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Riassunto
Il melanoma è un tumore maligno che si origina dai melanociti ed è caratterizzato da quattro stadi di sviluppo. I primi due sono facilmente curabili attraverso asportazione chirurgica, mentre, ad oggi, non esiste un trattamento efficace per curare gli stadi più avanzati.
BRAF è una chinasi appartenente al pathway MAPK/ERK, il quale ha la funzione di regolare la proliferazione cellulare. Circa il 60% dei melanomi contiene una mutazione della proteina BRAF nella posizione 600. Tale mutazione porta a un’iperattivazione del pathway MAPK e, di conseguenza, a una crescita cellulare incontrollata.
Il Vemurafenib è un farmaco approvato nel 2011 per il trattamento del melanoma metastatico. Inibitore target-specifico, il Vemurafenib si lega al sito di legame dell’ATP sulla proteina BRAF mutata (V600E). A seguito di questo legame, BRAFV600E non è più in grado di fosforilare MEK, chinasi a valle di BRAF nel pathway MAPK, e la proliferazione cellulare viene bloccata. Nonostante sia il più efficace trai farmaci attualmente a disposizione, il limite maggiore nell’utilizzo del Vemurafenib è che, dopo circa sei mesi di trattamento, tutti i pazienti che inizialmente rispondono mostrano nuovamente segni di progressione tumorale, fenomeno definito come resistenza acquisita al Vemurafenib.
Il mio lavoro di tesi rientra nell’ambito di una linea di ricerca volta a studiare la regolazione dell’espressione di BRAF, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici da affiancare al Vemurafenib. In particolare, ho messo a punto un sistema modello che permetterà di identificare se e come BRAFV600E è regolato dai microRNA, piccole molecole di RNA a singolo filamento che agiscono come repressori post-trascrizionali legandosi al 3’UTR o all’open reading frame (ORF) di geni target. Tale sistema modello si basa sull’utilizzo di due plasmidi: il plasmide pMS2 esprime MS2 Binding Sites, strutture di RNA a forma di hairpin a valle delle quali è clonato il frammento di interesse; il plasmide pMS2-BP esprime la MS2 Binding Protein, in grado di riconoscere e legare gli MS2 Binding Sites. A seguito della co-trasfezione di questi due plasmidi, nell’ambiente cellulare si crea un
2 complesso MS2 Binding Protein - MS2 Binding Sites/mRNA d’interesse, al quale si legano i microRNA. Estraendo l’RNA dalle cellule trasfettate ed eseguendo un pull down (immunoprecipitazione) seguito da RNA-Sequencing è quindi possibile identificare i microRNA fisicamente legati all’mRNA di interesse.
Nella prima parte della tesi, ho definito la lunghezza del 3’UTR di BRAFV600E nella linea parentale A375. Utilizzando la tecnica 3’ RACE, ho individuato due isoforme più abbondanti: una già nota e lunga circa 118nt, l'altra predetta come “variante trascrizionale X1” e lunga circa 1240nt.
Dalla letteratura è noto che uno dei meccanismi di resistenza al Vemurafenib è rappresentato dalla presenza di varianti di splicing che privano BRAF ORF del RAS binding domain, favoriscono la sua dimerizzazione e lo rendono insensibile all’azione del farmaco. Per ottenere tali varianti di splicing, nella seconda parte della tesi ho contribuito a caratterizzare 16 linee resistenti (8 cloni e 8 popolazioni) ottenute a partire da quattro linee cellulari di melanoma metastatico recanti la mutazione BRAFV600E e sensibili al Vemurafenib (A375, 501 Mel, 5 e SK-Mel-28). Ho confermato la refrattarietà di queste linee al farmaco attraverso saggi cellulari (ciclo cellulare, curva di crescita, colony efficiency e soft agar). Molteplici saggi molecolari (analisi di mutazioni genomiche e dell’espressione di specifici geni) mi hanno altresì permesso di identificare i meccanismi molecolari alla base di tale refrattarietà. In particolare, in tre cloni (A375C1, -C2 e -C3) e due popolazioni resistenti (A375-P1, 501-P1) ho individuato 3 varianti di splicing diverse: Δ[2-10], Δ[3-8], Δ[3-10].
