ostruzione intestinale, gravi problemi cardiovascolari, malnutrizione, ipovitaminosi E e C, trattamento a lungo termine con glucocorticoidi (Grande enciclopedia Russa, 1994).
Se si sospetta un attacco cardiaco, o una miopatia o alcune altre malattie, la determinazione dell'attività della creatin-chinasi sierica è un test estremamente indicativo. Nelle malattie del sistema muscolo-scheletrico, si può osservare l altera la conversione della creatina in creatinina, il che porta a una diminuzione della creatinina nel plasma e nelle urine.
La creatinina endogena è l’indicatore più utilizzato per la misurazione della velocità di filtrazione glomerulare. Questa può essere utilizzata anche come indicatore esogeno. La supposta secrezione tubulare e le incertezze sulle determinazioni, inerenti ad alcune metodiche (metodo di Jaffè), possono essere all’origine di errori di misurazione della clearance renale.
La determinazione della creatininemia è l’analisi di prima scelta per valutare la funzionalità renale. Le conseguenze delle affezioni renali possono essere stimate dopo aver eseguito uno ionogramma, valutato l’equilibrio acido-base, la protidemia e l’esame emocromocitometrico.
Così, i dati sul contenuto della creatinina nel plasma sanguigno e la sua escrezione urinaria possono essere utilizzati come indicatori dello stato funzionale renale.
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1.6 Metodi di determinazione della creatinina nel sangue e nelle urine
Gli operatori dei laboratori di diagnostica, per determinare la creatinina sierica e urinaria, utilizzano diversi metodi quantitativi. Tra i metodi più frequentemente utilizzati si annoverano:
1. I metodi basati sulla reazione di Jaffè (sono quelli più ampiamente utilizzati), descritta per la prima volta nel 1886. Essi sfruttano la reazione tra picrato di sodio e creatinina in ambiente alcalino, dando luogo ad un complesso che assume una colorazione rosso-arancio. L’intensità del colore quindi, varierà con l’aumentare della quantità di creatinina presente nel campione.
2. I metodi colorimetrici basati sulla modalità di precipitazione di proteine dal plasma o dal siero. Il metodo enzimatico colorimetrico fa capo all’idrolisi della creatinina e ad altri processi enzimatici, portando anch’essa alla formazione di un colorante la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di creatinina. Anche in questo caso la misurazione avviene fotometricamente.
3. Il metodo più affidabile e sensibile per la determinazione della creatinina nei fluidi biologici è il metodo spettrofotometrico, utilizzando sistemi di creatin-chinasi con enzima coniugato. Il metodo di riferimento per la misura della creatinina è l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Questo metodo è una forma versatile di cromatografia usata con una grande varietà di fasi stazionarie e mobili per separare singoli composti in base alle dimensioni, alla polarità, alla solubilità, alla carica, alle caratteristiche di assorbimento. L’HPLC è un metodo poco usato nei laboratori in quanto richiede una tecnologia relativamente complessa, lenta e costosa.
4. La creatina può inoltre essere misurata fluorimetricamente facendola reagire con la ninidrina. Questo metodo di dosaggio è raramente usato per la sua scarsa precisione dovuta all’instabilità e all’elevato valore della fluorescenza iniziale dei reattivi.
Generalmente la determinazione della creatinina in siero/plasma e urina avviene secondo il metodo di Jaffé e altre varianti con picrato o il metodo enzimatico colorimetrico. L’analisi viene effettuata su apparecchi automatici.
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1.7 Determinazione della creatina a livello dei tessuti.
La concentrazione della creatina nei tessuti (muscolo, cervello) può essere determinata in vivo mediante spettroscopia di risonanza magnetica. Questa tecnica, disponibile attualmente solo presso centri ad alta specializzazione, è particolarmente innovativa in quanto consente di esplorare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di diversi metabolici e la funzionalità di vie metaboliche specifiche (Figura 3) (Salerno C., 2010).
Figura 3. Determinazione della creatina totale e della fosfocreatina nel lobo occipitale del cervello mediante studi in vivo. Spettri di risonanza magnetica del protone (A) e del fosforo (B) eseguiti su un volontario sano.
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CAPITOLO 2. Il valore della creatinina nel corpo del cane.
2.1 Il tasso di creatinina nel contenuto del corpo del caneLa creatinina è l'indicatore più caratteristico nella ricerca delle malattie renali. In genere, se il valore della creatinina è aumentato, può indicare la presenza di problemi renali. Tuttavia, non fornisce alcuna informazione della natura del problema (cronica o acuta), potrebbe non indicare la causa, né la soluzione del problema, ma dimostra chiaramente che i reni del cane si trovano in uno stato di sofferenza.
Tuttavia, in alcuni casi, questo approccio risulta essere errato. In letteratura, i riferimenti del valore di creatinina nel plasma sanguigno sono piuttosto variabili (Figura 4). Questo dipende delle popolazioni testate di cani, così come dall’età, dalla razza e da altri fattori. Per esempio, il livello di creatinina nei cani adulti è superiore che nei cuccioli, ma è anche più alto nei cani con la muscolatura più sviluppata. (Lefebvre HP, Braun JP, 2004).
Figura 4. I diversi valori possibili di creatinina nel plasma sanguigno dei cani (secondo le linee guida veterinario o presso analizzatori Reflotron, Kodak e VetTest).
La Figura 4 mostra che nei dati ottenuti da varie fonti sono presenti differenze significative. Ciò può essere dovuto a differenze legate ai campioni di controllo o al metodi di analisi. Il livello più basso della creatinina considerato fisiologico nel plasma sanguigno dei cani è pari a 35 mmol/L (0,39 mg/dl), e il valore massimo è di 245 mmol/L (2,77 mg/dl).
