Grapiprant, inibitore del recettore EP4 per le prostaglandine: studi su specie di interesse veterinario

UNIVERSITÀ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

TESI DI LAUREA

“GRAPIPRANT,

INIBITORE DEL RECETTORE EP4

PER LE PROSTAGLANDINE:

STUDI SU SPECIE DI INTERESSE VETERINARIO

”

Relatore:

Prof. GIORGI Mario

Prof.ssa BRESCHI Maria Cristina

Correlatore:

Candidata:

Dott.ssa DE VITO Virginia

NASSI Beatrice

I

Indice

Riassunto ... Pag. 1 Abstract ... Pag. 4 1.INTRODUZIONE …... Pag. 6 1.1.Il dolore …... Pag. 7 1.1.1.Come si genera il dolore …... Pag. 7 1.1.2.Trattamento farmacologico del dolore negli animali …... Pag. 10 1.2.L'infiammazione …... Pag. 12 1.2.1.Gli autacoidi …... Pag. 13 1.2.2.Eicosanoidi: biosintesi, struttura e nomenclatura …... Pag. 14 1.2.3.Le cicloossigenasi …... Pag. 16 1.2.3.1.Farmaci antiinfiammatori …... Pag. 18 1.2.4.Formazione di prostanoidi e loro recettori …... Pag. 22 1.2.4.1.Il recettore EP4 …... Pag. 24 1.3.Il grapiprant …... Pag. 25 1.3.1.Caratteristiche chimico-fisiche …... Pag. 26 1.3.2.Galliprant® …... Pag. 26 1.3.3.Studi …... Pag. 26 1.3.3.1.Studi nel cane …... Pag. 26 1.3.3.2.Studi nel gatto …... Pag. 28 2.SCOPO DEL LAVORO …... Pag. 29 3.MATERIALI E METODI …... Pag. 31 3.1.Fasi del lavoro …... Pag. 32 3.2.Metodica analitica …... Pag. 32 3.2.1.Prodotti chimici e reagenti …... Pag. 32 3.2.2.Strumentazione …... Pag. 32 3.2.3.Preparazione delle soluzioni …... Pag. 33 3.2.4.Soluzioni degli standards analitici …... Pag. 33 3.3.HPLC-FL …... Pag. 34 3.3.1.Metodo di estrazione dei campioni …... Pag. 34 3.4.Curva di calibrazione del grapiprant per ciascuna sperimentazione animale …... Pag. 35 3.5.Metodo per la determinazione delle concentrazioni di analita nei campioni …... Pag. 36 3.6.Studio farmacocinetico nel cane …... Pag. 37

II

3.6.1.Analisi dei campioni di plasma …... Pag. 38 3.6.2.Integrazione dei dati …... Pag. 38 3.6.3.Analisi statistica …... Pag. 39 3.7.Studio farmacocinetico nel gatto …... Pag. 39 3.7.1.Analisi dei campioni di plasma …... Pag. 40 3.7.2.Integrazione dei dati …... Pag. 40 3.7.3.Analisi statistica …... Pag. 40 3.8.Studio farmacocinetico e farmacodinamico nel coniglio …... Pag. 41 3.8.1.Studio farmacocinetico …... Pag. 41 3.8.1.1.Analisi dei campioni di plasma …... Pag. 42 3.8.1.2.Integrazione dei dati …... Pag. 42 3.8.2.Studio farmacodinamico …... Pag. 42 3.8.2.1.Analisi statistica …... Pag. 43 4.RISULTATI …... Pag. 44 4.1.Profilo farmacocinetico nel cane …... Pag. 45 4.2.Profilo farmacocinetico nel gatto …... Pag. 48 4.3.Profilo farmacocinetico nel coniglio …... Pag. 51 4.4.Profilo farmacodinamico nel coniglio …... Pag. 52 4.5.Integrazione del profilo cinetico e dinamico nel coniglio …... Pag. 55 5.DISCUSSIONE …... Pag. 57 5.1.Farmacocinetica nel cane …... Pag. 58 5.2.Farmacocinetica nel gatto …... Pag. 59 5.3.Farmacocinetica e farmacodinamica nel coniglio …... Pag. 61 6.CONCLUSIONI …... Pag. 64 6.1.Sperimentazione nel cane …... Pag. 65 6.2.Sperimentazione nel gatto …... Pag. 65 6.3.Sperimentazione nel coniglio …... Pag. 65 7.BIBLIOGRAFIA …... Pag. 66

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Riassunto

Parole chiave: grapiprant, HPLC-FL, farmacocinetica, farmacodinamica, cane, gatto, coniglio

Il grapiprant (Galliprant®) è un farmaco antagonista del recettore EP4 delle prostaglandine E2, commercializzato esclusivamente per l'utilizzo nel trattamento del dolore cronico in medicina veterinaria per la specie canina, immesso sul mercato statunitense nell’aprile del 2016.

Gli scopi di questo studio sono:

 Determinare il profilo farmacocinetico del grapiprant in cani, gatti e conigli sani dopo differenti vie di somministrazioni e formulazioni di grapiprant, attraverso lo strumento HPLC-FL.

 Determinare il profilo farmacodinamico del grapiprant in un modello d'infiammazione indotto con carragenina nel coniglio.

Studio farmacocinetico nei cani

1. Due cani adulti di sesso femminile di razza Labrador sono stati trattati con una somministrazione endovenosa (IV) al dosaggio di 0.5 mg/kg di grapiprant disciolto in etanolo.

2. Sei cani adulti di sesso femminile di razza Labrador sono stati suddivisi in due gruppi seguendo uno studio cross-over (quadrato latino 2x2). Gli animali hanno ricevuto una dose di 2 mg/kg per via orale (PO), un gruppo dopo essere stati cibati 1 h prima del trattamento e l'altro gruppo dopo 12 h di digiuno.

Il periodo di wash-out è stato di una settimana. I campioni di sangue raccolti a tempi predefiniti sono stati centrifugati per l'ottenimento del plasma e in seguito analizzati con lo strumento HPLC-FL.

Dopo somministrazione IV nei 2 cani la clearance (CL) e il volume di distribuzione (Vz) erano rispettivamente di 444 e 476 mL/h/kg, 3642 e 3883 mL/kg. Dopo somministrazione PO, nei cani cibati, rispetto a quelli a digiuno, si è osservata una concentrazione di farmaco inferiore rispettivamente di 614 vs 1598 ng/mL e un tempo più lungo per raggiungere la concentrazione massima (3.0 vs 1.0 h). La concentrazione di grapiprant, nei cani sia cibati che a digiuno, rimane comunque alta (oltre la concentrazione minima efficace di 164 ng/mL) fino a 6 h.

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Conclusioni: nel presente studio, la presenza o meno di cibo, ha influito sui parametri farmacocinetici senza modificarne in entrambe le situazioni il tempo in cui il farmaco eccede la concentrazione minima efficace (164 ng/mL).

Studio farmacocinetico nei gatti

Sei gatti maschi castrati European sono stati divisi in due gruppi per uno studio cross-over (quadrato latino 2x2). Una singola dose di farmaco a 2 mg/kg è stata somministrata attraverso una somministrazione IV e PO.

Il periodo di wash-out è stato di una settimana. A seguito delle due somministrazioni è stato osservato che il farmaco era presente nel plasma, in 5 animali su 6, fino alle 24 h dall'inizio del trattamento. Dopo somministrazione IV, la CL ed il Vz sono risultati essere rispettivamente in un range compreso tra 120-326 mL/h/kg e 611-1608 mL/kg. Inoltre la biodisponibilità (F%) dopo somministrazione PO è risultata essere in un range tra 31.5-45.2%.

Conclusioni: assumendo che la dose minima efficace riportata per i cani (164 ng/mL) possa valere anche per il gatto, il grapiprant somministrato per via PO a 2 mg/kg potrebbe essere efficace per 10 h. Altri studi sono necessari per stabilire la concentrazione minima efficace in questa specie animale.

Studio farmacocinetico e farmacodinamico nei conigli

 Sei conigli New Zealand di sesso femminile sono stati divisi in due gruppi per uno studio cross-over (quadrato latino 2x2). Un gruppo ha ricevuto una dose IV di grapiprant a 2 mg/kg disciolto in etanolo. Il secondo gruppo ha ricevuto una dose IV di etanolo dello stesso volume utilizzato per disciogliere il grapiprant.