Infine, nell’ultima parte della tesi, ho proceduto con il clonaggio dei due diversi 3’UTR identificati, della ORF full length e della variante di splicing Δ[3-10] (rappresentativa delle varianti da noi individuate) nel plasmide pMS2. Tali plasmidi saranno utilizzati per eseguire il saggio del pull-down e quindi per identificare i microRNA che sono fisicamente legati ai due diversi 3’UTR e alle due ORF individuate. Si potrà quindi procedere con lo studio degli effetti che questa regolazione post-trascrizionale differenziale ha sulla sensibilità al Vemurafenib.
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Abstract
Melanoma is a malignant tumor that originates from melanocytes and is characterized by four stages of development. The first two are easily treated by surgical excision, whereas there is no effective treatment for more advanced stages.
BRAF is a kinase belonging to the MAPK/ERK pathway, which has the function to regulate cell proliferation. About 60% of melanomas contain a mutation in the BRAF protein at the codon 600. This mutation leads to the hyperactivation of the MAPK pathway and, accordingly, to uncontrolled cell growth.
Vemurafenib is a drug approved in 2011 for the treatment of metastatic melanoma patients. It is a target-specific inhibitor that binds to the ATP-binding site on BRAF(V600E). Following this ATP-binding, BRAFV600E is no longer able to phosphorylate MEK, its downstream target in the MAPK pathway, and cell proliferation is blocked. Although more effective than all the other drugs currently available, the main limitation associated with the use of Vemurafenib is that, after about six months of treatment, all patients who initially respond show signs of tumor progression. This phenomenon is generally referred to as acquired resistance to Vemurafenib.
My work belongs to a line of research focused on studying the regulation of the expression of BRAF, in order to identify new therapeutic targets to be used in combination with Vemurafenib. In particular, we have developed a model system that will be used to study whether and how BRAF V600E is regulated by microRNAs, which are small single-stranded RNA molecules that act as post-transcriptional repressors by binding to the 3'UTR or to the open reading frame (ORF) of target genes. This model system is based on the use of two vectors: the pMS2 vector expresses MS2 Binding Sites (hairpin RNA structures), downstream of which the fragment of interest is cloned; the pMS2-BP vector expresses the MS2 Binding Protein, able to recognize and bind to the MS2 Binding Sites. Following the co-transfection of these two vectors, in the cellular environment a RNA/protein complex is formed. Such a complex, composed of the MS2 Binding Protein and the MS2
4 Binding Sites - mRNA of interest, is bound by microRNAs. Therefore, by extracting RNA from transfected cells and performing a Pull-Down Assay (immunoprecipitation) followed by RNA-Sequencing, it is possible to identify the microRNAs physically bound to the mRNA of interest.
In the first part of this work, I have defined the length of the 3'UTR of BRAF V600E in the parental cell line A375. Using the 3'RACE, I identified two most abundant isoforms, one about 120nt long and already known, the other predicted as "transcriptional variant X1” and about 1240nt long.
From the literature it is known that one of the mechanisms of resistance to Vemurafenib is represented by splicing variants that deprive BRAF ORF of the RAS binding domain, promote its dimerization and make it insensitive to the action of the drug. In order to obtain such splicing variants, in the second part of the thesis I helped to characterize 16 resistant lines (8 clones and 8 populations) derived from four metastatic melanoma cell lines bearing the BRAF V600E mutation and sensitive to Vemurafenib (A375, 501 Mel, SK-Mel -5 and SK-Mel-28). I confirmed the refractoriness of these lines to the drug through cell-based assays (cell cycle, growth curve, soft agar and colony efficiency). Furthermore, the use of multiple molecular assays (analysis of genomic mutations and expression of specific genes), allowed me to identify the molecular mechanisms underlying this refractoriness. Specifically, in three resistant clones (A375-C1, -C2 and-C3) and two resistant populations (A375-P1, 501Mel-P1) I identified 3 different splicing variants: Δ[2-10], Δ[3-8] and Δ[3-10].
Finally, in the last part of my thesis, I cloned the two different 3'UTR that I have identified, the full-length ORF and the Δ[3-10] splicing variant (taken as representative of the variants identified by us) into the pMS2 plasmid. These vectors will be used to perform the pull-down assay and hence to identify the microRNAs that are physically bound to the different UTRs and the different ORFs of BRAFV600E. Future studies will be aimed at the understanding of the effects of such differential post-transcriptional regulation on the sensitivity to Vemurafenib.