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A questo proposito, un leggero eccesso rispetto alla norma dovrebbe essere interpretato con cautela: non sempre infatti è indicativo della presenza di problemi renali. E’ tuttavia importante ricordare anche che la disfunzione renale può verificarsi in casi in cui la concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno rimanga entro i limiti normali.
In generale, il costante aumento della creatinina sierica indica un malfunzionamento del filtro renale. Il raddoppio della creatinina sierica corrisponde ad una riduzione del tasso di filtrazione glomerulare del 50 %.
Nel caso di grave insufficienza renale il livello di creatinina nel sangue può raggiungere un valore molto alto 800–900 mmol/l, e ancora più elevata, con valori di riferimento pari 60–180 mmol/L (Lefebvre HP, Braun JP, 2004).
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2.2 Fattori di variazione
Sesso ed età. Sembra esserci poco o nessun effetto del sesso sulla P-creatinina nei cani. I dati pubblicati che riguardano invece l'effetto dell'età sulla P-creatinina sono contrastanti. Nella maggior parte degli studi la P-creatinina risulta diminuita nei primi giorni di vita, il valore rimane piuttosto stabile fino a 2 mesi, seguito da un moderato aumento fino all’anno di vita. La creatinina viene perciò considerata fisiologica anche se inferiore al range, nei cani giovani. (Kraft W, Hartman K, Dereser R., 1996; Wolford ST, Schroer RA, Gohs FX, Gallo PP, Falk HB, Dente AR. 1988). Alcuni studi rilevano che i valori di P-creatinina nei cani adulti fino a 8–10 anni di età risultano stabili o moderatamente aumentati, osservando successivamente una flessione, anche se il peso corporeo (BW) rimane invariato (Broulet V, Fayolle P, Braun JP,Thouvenot JP, Rico AG., 1986). Nessuna differenza è stata osservata nei livelli di P-creatinina in cani di età compresa tra 0,5-5,0 e 6,0-13,5 anni o in cani con meno di 1 anno e più di 9 anni.
Uno studio prospettico osservazionale ha ipotizzato che, nel gatto, gli intervalli di riferimento delle variabili biochimiche plasmatiche siano dipendenti dalla razza (Reynolds BS, Concordet D, Germain C A, Daste T, Boudet K G, Lefebvre H P. 2010).
Peso/massa muscolare. Nei neonati di razze di grossa taglia, la P-creatinina risulta generalmente più alta (Kuhl S, Mischke R, Lund C, Günzel-Apel AR., 2000). Inoltre, livelli superiori alla media si riscontrano nei levrieri. Nei cani cachettici la P-creatinina risulta essere invece inferiore.
Stile di vita. La P-creatinina è moderatamente più elevata (5–15 mmol/L) nei cani che vivono all’esterno rispetto a quelli abituati a vivere in casa, anche se il peso medio e l'assunzione di cibo sono simili tra i due gruppi confrontati (Kuhn G, Hardegg W., 1988).
Stagione. Uno studio ha evidenziato nella razza Beagle i livelli di P-creatinina leggermente più elevati in estate e autunno, rispetto a inverno e primavera (Strasser A, Seiser M, Heizmann V, Niedermuller H., 2001).
Ritmi biologici. Nei cani campionati nello stesso momento del giorno, è stata osservata una differenza del 18% tra il picco (acrofase) che si verifica da metà primavera fino a metà estate e il livello più basso, riscontrato in inverno (Sothern RB, Farber MS, Gruber SA., 1993; 10:364-382). L’influenza del ritmo circadiano è stato anche osservato nei
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confronti dell’U-creatinina, probabilmente soprattutto a causa dei pasti (Uechi M, Terui H, et al., 1994).
Sito anatomico del prelievo di sangue. La P-creatinina in alcuni studi è risultata moderatamente più alta nei campioni ottenuti dalla vena giugulare rispetto a quelli della vena cefalica, di un valore medio di 5 mmol/L, che è molto inferiore alla variabilità interindividuale dei campioni ottenuti dallo stesso sito (Jensen AL,Wenk A, Koch J., 1974).
Sforzo fisico.E’ stato osservato che la P-creatinina non subiva cambiamenti in cani da slitta dopo un lungo tempo di corsa; altri studi effettuati su Beagle non allenati mostravano la diminuzione di circa 10% dopo un’ora di corsa (Chanoit G, Concordet D, et all.,2002).La P-creatinina subisce una diminuzione dopo uno sprint di 30 minuti (14-28 km) in cani da slitta ben allenati (Querengaesser A, Iben C, Leibetseder J., 1994). Al contrario, la P-creatinina aumentava di circa 50% dopo esercizi intensivi anaerobici nei cani da slitta (Hammel EP, Kronfeld DS, Ganjam VK, Dunlap HL. , 1977). In cani di razza Greyhound il valore della P-creatinina risulta essere leggermente aumentato (di ~ 20 micromol/L) dopo le gare e il rialzo permane tale per almeno 1 ora (Rose RJ, Bloomberg MS. ,1989). La P-creatinina risulta inoltre moderatamente aumentata nei cani dopo la ricerca di droga (Strasser A, Hochleithner M et al., 1993).
Effetti dei farmaci
La maggior parte dei farmaci influenzano i livelli di P-creatinina riducendo la velocità di filtrazione glomerulare attraverso 3 meccanismi.