 Sei conigli New Zealand di sesso femminile sono stati divisi in due gruppi per uno studio cross-over (quadrato latino 2x2). Un gruppo ha ricevuto una dose sottocutanea (SC) di meloxicam a 0.5 mg/kg. Il secondo gruppo ha ricevuto una dose SC di etanolo (15%) dello stesso volume del meloxicam.

Il periodo di wash-out è stato di due settimane. Tre ore prima della somministrazione dei farmaci è stata indotta l'infiammazione con una somministrazione di lambda carragenina al 3% sotto la superficie plantare della zampa posteriore sinistra. Contemporaneamente ai prelievi di sangue, stimoli termici di raggi infrarossi (40 °C) sono stati applicati alla superficie plantare per misurare il thermal withdrawal latency (TWL). L'effetto antinocicettivo è stato espresso come risposta massima possibile (% MPR). Le concentrazioni di grapiprant sono state rilevabili fino alle 10 h (range 17-7495 ng/mL). Il gruppo a cui è stato somministrato il grapiprant ha mostrato un aumento di TWL da 1 a 10 h dopo il trattamento rispetto al

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controllo, mentre il gruppo a cui è stato somministrato il meloxicam ha mostrato un aumento significativo di TWL da 4 a 10 h dopo il trattamento rispetto al controllo. La % MPR non è stata osservata statisticamente significativa tra grapiprant e meloxicam a 4, 6 e 8 h, mentre sono state osservate differenze significative a 1, 1.5, 2, 10 e 24 h.

Conclusioni: grazie alla sua rapida insorgenza e all'estesa durata dell'effetto, il grapiprant sembra essere una buona opzione per l'antinocicezione nei conigli.

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Abstract

Key words: grapiprant, HPLC-FL, pharmacokinetics, pharmacodynamics, dog, cat, rabbit

Grapiprant (Galliprant®) is an EP4 prostaglandin E2 receptor antagonist drug, exclusively marketed for the treatment of chronic pain in canine species. It entered into the US veterinary market in April 2016.

The aims of this study were:



To determine the pharmacokinetic profiles of grapiprant in healthy dogs, cats and rabbits after administration of different grapiprant formulations by HPLC-FL.



To determine the pharmacodynamic profile of grapiprant in a carrageenan inflammatory model in the rabbit.

Pharmacokinetic study in dogs



Two female Labrador adult dogs were treated with an intravenous (IV) administration at a dose of 0.5 mg/kg of grapiprant dissolved in ethanol.



Six female Labrador adult dogs were divided into two groups according to a cross-over study (2x2 Latin-square). The animals received a dose of 2 mg/kg orally (PO). Group I was fed while group II was fasted.

It was shown that the presence or absence of food, has an impact on the pharmacokinetic parameters. However, the variation time for which the drug exceed the minimum effective concentration (164 ng/mL) is negligible making the drug administration in fasted or fed condition irrelevant.

Pharmacokinetic study in cats

Six European castrated cats were divided into two groups for a cross-over study (2x2 Latin-square). A single dose of drug, 2 mg/kg, was administered through an IV and PO administration.

Assuming that the concentration of the minimum effective dose in dogs (164 ng/mL) also applies to cats, the 2 mg/kg PO administration of grapiprant may be effective for up to 10 h. Other studies are necessary to establish the minimum effective concentration in this animal species.

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Pharmacokinetic and pharmacodynamic study in rabbits

 Six female New Zealand rabbits were divided into two groups for a cross-over study (2x2 Latin-square). One group received an IV dose of grapiprant to 2 mg/kg dissolved in ethanol. The second group received an IV dose of the same volume of ethanol used to dissolve grapiprant.

 Six female New Zealand rabbits were divided into two groups for a cross-over study (2x2 Latin-square). One group received a subcutaneous (SC) administration of meloxicam at 0.5 mg/kg. The second group received a SC administration of ethanol (15%) of the same volume of meloxicam.

Three hours before of the drugs administration, a lambda carrageenan 3% inflammation was induced with an administration under the plantar surface of the left hind paw. Simultaneously with the blood samples collection, thermal infrared stimuli (40 °C) were applied to the plantar surface to measure the thermal withdrawal latency (TWL).

Due to its rapid onset and the extended duration of the effect, grapiprant seems to be a good option for antinociception in rabbits.

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Oggigiorno gli animali domestici sono considerati membri della famiglia e come tali, i proprietari, richiedono un livello di cure pari a quello aspettato per gli esseri umani. Questo cambiamento di atteggiamento nei confronti della salute degli animali ha portato alla necessità di sviluppare nuove terapie, efficaci e innovative, in ambito veterinario (Giorgi, 2012; Giorgi et al., 2012; Giorgi & Yun, 2012). Infatti, molti animali con patologie che solo qualche tempo addietro avrebbero portato alla loro soppressione, ora vengono curati con successo (Marchetti et al., 2012). Gli animali domestici vivono più a lungo ma sono anche più soggetti allo sviluppo di malattie associabili all'invecchiamento, e all'uomo stesso, quali cancro, osteoartrite e disordini metabolici (Giorgi, 2012).

La farmacologia veterinaria possiede un numero di farmaci autorizzati ridotto rispetto alla farmacologia umana, per questo motivo alcuni di questi ultimi, vengono studiati per una loro nuova applicazione nella medicina veterinaria (farmaci off-label), sia a livello delle industrie farmaceutiche che in ambito accademico, per sopperire a questo deficit di principi attivi (Lavy

et al., 2011; Giorgi & Owen, 2012; Giorgi et al., 2012).

1.1.Il dolore

La IASP (International Association for the Study of Pain) (Anonymous, 1986) definisce il dolore come “un’esperienza sensoriale ed emozionale spiacevole associata a danno tissutale, in atto o potenziale, o descritta in termini di danno. E’ un esperienza individuale e soggettiva, a cui convergono componenti puramente sensoriali (nocicezione) relative al trasferimento dello stimolo doloroso dalla periferia alle strutture centrali, e componenti esperenziali e affettive, che modulano in maniera importante quanto percepito". Da questa definizione si deduce quanto sia difficile la valutazione del dolore, in quanto una componente della percezione dolorifica riguarda la sfera emotiva ed emozionale del singolo soggetto. Questa soggettività viene espressa attraverso alterazioni dell'umore basale che, a sua volta, dipende dalla personalità del singolo. In combinazione con il processo neurofisiologico della percezione del dolore, esso scatena, attraverso altri disagi di tipo psichico e organico, uno stress che coinvolge tutto l'organismo (Henke & Erhardt, 2006).

1.1.1.Come si genera il dolore

I recettori del dolore, chiamati nocicettori, sono terminazioni nervose periferiche libere dei neuroni sensitivi primari e i loro corpi si trovano nei gangli delle radici dorsali. Per il 90% si trovano a livello cutaneo ma sono localizzati anche in altri tessuti quali peritoneo, pleura,

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periostio, capsule articolari, muscoli, tendini, vasi sanguigni e alcuni visceri. Come già detto sono terminazioni nervose libere e reagiscono a stimoli qualitativamente variabili:

 meccanici (pressione, trazione)

 termici (caldo, freddo)

 chimici (sostanze tossiche, sostanze prodotte dall'organismo come serotonina (5TH), ACTH, istamina, ioni H+ e K+).

Lo stimolo dolorifico può provenire non solo dall'esterno ma anche da sostanze prodotte dall’organismo stesso (ad es. mediatori dell’infiammazione) (Henke & Erhardt, 2006). Queste sostanze endogene (prostaglandine, bradichinine, 5TH, sostanza P, K+_{, istamina) rilasciate}

dalle cellule danneggiate, contribuiscono al cambiamento dello stato del nocicettore, con lo sviluppo di ipersensibilità, ovvero di una riduzione della soglia di stimolazione che si traduce clinicamente in iperalgesia, e con l’attivazione di nocicettori silenti la cui azione si traduce in aumento degli stimoli che afferiscono dalla periferia al centro ed in un allargamento della zona dolente.

Le porzioni del sistema nervoso responsabili della sensazione e percezione del dolore possono essere divise in tre aree:

 Le vie afferenti: vie che terminano al livello del corno dorsale del midollo spinale dove nasce il primo neurone afferente mentre il secondo neurone nasce dalla parte spinale del sistema afferente.

 Le porzioni del SNC: (coinvolte nell’interpretazione del dolore) sono il sistema limbico, la formazione neuronale, il talamo, l’ipotalamo e la corteccia telencefalica.

 Le vie efferenti: vie costituite da fibre che collegano la formazione reticolare, il mesencefalo e la sostanza gelatinosa. Sono responsabili della modulazione delle sensazione di dolore (Kumar et al., 2013).

