Studio farmacocinetico e farmacodinamico nel coniglio

Nel presente studio sono stati usati 12 conigli di razza New Zealand di sesso femminile (Pampaloni, Fauglia, Pisa, Italia) con un peso corporeo compreso tra 2.7 e 3.1 kg. In tutti e 12 gli animali è stata indotta un'infiammazione nel polpastrello del dito esterno della zampa posteriore sinistra, dopo aver rasato e segnato il punto con un pennarello. L'infiammazione è stata provocata con un'iniezione di lambda carragenina (3% in soluzione fisiologica con volume di iniezione 200 μL). Il foro d'ingresso della siringa è stato fatto in posizione laterale rispetto al punto segnato con il pennarello secondo il modello animale descritto da Dong et al. (2008).

3.8.1.Studio farmacocinetico

I 12 conigli sono stati divisi random, in due gruppi di 6 animali ciascuno per due studi diversi. Gli studi condotti hanno entrambi un disegno cross-over secondo la teoria del quadrato latino 2x2. Sono state aspettate 3 h dall'iniezione di carragenina per l'inizio degli studi:

 Nel primo studio, i 6 conigli sono stati divisi random in due gruppi: gruppo A (n=3) e gruppo B (n=3). Gli animali del gruppo A hanno ricevuto una dose di 2 mg/kg di grapiprant tramite somministrazione IV attraverso un catetere posizionato sulla vena marginale dell'orecchio sinistro (dose clinica canina). La soluzione iniettabile è stata preparata sciogliendo la polvere pura di grapiprant in etanolo per dare una soluzione di 30 mg/mL. Gli animali del gruppo B hanno ricevuto una somministrazione IV di etanolo (con una dose equivalente a quella di grapiprant) nella stessa vena marginale dell'orecchio sinistro. Dopo due settimane di wash-out, periodo stimato perché l'infiammazione provocata nella zampa fosse risolta, i gruppi sono stati invertiti: il gruppo A ha ricevuto la somministrazione IV di etanolo, mentre il gruppo B ha ricevuto la somministrazione IV di grapiprant (le dosi sono rimaste invariate).

 Nel secondo studio, i 6 conigli sono stati divisi in maniera random in due gruppi: gruppo C (n=3) e gruppo D (n=3). Gli animali del gruppo C hanno ricevuto la somministrazione sottocutanea (SC) di meloxicam (5 mg/mL 15% soluzione di etanolo, Metacam, Boehringer Ingelheim, Milano, Italia) alla dose di 0.5 mg/kg (dose scritta sul foglietto illustrativo del farmaco). É stato scelto il meloxicam come gold standard dato che è il farmaco che viene utilizzato comunemente per la cura delle patologie sulle quali dovrebbe andare ad agire lo stesso grapiprant. Gli animali del

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gruppo D hanno ricevuto una somministrazione sottocutanea di etanolo 15% in acqua distillata ad un volume equivalente a quello della dose di meloxicam. Dopo due settimane di wash-out i gruppi sono stati invertiti: il gruppo C ha ricevuto la somministrazione SC di etanolo mentre il gruppo D ha ricevuto la somministrazione SC di meloxicam (le dosi sono rimaste invariate).

Prima dell'inizio dello studio è stato inserito un catetere nella vena dell'orecchio destro di ciascun coniglio per facilitare i prelievi di sangue e dopo ogni prelievo sono stati iniettati nel catetere 1 mL di soluzione salina (NaCl 0.9%) con 10 UI/mL di eparina per mantenere pervio il catetere. I campioni di sangue (0.7 mL) sono stati raccolti a 5, 15, 30, 45 min e a 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 36 h e posti in tubi eparinizzati. I campioni sono stati centrifugati alla velocità di 1000 g per un tempo di 15 min al fine di ottenere la separazione del plasma.

Il plasma ottenuto è stato prelevato e messo in eppendorf e successivamente riposto nel congelatore alla temperatura di -70 °C, per la conservazione dei campioni e analizzati 15 giorni dopo il collezionamento.

3.8.1.1.Analisi dei campioni di plasma

L'analisi dei campioni di coniglio è stata eseguita con la stessa procedura della metodica di estrazione riportata al par. 3.3.1. dopo aver rivalidato brevemente il metodo per questa specie animale.

3.8.1.2.Integrazione dei dati

L'integrazione dei dati è avvenuta con la stessa procedura eseguita per lo studio nei cani (par. 3.6.2.).

3.8.2.Studio farmacodinamico

Contemporaneamente allo studio di farmacocinetica, è stato effettuato uno studio farmacodinamico del grapiprant nei conigli.

La strumentazione utilizzata per questo studio comprende lo strumento Plantar Antinociception Device che consiste di una base con quattro sostegni che sorreggono una lastra di plexiglas. Tra la lastra di plexiglas e la base è inserito un cilindro che è un generatore mobile manuale di raggi infrarossi (40 °C). Sulla base superiore di questo cilindro è disegnato un mirino con al centro la fonte dei raggi infrarossi che è il punto esatto da posizionare sotto

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la zampa del coniglio. Per attivare i raggi basta premere un pulsante posizionato sulla parete laterale del cilindro. Questo cilindro è collegato ad un detector che registra il tempo che intercorre tra l'attivazione dei raggi infrarossi e il momento in cui l'animale toglie la zampa dalla fonte di calore. La macchina è stata settata per raggiungere un massimo di 22.5 sec (tempo di cut-off): se entro questo tempo il coniglio non toglie la zampa, il flusso di raggi infrarossi si interrompe automaticamente; questo per evitare gravi danni tissutali alla zampa dell'animale.

Inizialmente, prima di provocare l'infiammazione, ogni coniglio è stato sottoposto a questa procedura per determinare la linea di base del thermal withdrawal latency (TWL) (in accordo con il metodo descritto da Ren & Dubner (1999)) facendo per ognuno tre misurazioni a distanza di 1 min ciascuna (Dong et al., 2008).

Dopo 3 h dall'iniezione di carragenina e prima della somministrazione di farmaci o etanolo sono state fatte per ogni coniglio tre misurazioni a distanza di 1 min ciascuna: queste misurazioni hanno determinato il tempo 0 dello studio. Successivamente le misurazioni sono state fatte a 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 10, 24 h dopo i trattamenti. Nella seconda fase dello studio cross-over i conigli sono stati ruotati e l'intera procedura farmacodinamica è stata ripetuta sulla zampa controlaterale.

L'effetto termico antinocicettivo è espresso come la percentuale della risposta massima possibile (% MPR) (Harris & Pierson, 1964), che viene calcolata con la seguente equazione:

% MPR= [(Ttest – Tcon)/(Tcut – Tcon)] x 100

dove: Ttest rappresenta il valore di TWL dopo l'iniezione di grapiprant o meloxicam; Tcon è il

valore di TWL dopo l'iniezione di etanolo puro o al 15%; Tcut è il tempo di cut-off (22.5 sec).

3.8.2.1.Analisi statistica

Per verificare la distribuzione dei dati è stato usato il test di Kolmogorov-Smirnov. I dati farmacodinamici sono stati valutati usando l'ANOVA a due vie per determinare delle differenze statisticamente significative tra il trattamento e i valori di controllo (cross-over). Dato che i due gruppi di controllo non erano statisticamente differenti, sono stati messi insieme per determinare un solo gruppo di controllo di 12 animali. Tutte le analisi sono state condotte utilizzando GraphPad InStat (GraphPad Software).

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