Danni renali. E’ stato riportato che la gentamicina causa nessuno o un modesto aumento di P-creatinina, (Rivers BJ,Walter PA, Letourneau JG, et al. , 1996), benché possa essere associata alla comparsa di danni renali gravi (Brown SA, Barsanti JA, Crowell WA., 1985). Effetti simili sono stati osservati con derivati del platino (Daugaard G, Abilgaard U, Larsen S, et al. ,1987), dell’ossitetraciclina (Moalli MR, Dysko RC, Rush HG, et al., 1996), di alte dosi di netilmicina e tobramicina (> 50 mg/kg per 2 settimane), amfotericina B, calciferolo ed i suoi derivati, ivermectina in un caso, trimetoprim-sulfadiazina (Lee KW, Jang IH. , 1996).
Emodinamica renale alterata. E’ stato osservato un moderato aumento della P-creatinina dopo il trattamento con morfina, ossimorfone, ketoprofene, carprofen, ketorolac e butorfanolo (Lobetti RG, Joubert KE. , 2000). Anche captopril e benazepril hanno provocato un aumento moderato della P-creatinina, mentre (Kitagawa H,Wakamiya H, Kitoh K, et al.
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,1997) l’enalapril ha presentato effetti discordanti: in alcuni studi ha avuto gli stessi effetti di un placebo (Grauer GF, Greco DS, Getzy DM, et al., 2000), in altri ha causato invece un moderato aumento ( Bagby SP, Fuchs E. , 1989). Paradossalmente, il trattamento con ormone della crescita ha causato una moderata diminuzione della P-creatinina. (Prahalada S, Stabinski LG, Chen HY, et al., 1998).
Disidratazione extracellulare. L'iperazotemia pre-renale causata dalla furosemide in cani con insufficienza cardiaca, (Roudebush P, Allen TA,Kuehn NF, Magerkurth JH, Bowers TL. , 1994) digossina e somministrazione intraperitoneale di povidone-iodine iodato (Ndikuwera J, Winstanley EW, Binta-Mushi G, Mushi EZ. ,1988) sono stati segnalati come causa di un aumento dei valori di P-creatinina. La somministrazione intramuscolare di glucocorticoidi (Braun JP, Guelfi JF, Thouvenot JP, Rico AG., 1981) ha causato una diminuzione moderata della P-creatinina nei cani sani, ma non nei cani con ipoadrenocorticismo. Anche l’etionina (Lynn RC, Feldman EC.,1991) ha causato una diminuzione moderata di P-creatinina. I meccanismi con quali i glucocorticoidi e l’etionina influenzano la P-creatinina sono sconosciuti.
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2.3 La ricerca di livelli di creatinina nel plasma e nelle urine nel cane
2.3.1 La creatinina nel sangue
La creatinina si forma come risultato del costante metabolismo di creatina nei muscoli, viene completamente filtrata dai glomeruli dei reni ed escreta nelle urine, la secrezione tubulare risulta marginale. Il valore della concentrazione di creatinina nel plasma è influenzata da molti fattori, tuttavia si ritiene che sia il miglior indicatore indiretto della funzionalità renale.
Durante l'acquisizione e l'analisi è necessario prendere in considerazione l'influenza dei vari fattori che possono avere un impatto significativo sui risultati dello studio. Per questa ragione è fondamentale che il campione di sangue per questa analisi venga prelevato con il paziente a stomaco vuoto: di solito è sufficiente digiuno di 12 ore durante la notte.
La concentrazione plasmatica di tale molecola dipende, dunque, innanzitutto dalla massa muscolare del soggetto a digiuno. L’eliminazione della creatinina plasmatica dipende dalla filtrazione glomerulare, poiché non vi è né riassorbimento né secrezione tubulare. La velocità di eliminazione di questa molecola dal plasma è perciò una funzione diretta della velocità di filtrazione glomerulare. (Braun J.P., Cotard J.P. et al., 1996). Ciò ci permette di confermare il declino della funzione renale dall’osservazione di un aumento della concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno.
I valori di creatinina nel sangue e nelle urine sono utilizzati per calcolare la velocità di filtrazione glomerulare e la valutazione della funzione renale.
L’aumento del livello di creatinina plasmatica può essere causato o indicare la presenza di:
• Insufficienza renale acuta e cronica (Vaden SL., Bonagura J., 2000).
• Malattie renali primarie. La creatinina aumenta in caso di amiloidosi, glomerulosclerosi, in presenza di policisti, in corso di crisi postoperatoria uremica e nelle intossicazioni da arsenito di sodio, citrinina, fluoruro di sodio e vitamina D e suoi analoghi.
• Malattie renali secondarie. La creatinina aumenta nel corso di babesiosi, leishmaniosi, leptospirosi, borreliosi, tripanosomiasi, filariosi cardiopolmonare,
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encephalitozoonosi, istiocitosi maligna, piometra, ostruzione intestinale, dilatazione/torsione gastrica, diabete mellito e ipercalcemia causata da iperparatiroidismo o linfoma.
• Malattie renali congenite;
• Ostruzione urinaria o rottura vescicale; • Acromegalia e gigantismo;
• Assunzione di farmaci nefrotossici; • Lesioni meccaniche, muscolari;
• Sindrome da schiacciamento prolungato; • Malattie acute da radiazione;
• I valori possono essere falsamente aumentati nel caso di aumento della concentrazione di alcuni metaboliti endogeni nel sangue, come glucosio, fruttosio, corpi chetonici, urea, alcuni farmaci;
• Predominanza di carne nella dieta; • Ipertiroidismo;
• Disidratazione.
La diminuzione del livello di creatinina sierica può essere dovuta a:
Una diminuzione moderata della creatinina plasmatica è stata riportata nell’80% dei cani con shunt portale o nei cani con uno shunt portosistemico sperimentale. Una diminuzione è stata osservata anche nei primi mesi di babesiosi.