Le fibre afferenti entrano momentaneamente nel midollo spinale attraverso le radici del corno dorsale e terminano nella sostanza gelatinosa del corno dorsale dove avviene il passaggio dello stimolo chimico al secondo neurone. Il secondo neurone incrocia e procede nella porzione controlaterale lungo il tratto spinotalamico (fascicolo anteriore) fino all'encefalo. Prima di incrociare, esso entra in connessione con fibre efferenti motorie e simpatiche, responsabili di riflessi motori e simpatici. Il tratto termina nei nuclei del talamo, ma allaccia connessioni anche con la formazione reticolare del tronco encefalico. Da queste ultime dipendono le influenze del dolore sui centri respiratorio e circolatorio. Dal talamo originano fibre che raggiungono la corteccia cerebrale (corteccia somatosensitiva), dove avviene il riconoscimento della sede d'origine del dolore e dipartono connessioni con il sistema limbico

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nel quale si ha l'elaborazione della componente affettivo-emotiva del dolore (Fig. 1).

Fig. 1: Conduzione dolorifica

Possiamo identificare quattro processi fondamentali della nocicezione:

 Trasduzione: si tratta della trasformazione di energia fisica (stimolo nocivo) in attività elettrica a livello del nocicettore periferico. Questi nocicettori sono meccano-, termo- e chemo-sensibili.

 Trasmissione: rappresenta la trasmissione dell'impulso nervoso dal sistema nervoso periferico lungo le fibre afferenti Aδ (mielinizzate a conduzione veloce) e le fibre C (non mielinizzate a conduzione lenta).

 Modulazione: avviene attraverso un sistema di analgesia endogena discendente. La trasmissione viene modificata. Si tratta di una modulazione serotoninergica o noradrenergica che comporta un'inibizione nell'ambito del corno dorsale del midollo spinale.

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trasmissione, modulazione e integrazione delle funzioni corticotalamiche, reticolari e limbiche, che stanno alla base della percezione cosciente, soggettiva ed emozionale dell'esperienza dolorosa (Henke & Erhardt, 2006).

1.1.2.Trattamento farmacologico del dolore negli animali

Per un corretto approccio al trattamento del dolore, è indispensabile capire i meccanismi che sono alla base della nocicezione e quelli che la modulano. Infatti, sulla base di questi meccanismi, risulta possibile individuare i principali siti di azione delle maggiori classi di farmaci utilizzati nella terapia antalgica nell’animale (Fig. 2).

A livello della trasduzione: farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), corticosteroidi, oppioidi e anestetici locali possono agire inibendo la sensibilizzazione periferica dei nocicettori.

A livello della trasmissione: gli anestetici locali si rendono responsabili dell’inibizione della conduzione dell’impulso.

A livello della modulazione delle vie spinali: FANS, anestetici locali, oppioidi, α2–agonisti, antagonisti del glutammato, antidepressivi e anticonvulsivanti possono inibire la sensibilizzazione centrale.

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Fig. 2: Schema del processo di nocicezione e classi di farmaci su cui interagiscono

Le principali categorie di farmaci ad azione analgesica sono rappresentate da:

•

Oppioidi

•

FANS

•

Corticosteroidi

•

Anestetici locali

•

α2-agonisti

•

Antidepressivi

•

Anticonvulsivanti

•

Antagonisti del N-metil-D-aspartato

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1.2.L'infiammazione

L’infiammazione, detta anche flogosi, fa parte di una complessa risposta biologica da parte dei tessuti vascolarizzati, che viene innescata da vari stimoli nocivi (biologici, chimici, fisici), al fine di proteggere le cellule o i tessuti. Questo processo può rappresentare un tentativo dell’organismo di neutralizzare e rimuovere il danno patogeno, favorendo la riparazione del danno e ripristinando la normale funzionalità del tessuto.

L’infiammazione è classificata in infiammazione acuta o angioflogosi (avvio immediato per una durata di minuti o pochi giorni), e l’infiammazione cronica o istoflogosi (durata molto variabile: da giorni ad anni). L’angioflogosi può essere risolta completamente in seguito alla rimozione dell’agente nocivo, in caso contrario può portare a conseguenze più gravi, tra cui l’istoflogosi.

La risposta al danno e/o morte cellulare, determina attraverso la “cascata infiammatoria”, la comparsa dei cinque sintomi cardinali:

 Calor: aumento della temperatura locale, dovuto all’aumentata vascolarizzazione.

 Tumor: gonfiore determinato dalla formazione dell’essudato o dell’edema.

 Rubor: arrossamento legato all’iperemia attiva e all’aumentato metabolismo cellulare.

 Dolor: indolenzimento provocato dalla compressione o dall’intensa stimolazione delle terminazioni sensitive, da parte dell’agente infiammatorio e dei componenti dell’essudato.

 Functio laesa: compressione funzionale della zona colpita. La risposta infiammatoria dà luogo ad una successione di eventi:

 Vasodilatazione: il danno tissutale da luogo al rilascio di mediatori (autacoidi) che provocano la vasodilatazione, al fine di ridurre la velocità del flusso sanguigno attraverso l’aumento della pressione idrostatica. La vasodilatazione, inoltre, aiuta la disposizione dei leucociti lungo le pareti dei vasi. I mediatori coinvolti in questo processo sono: istamina, prostacicline (PgI2) e ossidi di azoto (NO2).

 Aumento della permeabilità vascolare: causato dal rilascio d’istamina, leucotrieni (C4, D4, E4), bradichinina, tumor necrosis factor (TNF) e interleuchine (IL-1). L’aumento della permeabilità causa il passaggio dei fluidi all’interstizio, il quale a sua volta causa l’aumento del livello proteico interstiziale. Questo meccanismo determina una diminuzione della pressione osmotica del sangue e un'aumentata pressione osmotica nell’interstizio, causando un ulteriore stravaso di liquidi che porta all’edema.

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L’infiammazione, acuta o cronica, pur essendo un importante meccanismo protettivo dell’organismo contro gli agenti nocivi, può dar luogo a varie condizioni patologiche quali:

 Ascessi, ulcere e fistole.

 Granuloma causato dall’intensa proliferazione cellulare circoscritta al tessuto fibroso. É una lesione tipica delle infiammazioni croniche che può essere di natura infettiva o dovuta a corpi estranei.

 Malattie allergiche: reazione innescata in modo inopportuno contro sostanze esogene altrimenti innocue (es: rinite allergica).

 Malattie autoimmuni: reazione innescata in modo inopportuno contro gli stessi tessuti dell’organismo (es: artrite reumatoide).

 Malattie degenerative ed immuno-mediate: in caso di fallimento nel rimuovere la causa dell'infiammazione, il processo infiammatorio si cronicizza, con produzione di mediatori e migrazione cellulare incontrollata (es: aterosclerosi).

In tutti questi casi l’infiammazione può arrecare danni anche gravi al soggetto, sia per il dolore che ad esso si associa, sia per il danno tissutale che essa stessa provoca. Nel caso in cui siano interessati organi vitali, o l’organismo sia coinvolto in maniera generalizzata, l’infiammazione può mettere in pericolo la vita del paziente e deve essere strettamente controllata con l’utilizzo di farmaci che siano in grado di ridurre la risposta infiammatoria in atto, o almeno, alcune delle sue manifestazioni (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a).

1.2.1.Gli autacoidi

Termine che deriva dal Greco: Autos = self e Acos = rimedio, cura.

Gli autacoidi rappresentano i mediatori umorali della comunicazione intercellulare a breve distanza, esercitando la loro azione su bersagli locali, raggiunti per diffusione negli spazi interstiziali e rappresentati da cellule vicine alla sede di produzione (azione paracrina) e/o dalle stesse cellule produttrici (azione autocrina). Generalmente non si trovano nel torrente sanguigno e pertanto sono indicati anche come “ormoni locali”. Gli autacoidi svolgono il ruolo di protagonisti della reazione infiammatoria e della risposta immunitaria. Oltre all’infiammazione, sono comunque riportati anche eventuali altri fenomeni biologici (fisiologici e fisiopatologici) nei quali il mediatore risulta essere funzionalmente coinvolto, in alcuni casi non come autacoide, ma come neurotrasmettitore o ormone. La conoscenza di tali fenomeni, infatti, è necessaria per comprendere gli effetti collaterali indesiderati dei farmaci usati per il controllo dell’infiammazione e/o eventuali altri loro campi di applicazione

14 terapeutica.

Gli autacoidi sono suddivisi per categorie chimiche in ammidici, lipidici, peptidici e di altra natura:

 Autacoidi ammidici: istamina (2-(4-imidazoil)etilamina), serotonina (5-idrossitriptamina).

 Autacoidi lipidici: eicosanoidi (prostaglandine, prostacicline, leucotrieni, trombossani, lipossine, epossiline, vari idroperossi-/idrossi-/epossidi acidi), fosfolipidi modificati.

 Autacoidi peptidici: fattori di crescita non emopoietici (EGF – Epidermal Growth Factor, NGF – Nerve Growth Factor), citochine (IL: interleuchine, IFN: interferoni, TNFα: Tumor Necrosis Factor).

 Altri autacoidi: Ossido Nitrico (NO), radicali liberi dell’ossigeno (ROS: Reactive Oxygen Species) (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a).

1.2.2.Eicosanoidi: biosintesi, struttura e nomenclatura

Sono tutti derivati del metabolismo ossidativo di alcuni acidi grassi polinsaturi a venti atomi di carbonio (eikosi in Greco = 20). Gli acidi grassi polinsaturi che rappresentano i precursori biosintetici degli eicosanoidi sono: acido diomo-γ-linoleico, acido timodonico ed acido arachidonico (AA). Nella maggior parte delle specie animali l’acido arachidonico è il precursore più abbondante e, pertanto, gli eicosanoidi si identificano in larga misura con i derivati di questo acido grasso. Nei tessuti, l’AA si trova prevalentemente nei fosfolipidi delle membrane cellulari, esterificato con l’ossidrile in posizione 2 dello scheletro carbonilico del glicerolo. Affinché la sintesi degli eicosanoidi possa avere luogo, è necessario che l’AA venga liberato dai fosfolipidi di membrana grazie all’enzima fosfolipasi A2 (PLA2), che caratterizza in maniera specifica l’idrolisi del legame estereo in posizione 2 del glicerolo (Fig. 3).

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Fig. 3 Liberazione dell'acido arachidonico e reazione chimica da fosfolipide ad AA

Gli stimoli che attivano questo enzima possono essere di diversa natura (fisici, chimici, biologici, fisiologici o patologici, endogeni o esogeni). Alcuni agiscono tramite specifici recettori (ormoni, neurotrasmettitori, autocoidi, allergeni, endotossine etc.), mentre altri provocano un’aspecifica perturbazione cellulare (traumi, shock termico, ipossia, agenti chimici, etc.). L’AA così liberato viene trasformato nelle diverse classi di eicosanoidi, per intervento di specifici enzimi, che catalizzano la cosiddetta “cascata dell'acido arachidonico”: si hanno quindi, reazioni biochimiche sequenziali in cui il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successiva. Le vie metaboliche nelle quali l’AA è metabolizzato sono essenzialmente tre:

1. La via delle ciclossigenasi (COX): porta alla formazione dei prostanoidi.

2. La via delle lipoosigenasi (LOX): porta alla formazione dei leucotrieni e di altri composti correlati (lipossine, epossine e vari idroperossi- e idrossi-acidi).

3. La via del citocromo P-450 (CYP-450) monoossigenasi: porta alla formazione di vari idrossi- ed epossi-acidi.

Le vie metaboliche meglio conosciute e di maggiore interesse farmacologico sono le vie delle COX e delle LOX (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a) (Fig. 4).

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Fig. 4 Vie metaboliche dell'acido arachidonico che portano alla formazione delle diverse classi di eicosanoidi

1.2.3.Le cicloossigenasi

Gli enzimi che catalizzano la formazione dei prostanoidi a partire dall'acido arachidonico sono le cicloossigenasi o COX (chiamate anche prostaglandino-G/H-sintasi o PGHS). Questi enzimi sono proteine globulari associate al versante endoluminale delle membrane del reticolo endoplasmatico e del nucleo. Sono enzimi bifunzionali, cioè sono capaci di due attività catalitiche: la cicloossigenasica e la perossidasica. Queste due funzioni avvengono in due siti attivi strutturalmente distinti:

 sito ad attività cicloosigenasica: l'AA viene trasformato nella prostaglandina G2 (PGG2);

 sito ad attività perossidasica: la PGG2 viene trasformata nella prostaglandina H2 (PGH2).

Le COX sono una classe di enzimi di cui si conoscono tre isoforme: la COX1, la COX2 e la COX3. Quest'ultima inizialmente era stata scoperta come una variante della COX1 ma studi recenti hanno dimostrato che può essere considerata una vera e propria terza forma molecolare di COX.

Per quanto riguarda COX1 e COX2, esse svolgono la stessa attività catalitica, agendo sullo stesso substrato e sono molto simili anche nella composizione aminoacidica. Le differenze principali fra le due isoforme si osservano:

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 a livello strutturale in particolare a carico del sito dell'attività cicloossigenasica

 a livello della distribuzione cellulare

 a livello dei meccanismi di regolazione della loro espressione molecolare (Fig. 5).

Fig. 5 Differenze strutturali tra i siti cicloossigenasici della COX1 e della COX2

In particolare:



la COX1 è un'isoforma costitutiva ed è quindi presente normalmente nella quasi totalità delle cellule e dei tessuti dell'organismo animale. Il suo livello di espressione è in genere costante, anche se varia da distretto a distretto (Zizzadoro & Belloli in Carli

et al., 2009a). Inoltre svolge fenomeni di housekeeping quali la citoprotezione gastrica

(Foegh & Ramwell in Katzung, 2005) e controlla le normali funzioni renali (Nakao et

al., 2007).



la COX2, in condizioni basali, è espressa in maniera costitutiva solo in alcuni tessuti quali cervello, pareti vasali e rene, mentre nella maggior parte delle cellule è virtualmente assente. Soprattutto nelle cellule coinvolte nell'infiammazione (monociti/macrofagi, granulociti, mastociti, fibroblasti, etc.), la sua espressione diventa apprezzabile solo dopo esposizione a stimoli adeguati (stimoli pro-infiammatori, fattori di crescita, ormoni, sollecitazioni meccaniche, etc.): questo fa della COX2 un'isoforma prevalentemente inducibile. Nell'ambito dello stesso contesto cellulare e/o tissutale, quando indotta, la COX2, generalmente raggiunge livelli di espressione di gran lunga superiori rispetto a quelli della COX1 presente (da 10 a 100 volte). Inoltre si associa alla produzione di maggiori quantitativi di prostanoidi (fino a 1000 volte) (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a).

18

1.2.3.1.Farmaci antiinfiammatori

Nell'accezione comune vengono indicati come “farmaci antiinfiammatori” quei farmaci che consentono di controllare l'infiammazione, o alcune sue manifestazioni, con un'alta efficacia terapeutica. Attualmente esistono due classi di composti che rispondo a questa definizione:

1. FAS: farmaci antiinfiammatori a struttura steroidea o più semplicemente glucorticoidi (GC). Nel caso dei GC, l'attività antiinfiammatoria deriva dalla loro capacità di interferire con la sintesi, il rilascio e/o l'azione di più mediatori contemporaneamente (citochine, eicosanoidi, nitrossido, ROS, istamina) e di inibire le funzioni (migrazione, attivazione, proliferazione) di tutte le cellule coinvolte nella reazione infiammatoria e/o immunitaria. Uno spettro d'azione così ampio spiega come i GC siano i farmaci antiinfiammatori più efficaci al momento disponibili e risultino attivi praticamente in tutti i tipi di flogosi (antiinfiammatori per eccellenza). Inoltre mostrano particolare utilità quando la responsabilità di una condizione infiammatoria ricade in ugual misura su più autacoidi o quando il mediatore principalmente responsabile del processo patologico non è noto.

2. FANS: farmaci antiinfiammatori non steroidei.

Nel caso dei FANS, l'attività antiinfiammatoria deriva principalmente dalla loro capacità di inibire la sintesi dei prostanoidi. Questi autacoidi, infatti, svolgono un ruolo chiave nella genesi della sintomatologia clinica di numerosi tipi di infiammazione, agendo soprattutto come “amplificatori” degli effetti di altri mediatori comunemente coinvolti nel processo flogistico (bradichinina, istamina, citochine, etc.). Esistono due gruppi di FANS: quelli tradizionali (farmaci aspirino-simili o t-FANS) e quelli innovativi (inibitori selettivi della COX2 o COXIB):

 t-FANS: sono farmaci con effetto antiinfiammatorio, analgesico ed antipiretico classificati sulla base della loro struttura chimica e divisi in due gruppi principali: quello degli acidi carbossilici e quello degli acidi enolici (Fig. 6).