• Fame e ridotta massa muscolare; • Corticosteroidi;
• Gravidanza; • Dieta vegetariana; • Idratazione; • Miodistrofia.
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2.3.2. Creatinina nelle urine
Gli animali con lesioni renali mostrano generalmente una riduzione dell’escrezione della creatinina nelle urine e un aumento del livello sierico di creatinina. L’escrezione urinaria giornaliera della creatinina dipende dal sesso, età e massa muscolare totale. Lo studio più importante per valutare la funzionalità renale è il test di clearance della creatinina (prova di Rehberg). Per questo test non è richiesta una preparazione specifica. Si esegue questo studio per diagnosticare la presenza di:
• disfunzione renale acuta e cronica; • diabete;
• malattie delle ghiandole endocrine (tiroide, ipofisi, ghiandola surrenale); • gravidanza.
• riduzione della massa muscolare.
L’unità di misura è mmol/giorno, oppure in alternativa mg/giorno.
L’aumento della creatinina nelle urine può essere causata da:
• attività fisica; acromegalia, gigantismo; • diabete mellito; ipotiroidismo;
• infezioni;
• consumo di carne.
La diminuzione della creatinina nelle urine può essere causata da:
• ipertiroidismo; • anemia;
• paralisi, la distrofia muscolare, le malattie con una diminuzione della massa muscolare;
• malattie infiammatorie e metaboliche che coinvolgono i muscoli; • fase di espansione della malattia renale;
• leucemia;
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CAPITOLO 3. La clearence renale e la sua misurazione.
La clearance plasmatica o renale di un indicatore specifico consente di valutare la velocità di filtrazione glomerulare e anche di effettuare una diagnosi precoce dell'insufficienza renale cronica. La clearence plasmatica rappresenta la capacità del rene di depurare il plasma da varie sostanze.
La clearance di una sostanza viene definita come il volume ipotetico di plasma che viene completamente epurato di tale sostanza (totalmente ultrafiltrata dai reni ed eliminata con le urine) nell'unita di tempo. La clearance renale di una sostanza è uguale alla sua velocità di eliminazione attraverso il rene, divisa per la sua concentrazione plasmatica.
La quantità di indicatore eliminato dal rene corrisponde alla quantità riscontrata nelle urine. Questa viene calcolata moltiplicando il volume urinario (V) per la concentrazione urinaria (U). (Gleadhill A., Mitchell A.R., 1996).
Clearance urinaria in ml/min = (UxV)/P
Il metodo di riferimento è fondato sulla determinazione di una concentrazione plasmatica costante ottenuta attraverso l'iniezione di una dose iniziale, seguita da una perfusione costante (Barthez P., 2000).
Il calcolo della clearance urinaria (tabella 1) presenta tuttavia il problema della raccolta delle urine (per cateterismo) e dello svuotamento totale della vescica. E' necessario riaciacquare la vescica per raccogliere la totalità delle urine e dell'indicatore. Esistono metodi sulle 24 ore e metodi semplificati sui 20 minuti.
Clearance urinaria Clearance plasmatica
Iniezione iniziale perfusione continua
prelievi di urine multipli (errori legati alla difficoltà dello svuotamento vescicale e rischio di infezioni iatrogene delle basse vie urinarie) prelievo di sangue
CL= (U x V)/P in ml/min U = concentrazione urinaria
Iniezione unica in bolo
assenza di perfuzione continua assenza di prelievi di urine prelievi di sangue multipli
curva di eliminazione dell'indicatore
CL= D/ASC in ml/min D = dose dell'indicatore iniettato
ASC = area sotto la curva, calcolata attraverso un modello a due
28 dell'indicatore in UI/ml
V = volume urinario in ml/min
P = concentrazione plasmatica dell'indicatore in UI/ml
compartimenti
CL= clearance plasmatica
Tabella 1. Comparazione della determinazione della clearance plasmatica e della clearance urinaria.
La concentrazione dell'indicatore viene misurata nel plasma o nel sangue nei minuti e nelle ore successive all'inoculazione. Le differenti concentrazioni misurate nel sangue, siero o plasma determinano la curva di eliminazione dell'indicatore. La clearance plasmatica è uguale alla dose somministrata (D), divisa per l'area sotto la curva (ASC). L'area sotto la curva viene generalmente calcolata attraverso un modello farmacologico a due compartimenti (Isabelle Goy-Thollot, 2000).
Clearance plasmatica = D/ASC
Il calcolo della clearance plasmatica evita la raccolta delle urine. Tuttavia i suoi inconvenienti sono i tempi di manipolazione, il numero dei campioni, la scelta dei campioni significativi nel caso in cui i prelievi non possano essere numerosi. La quantità di sangue da prelevare, con certi indicatori, costituisce un'ulteriore difficoltà.
La clearance plasmatica o renale di un indicatore specifico costituisce un eccellente approccio alla VFG. (Isabelle Goy-Thollot, 2000).
La clearance plasmatica renale di una sostanza è, quindi, il volume di plasma che viene depurato (e perciò liberato) della quantità di sostanza che si ritrova nelle urine in un minuto.
Tale parametro è fittizio per alcune sostanze, in quanto non tiene conto dei meccanismi di filtrazione ed escrezione: ad esempio la sostanza filtrata potrebbe esser stata tutta riassorbita e poi secreta, comparendo nelle urine.