19

Fig. 6 Classificazione dei t-FANS

A prescindere dalle differenze strutturali, questi composti sono per la maggior parte acidi organici deboli e contengono una porzione aromatica non steroidea che conferisce un certo grado di liposolubilità alla forma non ionizzata. I t-FANS più usati in medicina veterinaria sono: acido acetilsalicilico, naproxene, carprofene, ketoprofene, acido tolfenamico, eltenac, etodolac, flunixina, fenilbutazone, dipirone, piroxicam, meloxicam e nimesulide. Tutti quanti condividono lo stesso meccanismo d'azione cioè inibiscono l'attività cicloossigenasica delle COX senza interferire con quella perossidasica e, sul piano qualitativo i meccanismi molecolari responsabili di tale inibizione sono principalmente due:

 inibizione competitiva e reversibile: la maggior parte dei t-FANS inibisce le COX in maniera reversibile, mediante competizione con l'AA per il legame a comuni siti di ancoraggio all'interno del canale cicloossigenasico. Per esempio, il residuo polare di arginina in posizione 120 (Arg120), presente sulle COX, rappresenta un importante sito di ancoraggio per il gruppo -COOH dell'AA ed è un sito comune di legame anche per tutti i t-FANS appartenenti al gruppo degli acidi carbossilici (Fig. 7a).

20

aspirina, è l'unico t-FANS finora conosciuto in grado di inibire in maniera irreversibile le COX mediante trans-acetilazione selettiva di uno specifico residuo di serina (Ser530) che occupa una posizione strategica nel canale cicloossigenasico. La serina così acetilata, crea un ingombro sterico che impedisce all'AA di interagire con il residuo tirosinico in posizione 385 (Tyr385). Questo è indispensabile per dare inizio alla catalisi enzimatica. Poiché il radicale acetilico donato dall'aspirina instaura con il residuo di serina un legame di tipo covalente, l'inibizione delle COX da parte di questo t-FANS, oltre che non competitiva, è anche irreversibile (Fig. 7b).

Fig. 7 Meccanismi molecolari dell'inibizione delle cicloossigenasi da parte dei t-FANS. a) inibizione competitiva reversibile; b) inibizione non competitiva irreversibile

 COXIB: sono farmaci inibitori selettivi delle COX, sviluppati quando è stato scoperto che esistevano varie isoforme di cicloossigenasi. In realtà, il termine COXIB, si riferisce ad una specifica classe chimica caratterizzata da una particolare struttura molecolare contenete un anello triciclico ed un gruppo metilsulfonico o sulfonamidico e non ha niente a che fare con la selettività. Esistono infatti sia COXIB inibitori selettivi della COX1 che inibitori selettivi della COX2, anche se questi ultimi sono la grande maggioranza. I capostipiti degli inibitori selettivi della COX2 sono il celecoxib ed il rofecoxib (ritirato dal commercio nell'ottobre del 2004). Numerose altre molecole si sono in seguito aggiunte (inibitori della COX2 di seconda generazione), come il

21

cimicoxib, l’eterocoxib, il lumeracoxib, il robenacoxib, sviluppato per il trattamento dell’infiammazione cronica nel cane e nel gatto, il valdecoxib e il suo pro-farmaco parecoxib che si distinguono per una selettività sempre più alta verso le COX2, per caratteristiche farmacologiche più favorevoli e/o per minori effetti collaterali (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009b). Studi clinici hanno dimostrato che i farmaci COX2 selettivi provocano una riduzione importante del dolore e del gonfiore alle articolazioni (Simon et al., 1998). Le basi molecolari della selettività risiedono:

 Nella presenza dei gruppi funzionali metilsolfonico e solfonamidico, capaci di interagire con residui aminoacidici localizzati in corrispondenza della tasca laterale del canale cicloossigenasico, accessibile solo nella COX2.  Nell’assenza del gruppo carbossilico, che impedisce alla molecola di avere

un sito di ancoraggio sull’Arg-120, riducendo la capacità di legame della molecola alla COX1.

 Nell’ingombro sterico, che rende difficoltoso l’ingresso della molecola nello stretto canale cicloossigenasico delle COX1 (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009b) (Fig. 8).

22

Fig. 8 Basi molecolari della selettività dei FANS inibitori della COX2

1.2.4 Formazione di prostanoidi e loro recettori

La PGH2, è un composto intermedio altamente reattivo derivante dalla prima parte della cascata dell'AA, che per intervento di specifici enzimi come PGD-, PGE-, PGF-, PGI- e TXA-sintasi, viene a sua volta trasformata in una serie di prodotti terminali biologicamente reattivi, che diffondono passivamente nell’ambiente extracellulare. Il loro insieme è indicato con il nome di prostanoidi e sono:

 Prostaglandine D2, E2, F2α (PGD2, PGE2, PGF2α).

 Prostaciclina (o prostaglandine I2 o PGI2).

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Ogni prostanoide si lega ad uno o più recettori specifici che vengono comunemente divisi in 5 classi: DP, EP, FP, IP e TP, dove “P” sta per prostanoide e la prima lettera fa riferimento al prostanoide naturale più affine a quella classe recettoriale (Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a) (Fig. 9).

Fig. 9 Prostanoidi e loro recettori

Tutti questi recettori fanno parte della famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) i quali hanno tre componenti essenziali che definiscono la trasduzione del segnale: un recettore localizzato sulla membrana plasmatica con sette eliche transmembrana, un enzima effettore, anch'esso localizzato sulla membrana plasmatica che genera un secondo messaggero intracellulare, e una proteina che lega i nucleotidi guanilici (proteina G) che attiva l'enzima effettore (Nelson & Cox, 2010). Molti ligandi extracellulari agiscono aumentando la concentrazione di secondi messaggeri quali l'adenosina-3'-5'-monofosfato ciclico (AMPc), lo ione calcio e il fosfatidilinositolo. Questi secondi messaggeri solitamente vengono riconosciuti da un recettore di membrana, il quale attiva la proteina G localizzata sulla membrana citoplasmatica; la proteina G attivata modifica l'attività di un effettore, che di solito è un enzima o un canale ionico, e quest'ultimo determina la variazione di concentrazione del secondo messaggero intracellulare (Bourne & Von Zastrow in Katzung, 2005).

I recettori FP per la PGF2α, IP per la PGI2 e TP per la TXA2 sembrano esistere come unica isoforma. Il recettore DP per la PGD2 ha due sottotipi, DP1 e DP2, ai quali la PGD2 si lega

24

con la stessa affinità. Il recettore EP per la PGE2 ha invece quattro diversi sottotipi EP1, EP2, EP3 ed EP4 che differiscono tra di loro per distribuzione tissutale, caratteristiche funzionali e risposte biologiche che dipendono dalla loro attivazione (Coleman et al., 1994; Zizzadoro & Belloli in Carli et al., 2009a):

 EP1 è accoppiato alla mobilitazione di calcio intracellulare

 EP3 è accoppiato all'inibizione dell'adenilato ciclasi tramite una proteina G inibitoria (Gi)

 EP2 ed EP4 sono accoppiati alla stimolazione di adenilato ciclasi tramite una proteina G stimolatoria (Gs) (Nakao et al., 2007).

Le funzioni di questi recettori sono multiple e possono anche essere condivise.

1.2.4.1.Il recettore EP4

Il recettore EP4 si è visto essere coinvolto nella risposta immunitaria, nell'ischemia, nell'aggregazione piastrinica, nei disordini vascolari, nelle allergie, nelle infiammazioni del tratto gastrointestinale e nel danneggiamento degli organi (Zimecki, 2012). Ma soprattutto gioca un ruolo cruciale nello sviluppo del dolore di tipo acuto e cronico e nell'infiammazione ed è quindi uno dei più importanti esecutori degli effetti di PGE2 in questi processi (Grösch et

al., 2016). In particolare, a livello del sistema nervoso periferico, quando si sviluppa

un'infiammazione si ha il richiamo di mediatori dell'infiammazione quali mastociti, macrofagi e basofili che provocano un aumento delle COX2 e degli enzimi che formano la prostaglandina E2 come l'mPGES. Questi provocano un aumento della PGE2, che va a legarsi al recettore EP4 con una conseguente attivazione della via di segnalazione intracellulare comprendente un aumento intracellulare di cAMP e quindi l'attivazione delle proteine chinasi. Ciò porta alla fosforilazione di un certo numero di proteine bersaglio tra cui i canali TRPV1 (recettore vanilloide per la capsaicina), i canali del Na+ voltaggio dipendenti (Nav1.8) e i canali del calcio T-type. A questo punto il processo riparte dall'inizio come un loop (Kawabata, 2011).

A livello del sistema nervoso centrale, lo stimolo infiammatorio e dolorifico si sviluppa a livello delle corna dorsali del midollo spinale grazie alla trasmissione chimica da neurone pre-sinaptico a quello post-pre-sinaptico (Kuner, 2010). Qui il recettore EP4, posizionato sul neurone pre-sinaptico, attiva la liberazione di mediatori chimici come la sostanza P, il glutammato e la calcitonina, i quali attraverso canali NMDA e AMPA arrivano al neurone post-sinaptico e provocano l'aumento di COX2 e mPGES. Questo provoca un aumento delle PGE2 che si vanno a legare nuovamente ai recettori EP4 sul neurone pre-sinaptico ed il processo riparte

25

(Grösch et al., 2016). Alcuni studi hanno evidenziato inoltre, che durante il processo infiammatorio, si ha l'aumento della densità dei recettori EP4 a livello del midollo spinale (Lin et al., 2006; Kirkby Shaw et al., 2015). Contemporaneamente nella fase discendente della via del dolore, si ha il blocco della produzione di glicina, un aminoacido di tipo inibitorio, che di norma va a ridurre la produzione di PGE2 (Grösch et al., 2016) (Fig. 10).

Fig. 10 Vista semplificata del sistema nocicettivo (parte alta) e ruolo della PGE2 nella nocicezione infiammatoria a livello molecolare (parte bassa)

Ed è proprio a questi livelli che va ad agire il grapiprant, in quanto antagonista del recettore EP4 delle prostaglandine E2.

1.3.Il grapiprant

Il grapiprant è un farmaco, appartenente alla classe delle piprant, approvata come nuova classe di farmaci nell'ottobre del 2013 dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (World Health Organization, 2013). Questa classe racchiude farmaci che sono antagonisti dei recettori delle prostaglandine e che vengono definiti con il sinonimo di PRA (prostaglandin receptor antagonists) (Kirkby Shaw et al., 2015).

26

1.3.1.Caratteristiche chimico-fisiche

Il grapiprant (1-[2-[4-(2-etil-4,6-dimetilimidazo[4,5-c]piridin-1-il)fenil]etil]-3-(4-metilfenil)

solfanilurea) (Fig. 11) (C26H29N5O3S) ha un peso molecolare di 491.61 g/mol, un coefficiente

di ripartizione ottanolo-acqua di 4.56, una scarsa solubilità in acqua (0.041 mg/L) ma una migliore solubilità in metanolo ed etanolo (De Vito et al., 2015).

Fig. 11 Struttura chimica del grapiprant

1.3.2.Galliprant

®

Il grapiprant è stato messo in commercio con il nome commerciale di Galliprant dalla casa farmaceutica Aratana Therapeutics (Leawood, KS, USA) con formulazione farmaceutica di compresse, facilmente divisibile in due parti. La somministrazione è per uso orale (PO) e per uso esclusivo nei cani. La dose giornaliera consigliata è di 2 mg/kg una volta al giorno.

Effetti collaterali riscontrati sono: vomito, diarrea, feci molli, anoressia, inappetenza, letargia, ulcera boccale e anemia emolitica immunomediata.

1.3.3.Studi

Alcuni studi sono stati effettuati recentemente su questa molecola prendendo in considerazione due specie animale: il cane ed il gatto.

1.3.3.1.Studi nel cane

Nello studio di Rausch-Derra et al. (2015) è stata valutata la sicurezza della somministrazione PO giornaliera in 36 cani di razza Beagle (età: 9 mesi; sesso: maschio e femmina). I cani sono stati assegnati in modo casuale a gruppi che hanno ricevuto il farmaco tramite sonda gastrica, alla dose di 0, 1, 6, 50 mg/kg ogni 24 h per 9 mesi. Ogni gruppo conteneva 4 cani di ciascun

27

sesso, ad eccezione del gruppo con la dose a 50 mg/kg che comprendeva 4 cani aggiuntivi monitorati per altri 30 giorni dopo la fine del trattamento (periodo di recupero). Alla fine della sperimentazione è stato visto che tutti i cani sono rimasti clinicamente sani, senza perdita di appetito o comportamenti inusuali. Emesi e feci molli o mucoidi che a volte contenevano sangue sono state osservate in tutti i gruppi, ma principalmente in quelli che hanno ricevuto il grapiprant. In generale i risultati clinico-patologici sono rimasti entro i valori basali. Quindi i risultati suggeriscono un buon profilo di sicurezza della somministrazione PO a lungo termine del grapiprant.

In un successivo studio è stata valutata la tossicocinetica della somministrazione PO di Grapiprant in compresse. Sedici cani di razza Beagle sono stati sottoposti ad uno studio cross-over in cui veniva somministrata la dose di 6 o 50 mg/kg di grapiprant una volta sottoforma di compressa e una volta come sospensione con un periodo di wash-out di 15 giorni tra l'una e l'altra. Solo in 3 cani è stato riscontrato vomito o feci molli. Per entrambe le formulazioni, il farmaco ha raggiunto la concentrazione massima in 2 h. Le compresse hanno una più alta biodisponibilità, con un AUClast più alta del 34% alla dose di 6 mg/kg e del 64% alla dose di

50 mg/kg, rispetto alla sospensione. Le AUC ottenute al giorno 0 ed al giorno 15 sono simili e suggeriscono che non c'è accumulo (Rausch-Derra et al., 2016b).

In letteratura è presente un ulteriore studio riguardante 285 cani di proprietà con osteoartrite (OA). Solo 262 (131 per ogni gruppo) sono stati trattati e valutati per l'efficacia del grapiprant. Ad un gruppo è stato somministrato il farmaco e all'altro il placebo. I cani sono stati valutati con il “Canine Brief Pain Inventory” (CBPI) al giorno 0, 7, 14, 21 e 28; il successo è stato valutato con il miglioramento del CBPI. I risultati di questo studio hanno messo in evidenza come i cani trattati con il grapiprant abbiano avuto un netto miglioramento rispetto a quelli trattati con il placebo anche se il 17.02% dei cani di questo gruppo hanno riscontrato occasionale vomito rispetto ad un 6.25% del gruppo di controllo. In conclusione è stato visto che il grapiprant è un farmaco efficace contro l'OA (Rausch-Derra et al., 2016a).

Nagahisa & Okumura (2016) hanno stimato che la dose efficace canina di grapiprant è tra 1.3 e 1.7 mg/kg, una volta al giorno. Inoltre hanno evidenziato come l’affinità del grapiprant del recettore EP4 canino sia comparabile con quella umana e murina.

28

1.3.3.2.Studi nel gatto

Rausch-Derra & Rhodes (2016) hanno valutato la sicurezza e la tossicità associata alla somministrazione orale giornaliera di grapiprant. Ventiquattro gatti (12 maschi e 12 femmine) hanno ricevuto una capsula di placebo o di farmaco alla dose di 3, 9 o 15 mg/kg per 28 giorni. I risultati ottenuti evidenziano che il farmaco raggiunge velocemente il picco di concentrazione plasmatica e che mantiene concentrazioni consistenti durante tutto il periodo dello studio. Il grapiprant è ben tollerato e nessun effetto collaterale è stato evidenziato a dosi minori o uguali a 15 mg/kg. Tutto ciò suggerisce che questo farmaco sia sicuro per una somministrazione PO giornaliera.

29

30 Gli scopi di questa tesi sono stati:



Determinare il profilo farmacocinetico del grapiprant in cani, gatti e conigli sani dopo differenti vie di somministrazioni e formulazioni di grapiprant, attraverso lo strumento HPLC-FL.



Determinare il profilo farmacodinamico del grapiprant in un modello d'infiammazione indotto con carragenina nel coniglio.

31

32

3.1.Fasi del lavoro

Il progetto della Tesi di Laurea è stato sviluppato dividendo il lavoro in tre studi:

 Studio farmacocinetico (PK) del grapiprant nel cane: la sperimentazione animale del presente studio è stata eseguita in collaborazione con l'Università di Lublino (Polonia)

“Department of Pharmacology, University of Life Sciences, Lublin, Poland”.

 Studio farmacocinetico (PK) del grapiprant nel gatto: la sperimentazione animale del presente studio è stata eseguita in collaborazione con l'Università di Lublino (Polonia)

“Department of Pharmacology, University of Life Sciences, Lublin, Poland”.