La VFG (Velocita di Filtrazione Glomerulare) è un metodo per determinare la velocità con cui si forma il filtrato glomerulare per passaggio dal plasma attraverso i glomeruli renali e permette una valutazione quantitativa della funzionalità renale sia nell’animale sano che in quello malato. La VFG è ritenuta uno dei più precoci e sensibili indicatori di disfunzione renale (Heiene R, Moe L., 1998) e, poiché direttamente correlata alla massa renale funzionante (Braun JP, Lefebvre HP, 2005), viene considerata il “gold standard
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test” per la valutazione quantitativa della funzionalità renale. La sintomatologia dell’insufficienza renale è estremamente tardiva e compare soltanto quando l’animale ha perso più del 70% dei nefroni. Infatti, grazie alla capacità renale compensatoria i parametri comunemente analizzati come creatinina e urea plasmatica e peso specifico urinario, non appaiono alterati finché una buona parte della funzionalità renale non è ormai perduta (circa il 67%) (Watson ADJ, Lefebvre HP, Concordet D, Laroute V, et al, 2002) e rappresentano indicatori scarsamente sensibili della VFG. D’altra parte essere in grado di stabilire una diagnosi precoce di disfunzione renale è importante sia per il paziente che per il proprietario, in quanto può aiutare a formulare una prognosi a lunga scadenza e a fornire tempestivamente una terapia medica di sostegno per la funzionalità renale. È infatti la diagnosi precoce degli stadi subclinici o borderline di insufficienza renale a costituire la sfida maggiore nella clinica veterinaria delle nefropatie. Da ciò scaturisce l’utilità della determinazione della VFG nella pratica clinica che non si limita alla diagnosi precoce, ma si estende al monitoraggio della progressione del danno renale, alla determinazione della funzione renale controlaterale prima di una nefrotomia o nefrectomia, alla valutazione della risposta ad una terapia in corso di patologia renale, alla modificazione della dose o della frequenza di somministrazione di farmaci eliminati per via renale (Kerl ME, Cook CR, 2005), alla preventiva valutazione della funzionalità renale in caso di necessità di terapia nefrolesiva. Nel cane la GFR può essere valutata mediante:
a) Metodi che sfruttano la clearance urinaria (inulina, creatinina endogena, creatinina esogena).
b) Metodi che sfruttano la clearance plasmatica (inulina, creatinina esogena, ioexolo, 99m Tc-DTPA).
c) Metodo scintigrafico renale (99m Tc-DTPA).
Le metodiche di valutazione della VFG che utilizzano lo studio della clearance urinaria (a) risultano poco praticabili nella routine diagnostica veterinaria in quanto necessitano di un’accurata raccolta delle urine prodotte. Ciò comporta l’utilizzo di gabbie metaboliche e una durata dell’esame che può arrivare alle 24 ore, con una conseguente ridotta compliance dell’animale e scarsa praticità per il proprietario. Nelle metodiche che prevedono l’utilizzo di cateteri urinari non è da sottovalutare, inoltre, il rischio di sviluppo di infezioni delle vie urinarie (Watson ADJ, Lefebvre HP, Concordet D, Laroute V, et al, 2002). Gli studi di clearance plasmatici (b) possono presentare lo svantaggio di richiedere un numero elevato di prelievi ematici e la possibilità di errore nel calcolo dell’area sotto la curva
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concentrazione/tempo (AUC) (Kerl ME, Cook CR, 2005.). Presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa è in uso un metodo semplificato con lo ioexolo per la valutazione della GFR con metodica HPLC che si dimostra attendibili, facilmente attuabile e non invasivo per gli animali (Meucci V., Gaspetini A., Soldani G., Guidi G., Giorgi M., 2004)(Lippi I., Meucci V., Guidi G., Soldani G. Valutazione della velocita' di filtrazione glomerulare mediante clearance plasmatica dello iohexolo nel cane: confronto tra metodi semplificati, 2008; Meucci V., Guidi G., Melanie P., Breghi G., Lippi I., 2013).
La determinazione della VFG mediante l’utilizzo di composti radioattivi (c), come il 99m Tc-DTPA, richiede strumentazioni complesse, particolari autorizzazioni e 24 ore di isolamento per il paziente. Il metodo scintigrafico offre il grande vantaggio di poter valutare, oltre alla VFG, la funzionalità renale, non solo complessiva ma anche individuale, e di non necessitare di campioni ematici o urinari. Il test utilizza, però, un composto radioattivo che richiede una particolare strumentazione ed un isolamento del paziente nelle 24 ore che seguono l’iniezione dell’analita.
Per ottenere una stima della velocità di filtrazione glomerulare, si ricorre comunemente alla misurazione dei livelli di alcune sostanze endogene e tra queste la più utilizzata è la creatinina. La creatinina endogena è l’indicatore più vecchio utilizzato per la misurazione della VFG. Questa può essere utilizzata anche come indicatore endogeno. La supposta secrezione tubulare e le incertezze sulle determinazioni, inerenti ad alcune metodiche, possono essere all'origine di errori di misurazione della clearance (Heiene R., Moe L. 1998; vol.12: pp. 401-414).
La clearance della creatinina viene valutata raccogliendo le urine della 24 ore e misurando la concentrazione di creatinina in questo campione ed in un campione di sangue prelevato alla fine della raccolta.
La relazione tra VFG (velocità di filtrazione glomerulare) e concentrazione di creatinina è graficamente rappresentata da una curva (Figura 5).
31 Figura 5. Relazione tra p-creatinina e GFR.
Tuttavia occorre ricordare che l’aumento della concentrazione di creatinina nel plasma non è necessariamente correlata ad alterazione della GFR, così come una diminuzione può dipendere da una perdita di massa muscolare. In corso di insufficienza renale cronica in fase tardiva, la disidratazione può determinare la riduzione della distribuzione di creatinina, che è infatti legata alla riserva di acqua nel corpo.
La dipendenza della concentrazione di creatinina nel plasma e velocità di filtrazione glomerulare (VFG) è stata graficamente espressa da una curva. Questa curva indica che in una fase iniziale di disfunzione renale, ad un cambiamento lieve della concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno può corrispondere una variazione importante del VFG. Nei cani con insufficienza renale grave, al contrario, ci sono fluttuazioni significative nella concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno in un contesto di variazioni piuttosto limitate in VFG. I risultati di una singola determinazione di concentrazione di creatinina nel plasma dovrebbero essere interpretati con cautela, dato il fatto che cambiamenti importanti della funzione renale possono associarsi a concentrazione di creatinina entro i limiti normali.
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CAPITOLO
4.Le malattie dei cani, diagnosticate dal livello di
creatinina
4.1. Insufficienza renale cronica
L’insufficienza renale cronica (IRC) è una delle malattie renali diagnosticate più frequentemente nei cani: si tratta di un problema clinico che colpisce il 2-5% dei cani (Bronson RT, 1982). La malattia deriva dalla perdita irreversibile delle capacità metaboliche, endocrine ed escretorie del rene. La sintomatologia può variare in relazione alla gravità o stadio della malattia e comprende: dimagramento e perdita di peso, diminuzione o mancanza di appetito (anoressia), pelo opaco, poliuria – polidipsia (PU/PD), depressione, letargia, vomito, alitosi, disfagia associata a lesioni del cavo orale; l’esame obiettivo può inoltre evidenziare anemia, alterazione delle dimensioni renali, variazioni dell’aspetto dei vasi sanguigni del fondo dell’occhio, tachicardia. Ulteriori indagini strumentali possono evidenziare ipertensione, alterazione della conformazione strutturale dei reni. Molto spesso i primi segni della malattia renale, come la poliuria e polidipsia, vengono sottovalutati per un periodo lungo. Si ritiene che i segni clinici di insufficienza renale comprendano la diminuzione del peso specifico dell’urina e azotemia, ossia l'eccessiva concentrazione di creatinina e/o urea. Questi parametri appaiono in una fase relativamente tardiva della malattia renale, cioè la sindrome uremica si manifesta quando la massa renale residua è generalmente inferiore al 25% della norma e le modificazioni compensatorie non riescono più a soddisfare le esigenze metaboliche ed escretorie dell’organismo per mantenere l’omeostasi. La diagnosi è spesso tardiva. I segni di insufficienza renale che si riscontrano in molti cani con cardiopatie croniche sono pertanto riferibili al danno glomerulare provocato dall’attivazione del SRRA e non ad un effetto indesiderato della terapia diuretica e vasodilatatrice. Anche nei casi di insufficienza renale acuta prerenale che si verifica raramente nei cardiopatici, l’aumento dell’urea e della creatinina plasmatica è dovuto alla riduzione eccessiva della filtrazione glomerulare. Tale fenomeno, facilmente reversibile, può verificarsi per disidratazione o ridotta funzione ventricolare sistolica del paziente associata all’inappropriata gestione della terapia farmacologica e non alla presunta ma assolutamente non dimostrata tossicità renale di questi farmaci (Bussadori C., Pradelli D., Domenech O., 2002).
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La diagnosi dell’insufficienza renale cronica è relativamente agevole. Tuttavia, è più difficile identificare la nefropatia in fase iniziale prima dello sviluppo dei segni clinici o delle anomalie di laboratorio (Figura 6).
Figura 6. Conseguenze della nefropatia e della sua progressione verso la sindrome uremica.
Il problema della diagnosi precoce dell'insufficienza renale cronica è ancora rilevante, anche se negli ultimi 20 anni ci sono stati progressi significativi nella dieta e nel trattamento medico di questa malattia. La possibilità di scoprire il danno renale all'inizio della malattia può suggerire l’uso di una dieta speciale o di farmaci, che faciliteranno l'utilizzo delle risorse per proteggere questi organi da ulteriori danni. La diagnosi precoce può permettere di rallentare lo sviluppo di malattie renali, accorciare la convalescenza e migliorare la qualità della vita degli animali malati.
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I fattori di rischio associati allo sviluppo di insufficienza renale cronica nei cani non sono stati ancora ben compresi. Sicuramente si è notato che:
• l’insufficienza renale cronica spesso colpisce i cani adulti, nel 45% dei casi con l'età superiore ai 10 anni. Questo non significa che ogni cane adulto possa ammalarsi di questa malattia, ma negli animali anziani è necessario controllare la concentrazione di creatinina nel plasma ed il peso specifico delle urine, come indicatori più importanti della loro salute.
• l’insufficienza renale cronica può essere causata da una varietà di fattori eziologici, che l'animale ha avuto in passato, per esempio piroplasmosi, ipertensione, ecc. La presenza di questi fattori in passato dovrebbe servire come un segno per l’esame della funzionalità renale (Герве П. Лефебвр, Жан-Пьер Брон, А. Давид Дж. Уотсон, 2005).
Informazioni diagnostiche importanti possono essere ottenute anche da un solo valore di concentrazione di creatinina nel plasma sanguigno dell'animale. La società internazionale specializzata nello studio della malattia renale (International Renal Interest Society) ha suggerito sulla base di questi dati, la classificazione delle fasi della CRF nei cani e gatti, che si basa sul valore della concentrazione di creatinina nel sangue (Tabella 2).
Stadi I II III IV
Creatinina plasmatica
μmol/l < 125 125 a 180 181 a 440 > 440
mg/dL < 1,4 1,4 a 2,0 2,1 a 5,0 > 5,0
Tabella 2. Classificazione della international Renal Interest Society (IRIS) degli stadi della nefropatia e dell'insufficienza renale cronica nel cane.