 Studio farmacocinetico (PK) e farmacodinamico (PD) di grapiprant nel coniglio: la sperimentazione animale é stata eseguita in collaborazione con il Dottor Marco Salvadori presso il suo studio veterinario “Centro Veterinario Exotic, Gello, San

Giuliano Terme, Pisa”.

L'indagine analitica dei campioni di plasma ottenuti dalla sperimentazione animale è stata eseguita presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie dell'Università di Pisa.

3.2.Metodica analitica

3.2.1.Prodotti chimici e reagenti

Grapiprant: polvere pura >99.0% ChemBo Pharma (Nanjing, Cina)

Metoclopramide: polvere pura >99.0% Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Meloxicam: Boehringer Ingelheim (Milano, Italia)

Lambda carragenina: Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) Acetonitrile (AcN): Merck (Darmstadt, Germania)

Metanolo (MeOH): Merck (Darmstadt, Germania) Cloroformio (CH3Cl): Merck (Darmstadt, Germania)

Etanolo (EtOH): Merck (Darmstadt, Germania)

Acetato d'ammonio (AcONH4): Carlo Erba (Milano, Italia)

Acqua deionizzata ottenuta utilizzando Milli-pore Water System Milli-Q (Millipore, MA, USA)

3.2.2.Strumentazione



Centrifuga UNIVERSAL 320 Hettich Zentrifugen (Ramsey, Minnesota, USA)

33



Agitatore DYNAL Sample Mixer (Tilling Drive Stone, Staffordshire, UK)



pHmetro HANNA INSTRUMENTS HI 9219 (Ronchi di Villafranca, PD, Italia)



HPLC-FL: High Performance Liquid Chromatography (Jasco) (Tokyo, Giappone)



Plantar Antinociception Device (Hargreave's instrument, model 37370, Ugo Basile)



Per l'essiccamento dei campioni è stato usato uno strumento con una base riscaldata a 40 °C ed aghi mobili che portavano un flusso leggero e costante di azoto

3.2.3.Preparazione delle soluzioni



Soluzione acquosa di acetato d'ammonio 20 mM pH 4

La soluzione acquosa di acetato d'ammonio utilizzata nella fase mobile, alla concentrazione di 20 mM, è stata preparata pesando 1.54 g esatti di acetato d'ammonio in 1 L di acqua distillata, sotto agitazione meccanica. Il pH della soluzione, del valore di 4, è stato corretto, con l'aggiunta di acido acetico, attraverso l'utilizzo di un pHmetro con un elettrodo a vetro. In seguito la soluzione è stata conservata in frigo a +4 °C per un massimo di 5 giorni.

3.2.4.Soluzioni degli standards analitici



Soluzione di grapiprant 1000 μg/mL

La soluzione madre di grapiprant 1000 μg/mL è stata preparata pesando 10 mg di grapiprant in polvere e disciolti in 10 mL di MeOH. In seguito, dalla soluzione madre, sono state effettuate delle diluizioni, sempre in MeOH, allo scopo di ottenere diverse concentrazioni: 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1000 ng/mL, 500 ng/mL, 200 ng/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mL.



Soluzione di metoclopramide 1000 μg/mL

La soluzione madre di metoclopramide 1000 μg/mL è stata preparata pesando 10 mg di metoclopramide in polvere e disciolti in 10 mL di MeOH. In seguito, dalla soluzione madre, sono state eseguite diluizioni a scalare, sempre in MeOH, allo scopo di ottenere la concentrazione, finale di 250 μg/mL.

34

3.3.HPLC-FL

Nel presente studio sono state utilizzate delle condizioni cromatografiche già validate in uno studio di De Vito et al. (2015). É stato usato lo strumento HPLC, per la precisione un LC Jasco (Como, Italia) costituito da un sistema a gradiente quaternario (PU 2080 plus) e un rilevatore a fluorescenza multilambda (FP2020). La separazione cromatografica è stata eseguita con una colonna Synergi Polar-RP 80A di lunghezza 150 mm, diametro 4.6 mm, grandezza delle particelle 4 μm (Phenomenex, Castel Maggiore, Italia) preceduta da una pre-colonna con la stessa fase stazionaria (Phenomenex, Castel Maggiore, Italia). Il sistema è stato mantenuto a 25 °C e lo strumento ha lavorato secondo eluizione isocratica, con un flusso di 1 mL/min e lunghezze d'onda a 240 e 400 nm rispettivamente per eccitazione ed emissione. Le corse cromatografiche sono state impostate a 15 min ciascuna. Lo strumento è stato interfacciato ad un personal computer e le aree dei picchi sono state ottenute attraverso il programma BORWIN JASCO.

La fase mobile utilizzata per questo studio è stata determinata tramite l'utilizzo di due fasi in rapporto percentuale 30:70 in maniera isocratica. Fase A (30%) AcN. Fase B (70%) soluzione acquosa di AcONH4 20 mM pH 4.

3.3.1.Metodo di estrazione dei campioni

Aliquote da 500 μL di plasma sono state inserite in tubi di plastica da 15 mL. Vi sono stati addizionati 100 μL di IS (metoclopramide 25 μg/mL in metanolo) e dopo i campioni sono stati vortexati per circa 30 sec. A questo punto sono stati aggiunti 4 mL di CH3Cl, vortexati

nuovamente per 30 sec e poi posti in agitatore (60 osc/m per 10 min) e in centrifuga ad una velocità di 21913 g per 10 min ad una temperatura di 25 °C. Tre mL di surnatante sono stati prelevati e messi in tubi puliti da 15 mL e quindi portati a secco attraverso un flusso di azoto a temperatura costante. Una volta evaporata la fase organica, l'estratto, rimasto sulle pareti dei tubi, è stato ricostituito con 500 μL di fase mobile e vortexato per 1 min. Cinquanta μL di ciascun campione sono stati iniettati nell'HPLC-FL da cui sono state ottenute curve cromatografiche relative al grapiprant e al suo IS.

35

3.4.Curva

di

calibrazione

del

grapiprant

per

ciascuna

sperimentazione animale

Le soluzioni di grapiprant sono state aggiunte a campioni di plasma bianco (plasma specifico per ogni specie di interesse privo di trattamenti farmacologici) e analizzate con lo strumento HPLC iniettando i campioni per tre volte ciascuna in ordine crescente di concentrazione, per ottenere una curva di calibrazione. Questa procedura è stata ripetuta per ciascuna specie animale sperimentata: cane (Fig. 12), gatto (Fig. 13) e coniglio (Fig. 14). Per quanto riguarda il cane il metodo è stato validato nel nostro laboratorio da De Vito et al. (2015), mentre per i campioni plasmatici provenienti da gatto e coniglio il metodo è stato brevemente rivalidato. I parametri valutati sono stati la selettività del metodo, il limite di determinazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ), il CV inter-day ed intra-day, e il range di linearità.

Fig. 12 Curva di calibrazione della sperimentazione nel cane

0 250 500 0 20 40 60 80 f(x) = 0.14x - 0.13 R² = 1 Concentration (ng/mL) R at io G ra p ip ra n t/ IS

36

Fig. 13 Curva di calibrazione della sperimentazione nel gatto

Fig. 14 Curva di calibrazione della sperimentazione nel coniglio

Le curve di calibrazione hanno permesso il calcolo delle concentrazioni dell'analita, presente nei vari campioni di plasma di ogni specie animale, a seguito dei valori ricavati dalle aree dei picchi presenti nei cromatogrammi ottenuti attraverso l'HPLC.

3.5.Metodo per la determinazione delle concentrazioni di analita

nei campioni

Lo studio è stato sviluppato secondo il metodo dello standard interno: la metoclopramide è stata scelta come standard interno (IS) per le affinità strutturali e chimico-fisiche con il

0 250 500 750 1000 0 4 8 12 f(x) = 0.01x + 0.16 R² = 1 Concentration (ng/mL) R at io G ra p ip ra n t/ IS 0 250 500 0 4 8 12 16 f(x) = 0.02x - 0.13 R² = 1 Concentration (ng/mL) R at io G ra p ip ra n t/ IS

37 grapiprant (De Vito et al., 2015).

Questo metodo è servito per il calcolo della concentrazione di grapiprant nei campioni di plasma, dove è stato determinato il rapporto tra l'area dell'analita e del suo IS ottenute dai rispettivi picchi cromatografici. In seguito, grazie alla curva di calibrazione calcolata precedentemente, sono stati ottenuti i valori di concentrazione di grapiprant nel plasma. Le curve di calibrazione si basano sull'equazione di una retta:

Y= aX + b

dove: Y rappresenta il rapporto tra l'area dello standard a concentrazione nota e l'area dello standard interno; a e b sono parametri costanti nella curva di calibrazione rispettivamente angolo ed intercetta dell'asse y; X rappresenta la concentrazione di grapiprant.

Dato che l'incognita è la concentrazione di grapiprant (X), l'equazione viene ri-arrangiata:

X= (Y-b)/a

In questo modo ottengo la concentrazione di analita.

3.6.Studio farmacocinetico nel cane

In questo studio sono stati utilizzati 8 cani femmina di razza Labrador Retriever, di età compresa tra 4 e 10 anni (adulti), e con un peso corporeo compreso tra 34.5-42.1 kg. I cani sono stati precedentemente sottoposti a diverse analisi chimico-ematico-cliniche per accertarsi che fossero sani. Gli animali sono stati controllati giornalmente da personale specializzato per osservare eventuali effetti avversi (fino a 3 giorni dopo il completamento dello studio).

Lo studio è stato condotto in due fasi:

 La prima fase è stata uno studio pilota (pilot study), dove 2 animali scelti random con la tecnica del sorteggio, hanno ricevuto una dose endovenosa (IV) di grapiprant di 0.5 mg/kg disciolta in 50 mg/mL di etanolo. La soluzione iniettabile è stata preparata sciogliendo la polvere pura di grapiprant in etanolo per dare una soluzione di 50 mg/mL. La soluzione è stata iniettata usando un catetere inserito nella vena cefalica della zampa anteriore destra.

 Nella seconda fase, i rimanenti 6 cani, sono stati assegnati random, secondo la tecnica del sorteggio, a due gruppi: gruppo A (n=3) e gruppo B (n=3). Lo studio condotto ha un disegno cross-over secondo la teoria del quadrato latino 2x2. Gli animali del

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gruppo A hanno ricevuto, tramite somministrazione orale (PO), una dose di grapiprant pari a 2 mg/kg (dose clinica riportata da Rausch-Derra et al. (2015)) alle ore 9:00 del mattino dopo essere stati a digiuno per 12 h. Gli animali del gruppo B hanno ricevuto, sempre tramite somministrazione PO, la stessa dose di grapiprant, ma dopo che alle 8:00 del mattino erano stati cibati con cibo per cani (Hill's Science Diet Pet Food Adult, Hill's Pet Nutrition, Rome, Italy). La dose di farmaco orale è stata preparata micronizzando la polvere pura di grapiprant manualmente in un mortaio e poi inserita in capsule (LGA, Toulon, France). Per accertarci che le capsule fossero ingerite è stata somministrata dell'acqua agli animali. É stato osservato un periodo di wash-out di una settimana per essere sicuri che il farmaco fosse stato completamente metabolizzato ed eliminato. Nella seconda fase i gruppi sono stati invertiti: la dose e la somministrazione sono rimaste invariate, ma il gruppo A è stato cibato mentre il gruppo B è stato tenuto a digiuno.

Prima dell'inizio dello studio è stato inserito un catetere nella vena cefalica della zampa anteriore sinistra di ciascun cane per facilitare i prelievi di sangue. I campioni di sangue (5 mL) sono stati raccolti a 5, 15, 30, 45 min e a 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 36 h dopo la somministrazione di grapiprant e posti in tubi eparinizzati. I campioni sono stati centrifugati alla velocità di 1000 g per un tempo di 15 min al fine di ottenere la separazione del plasma. Il plasma ottenuto è stato prelevato e messo in eppendorf e successivamente riposto nel congelatore alla temperatura di -70 °C, per la conservazione dei campioni e analizzati entro 15 giorni dal collezionamento.

3.6.1.Analisi dei campioni di plasma

L'analisi dei campioni di plasma ottenuti è stata effettuata utilizzando la stessa metodica di estrazione riportata al par. 3.3.1.

3.6.2.Integrazione dei dati

Attraverso le curve cromatografiche ottenute con l'utilizzo dell'HPLC-FL dopo l'estrazione, sono state determinate le aree dei picchi e successivamente la concentrazione di analita. Questi dati sono stati analizzati attraverso il programma WinNonlin (versione 5.3.1) (Pharsight, NC, USA) al fine di ottenere dei parametri farmacocinetici rappresentativi di un modello non-compartimentale. La concentrazione massima (Cmax) di grapiprant nel plasma e

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L’area sottesa alla curva (AUC0-24) è stata calcolata seguendo la regola dei trapezi

(Gabrielsson & Weiner, 2002). Sono state calcolate le seguenti variabili: la concentrazione massima (Cmax), il tempo per la concentrazione massima (Tmax), il tempo di emivita della fase

terminale (T½ λz), costante di eliminazione nella parte terminale (λz), area sotto la curva della

concentrazione plasmatica vs tempo, estrapolata nelle 24 h (AUC0-24) (Wagner, 1993), volume

apparente di distribuzione (Vz/F), clearance plasmatica apparente (CL/F), area sotto la curva al momento dell’ultima osservazione (AUMClast), tempo medio di permanenza basato sui

valori dell’ultima concentrazione misurata (MRTlast).

3.6.3.Analisi statistica

La comparazione tra i dati ottenuti per il gruppo dei cani cibati e per quello dei cani a digiuno è stata effettuata usando lo Student t-test. Tutte le analisi sono state condotte usando GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7.Studio farmacocinetico nel gatto

In questo studio sono stati usati 6 gatti maschi castrati di razza European con un peso corporeo compreso tra 3.0 e 3.8 kg. I gatti sono stati valutati sani attraverso esami clinici. Gli animali sono stati controllati giornalmente da personale specializzato per osservare eventuali effetti avversi (fino a 3 giorni dopo il completamento dello studio).

I gatti sono stati assegnati random, attraverso uno specifico programma, a due gruppi: gruppo A (n=3) e gruppo B (n=3). Lo studio condotto è stato eseguito secondo un disegno cross-over in accordo con la teoria del quadrato latino 2x2. Gli animali del gruppo A hanno ricevuto, tramite somministrazione PO, una dose di grapiprant pari a 2 mg/kg (dose clinica canina) alle ore 9:00 del mattino dopo essere stati a digiuno per 10 h. La dose orale è stata preparata micronizzando la polvere pura di grapiprant manualmente in un mortaio e poi inserita in capsule (LGA, Toulon, France). Per accertarci che le capsule fossero ingerite è stata somministrata dell'acqua agli animali. Gli animali del gruppo B, invece, hanno ricevuto la stessa dose di farmaco ma con somministrazione endovenosa (IV) tramite un catetere (G24, 30 mm, Delta Ven, Mantova, Italia) inserito nella vena cefalica della zampa anteriore destra. Per questa somministrazione il grapiprant è stato disciolto in 50 mg/mL di etanolo prima dell'iniezione. Un periodo di wash-out di una settimana è stato osservato per essere sicuri che il farmaco fosse stato completamente metabolizzato ed eliminato. Nella seconda fase i gruppi sono stati invertiti: il gruppo A è stato trattato con una dose di 2 mg/kg con somministrazione

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IV, mentre il gruppo B è stato trattato con la stessa dose ma con somministrazione PO.

Prima dell'inizio dello studio è stato inserito un catetere nella vena cefalica della zampa anteriore sinistra di ciascun gatto per facilitare i prelievi di sangue. I campioni di sangue (1 mL) sono stati raccolti a 5, 15, 30, 45 min e a 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 36 h dopo la somministrazione di grapiprant e posti in tubi eparinizzati. I campioni sono stati centrifugati alla velocità di 1000 g per un tempo di 15 min al fine di ottenere la separazione del plasma. Il plasma ottenuto è stato prelevato e messo in eppendorf e successivamente riposto nel congelatore alla temperatura di -70 °C, per la conservazione dei campioni e analizzati entro 15 giorni dal collezionamento.

3.7.1.Analisi dei campioni di plasma

L'analisi dei campioni di gatto è stata eseguita con la stessa procedura della metodica di estrazione riportata al par. 3.3.1. dopo aver rivalidato brevemente il metodo per questa specie animale.

3.7.2.Integrazione dei dati

L'integrazione dei dati è avvenuta con la stessa procedura eseguita per lo studio nei cani (par. 3.6.2.).

3.7.3.Analisi statistica

La comparazione tra i dati ottenuti per i due gruppi di gatti è stata effettuata usando lo Student t-test. Tutte le analisi sono state condotte usando GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).