Come si osserva nella tabella, i pazienti con la creatinina < 1,4 mg/dL (per i cani) o < 1,6 mg/dL (per i gatti), possono essere raggruppati come stadio 0 o stadio 1 a seconda della assenza o presenza dei segni tipici dell’insufficienza renale cronica. Nel caso la sintomatologia sia assente e la creatinina sia <1,4 mg/dL (cani) o < 1,6 mg/dL (gatti) il paziente si considera in stadio 0, ma si rivaluta, comunque nei tre mesi successivi con una cadenza mensile cercando di evitare i fattori di rischio all’insorgenza della malattia.
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Se invece il paziente ha una creatinina < 1,4 mg/dL (cani) o < 1,6 mg/dL (gatti) ma mostra sintomatologia oppure una GFR inferiore alla norma, allora è classificato come stadio 1, e in questo caso va ulteriormente classificato misurando la proteinuria e la pressione arteriosa sistemica, quindi si effettueranno radiografie di controllo, esami delle urine e si misura il rapporto Upr/Ucr.
I pazienti in stadio 1, infatti, possono presentare anomalie renali come un’insufficiente capacità a concentrare l’urina, una proteinuria costante, biopsia renale e persistenti reperti istologici alterati. Ai cani con creatinina compresa tra 1,4 mg/dL e 2 mg/dL, o ai gatti con creatinina compresa tra 1,6 mg/dL e 2,8 mg/dL si effettua un prelievo di urine per valutane il peso specifico: se quest’ultimo è < 1030 il paziente si sottopone a radiografia di controllo e alla valutazione del rapporto Upr/Ucr; se i risultati sono normali si rivaluta il soggetto entro due mesi; se sono invece alterati si classifica il paziente come appartenente allo stadio 2 classificandolo ulteriormente in base alla proteinuria e alla pressione arteriosa sistemica. Qualora, invece, il peso specifico delle urine risulti essere ≥ 1030, il soggetto viene sottoposto a una visita clinica e se si riscontrano anomalie sistemiche si rivaluta entro sei mesi.
I pazienti con creatinina >2 mg/dL vengono visitati e possono risultare come azotemici per cause pre o post renali - e in questo caso è essenziale correggere le anomalie che determinano queste problematiche - oppure possono essere iper azotemici per cause renali e quindi appartenere allo stadio 3 o 4 a seconda dei valori della creatinina. Anche questi pazienti sono sottostadiati in base alla proteinuria e alla pressione arteriosa sistemica.
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4.2. Uroaddome
La creatinina può essere utile nella diagnosi di uroaddome nel cane. Uroaddome frequentemente viene associata con la rottura della vescica o dell'uretra a causa di un trauma addominale o pelvica. Molti di questi animali hanno fratture pelviche concomitanti o ferite penetranti addominali. La rottura delle vie urinarie dovrebbe essere sospettata quando si diagnostica iperazotemia, iperkaliemia ed effusione addominale. Confrontando la concentrazione della creatinina del fluido addominale con la creatinina plasmatica o sierica, la diagnosi di uroaddome può essere posta se il rapporto della creatinina ≥ 2:1. Nella maggior parte dei pazienti sono necessari studi contrastografici per identificare l’origine esatta della perdita di urina e stabilire le opzioni terapeutiche (Stafford JR, Bartges JW., 2013).
Uroaddome può essere anche causata da processi non traumatici, come ostruzione delle vie urinarie. Indipendentemente dalla causa, uroaddome causa segni clinici gravi come disidratazione, con o senza la presenza di minzione, iperkaliemia che può causare bradicardia, grave azotemia, acidosi metabolica con o senza compenso respiratorio e peritonite chimica. Inoltre, possono essere presenti altri disturbi elettrolitici, come iponatriemia e ipocloremia.
La creatinina agisce anche come agente osmotico, attirando fluido da spazi extracellulari ed intracellulari durante la disidratazione dell'animale (un fattore prerenale). Poiché il valore della creatinina nel sangue aumenta, aumenta anche la concentrazione di BUN. Questo può portare a segni clinici di uremia, come vomito, che peggiorerà la disidratazione. Il potassio nelle urine sarà rapidamente diffuso nel sangue, creando pericolosamente alte concentrazioni in grado di avviare aritmie cardiache e danni ai miociti. Gli ioni di idrogeno, normalmente escreti nell'urina, sono ritenuti, creando uno stato di acidosi metabolica. La disidratazione diminuisce la velocità di filtrazione glomerulare, riducendo così l'escrezione di creatinina e urea. La ritenzione delle urine all'interno dell'addome crea una fonte continua di creatinina, urea e prodotti escretori corrosivi. Questi prodotti corrosivi presto creano una peritonite chimica.
Uroaddome viene diagnosticata considerando anamnesi del paziente, i risultati dell'esame fisico, emogramma, i risultati del esame biochimico, radiografie addominali, analisi del liquido addominale e/o studi di contrasto del sistema urinario. Una diagnosi definitiva di uroaddome è ottenuta determinando la concentrazione di creatinina nel liquido addominale e confrontandola con il valore della creatinina sierica. Un campione del cane con
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uroaddome avrà un valore di creatinina leggermente superiore a quella del siero. In genere un valore maggiore di due volte rispetto alla concentrazione sierica di creatina può essere indicativo di uroaddome (Gannon K, Moses L., 2002).
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4.3. Nefropatia ereditaria
In alcune razze di cani viene registrata nefropatia ereditaria, anche se la loro incidenza non è ancora chiara. In queste razze la malattia renale ereditaria può svilupparsi a qualsiasi età, nei cuccioli, giovani, adulti e cani anziani. Se si sospetta la presenza di sintomi delle patologie del rene in questi cani, è necessario raccogliere dati sul fatto che questa malattia sia stata riscontrata negli animali della stessa linea (genitori, altri parenti). Ci sono circa una quarantina di razze a rischi di danno renale eriditario (Tabella 3). Tuttavia, la prevalenza della suddetta malattia nei cani è bassa, un incontro maggiore si nota nei cani anziani con una ridotta funzionalità renale. Per differenti nefropatie soprattutto nel cane esistono ormai molti laboratori di biologia molecolare internazionali di riferimento per il test genetico. Purtroppo tali test riguardano per ora soprattutto le nefropatie a trasmissione ereditaria semplice di tipo mendeliano. Per quanto riguarda alcune forme ad eredità più complessa (a supposta eredità multifattoriale) non esistono per ora riscontri efficaci a breve termine (Polli M., 2010).
Razza Patologia di
trasmissione Modalità Segni clinici
Alaskan malamute
Displasia renale Sconosciuta IRC
Basenji Tubulopatia Sconosciuta Sindromi di Fanconi
Beagle Agenesia renale,
amiloidosi Sconosciuta asintomatica Pastore tedesco Adenocarcinoma
cistico
Autosomica dominante
Noduli cutanei
Collie Tubulopatia Sconosciuta Sindromi di Fanconi
Bovaro bernese Glomerulopatia Sconosciuta IRC
Boxer Displasia renale Sconosciuta IRC
Bull terier Policistosi, displasia renale
Autosomica dominante
IRC
Cairn terier Policistosi Autosomica
recessiva
IRC
Barborcino medio Displasia renale Sconosciuta IRC
Cavalier king Charles
Displasia renale Sconosciuta IRC
39 Cocker spaniel Displasia renale,
glomerulopatia Sconosciuta Autosomica recessiva IRC Dobermann Glomerulonefrite membrano proliferativa Sconosciuta IRC
Golden retriver Displasia renale Sconosciuta IRC
Lhasa apso Displasia renale Sconosciuta IRC
Rottweiler glomerulopatia Sconosciuta IRC
Samoiedo (maschio)
glomerulopatia Dominante sul
cromosoma X IRC
Scottish terrier Tubulopatia Sconosciuta Sindromi di Fanconi
Schnauzer Displasia renale Sconosciuta IRC
Shar pei Amiloidosi Autosomica
recessiva
IRC, sindrome nefrosica
Shitzu Displasia renale Sconosciuta IRC
Welsh corgi teleangectasia sconosciuta Asintomatica
West highland white terier
Policistosi Autosomica
recessiva IRC
Tabella 3. Elenco delle razze canine che hanno una nefropatia ereditaria. Se il cane ha questa patologia nella forma asintomatica o con lievi segni clinici, il peso specifico urinario e la creatinina saranno i migliori marcatori della funzione renale. Il peso specifico urinario, la valutazione quantitativa della proteinuria (rapporto proteinuria/creatinuria), l’uremia, la creatinuria, la fosfatemia, la calcemia, sono ulteriori parametri di valutazione della funzione renali. La valutazione della velocità di filtrazione glomerulare (VFG) permette di stimare in maniera affidabile la funzione renale (Gleadhill A., Mitchell A. R., 1996).
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PARTE SPERIMENTALE
CAPITOLO 5. Studio5.1. Scopo della tesi
Lo scopo di questo studio retrospettivo è quello di confrontare la creatinina ematica nei cani e valutarne la variabilità in relazione all’eta, al peso e alla razza, in soggetti appartenenti alla specie canina, ricevuti presso presso l’Ospedale DidatticoVeterinario “ Mario modenato” del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa.
5.2. Materiali e metodi
Il presente studio è stato condotto presso l’Ospedale DidatticoVeterinario “ Mario modenato” del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa tra il 2012 e il 2014. Tramite una ricerca effettuata con il programma informatico “Ociroe”, è stato ricercato il parametro della creatinina per valori fisiologici inferiori a 1,5 mg/dl. Sono stati esclusi tutti i soggetti di scpecie canina con valori di creatinina uguali e superiori a 1,5 mg/dl.
Sulla popolazione presa in esame sono stati inclusi 2705 cani sani con creatinina < 1,5 mg/dl.
Di questi soggetti, alcuni sono stati portati all’ospedale per visite di controllo, alcuni erano pre-operatori, altri per patologie non renali.
Ad ogni soggetto, opportunamente identificato, era stato effettuato un prelievo di sangue venoso, dalla vena cefalica dell’avambraccio o della safena, per rilevare i livelli plasmatici di creatinina.
Per il dosaggio della creatinina plasmatica è stato utilizzato plasma con eparina o siero con il metodo cinetico con picrato alcalino: in ambiente alcalino, la creatinina forma con l’acido picrico (incluso nel reagente del kit diagnostico) un complesso di color rosso-arancio (reazione di Jaffè), che ha un incremento cinetico proporzionale alla concentrazione di creatinina presente nel campione.
Per quanto riguarda il dosaggio di creatinina, gli intervalli di riferimento presi in considerazione sono quelli in uso presso il laboratorio di Biochimicia ed Ematologia Clinica Veterinaria (BECV) del Dipartimento di Scienze Veterinarie sono 0,8 – 1,5 mg/dl.
I cani sono stati divisi in razze e fascia di età: da 1 a 3 anni, da 4 a 7 anni e da 8 a 18 anni.
