Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Farmacia
CORSO DI LAUREA MAGISTRALE
IN
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Tesi di Laurea
“Studio PK/PD e residuale della levofloxacina nel pollo.
”
Anno Accademico 2016/2017
Relatore:
Prof. Mario GIORGI
Correlatore:
Prof.ssa Maria Cristina BRESCHI
Candidata:
Abstract ……… 5
Riassunto ………. 6
1. INTRODUZIONE ………...7
1.1 CHINOLONI E FLUOROCHINOLONI………..8
1.2 CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE………10
1.3 RELAZIONE STRUTTURA ATTIVITA’……….11
1.4 MECCANISMO D’AZIONE………..12
1.4.1 INTERAZIONE TRA IL DNA ED I FLUOROCHINOLONI………..13
1.5 SPETTRO D’AZIONE………14 1.6 EFFETTI TOSSICI………15 1.7 FARMACOCINETICA………..15 1.8 FARMACODINAMICA………15 1.8.1 PARAMETRI DI PK E PD………..16 1.8.2 RESISTENZA ANTIMICROBICA………17 1.9 USO CLINICO………..19 1.10 LEVOFLOXACINA……….22 1.10.1 POLLI ……….24
2. SCOPO DELLA TESI………26
3. MATERIALI E METODI……….27
3.1 PRODOTTI CHIMICI E REAGENTI………..28
3.2 FASE DI SPERIMENTAZIONE ANIMALE……….28
3.3PREPARAZIONE DI SOLUZIONI………30
3.4 STRUMENTZIONE E CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE………...31
3.5 PREPARAZIONI DEI CAMPIONI ………..31
3.5.1 ESTRAZIONE DAL PLASMA………..32
3.5.2 ESTRAZIONI ORGANI………32
3.6 QUANTIFICAZIONE……….33
3.7 ANALISI FARMACOCINETICA………34
3.8 LEGAME CON LE PROTEINE DEL SIERO ………34
SIERO………35
3.9.2 KILLING CURVE IN VITRO ……….37
3.9.3 KILLING CURVES EX VIVO………..37
3.10 INTEGRAZIONE PK/PD E DETERMINAZIONE DELLA DOSE OTTIMALE……..38
3.11 ANALISI STATISTICA………39
4. RISULTATI………40
4.1 DETERMINAZIONE MIC e MBC ………..41
4.2 FARMACOCINETICA DELLA LEVOFLOXACINA………..42
4.3. DISTRIBUZIONE DI LEVOFLOXACINA NEI TESSUTI ……….44
4.4 LEGAME ALLE PROTEINE DEL SIERO………..44
4.5 KILLING CURVES IN VITRO……….45
4.6 KILLING CURVES EX VIVO ………..46
4.7 INTEGRAZIONE PK/PD……….46
4.8 MODELLAZIONE PK / PD E DETERMINAZIONE DELLA DOSE OTTIMALE………..47
5. DISCUSSIONE ………..49
6. CONCLUSIONI………..54
dosage in the target animals is increasingly being recognized as vital for maximizing efficacy and minimizing the risk of resistance, so this study aimed to evaluate the pharmacokinetics/pharmacodynamics (PK/PD) of levofloxacin in broilers. Using a parallel study design, each group of animals (n = 20) received 5 mg/kg of levofloxacin intravenously (IV) and orally (PO). Plasma, serum and tissues were collected for PK and PD studies. Plasma concentrations of levofloxacin were determined by HPLC. Minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were determined against E. coli, isolated in clinical broilers. Ex vivo antibacterial activity was evaluated using the time killing method. Mean values of terminal half-life for IV and PO groups were 6,93 and 8,09 h, respectively. Following oral administration, the peak plasma concentration was achieved at 0,88 h (Tmax). Mean value of oral bioavailability
was 123,25%. Levofloxacin residues were found in all the tissues tested (muscle, liver, kidney and lung). Plasma concentration above 8 × MIC lead to eradication of E. coli (incubation period of 24 h). The results of ex vivo growth inhibition curves were consistent with the in vitro time-kill study.
Levofloxacin showed dependent plasma concentration antibacterial activity against a clinical isolate of E. coli. According to the assessment of PK/PD relationship, administration of 5 mg/kg of levofloxacin seems to be effective in killing E. coli. Also, simulated optimal dose based on the ex vivo PK/PD approach was 2,9 mg/kg/day (bactericidal) to 4,3 mg/kg/day (eradication) PO against E. coli (MIC90 = 0,125 μg/mL).
determinazione del dosaggio ottimale negli animali viene sempre più riconosciuta come vitale per massimizzare l'efficacia e minimizzare il rischio di resistenza. Questo studio ha il compito di valutare la farmacocinetica / farmacodinamica (PK/PD) della levofloxacina nei polli da carne. La ricerca è stata eseguita utilizzando un disegno di studio parallelo. Ogni gruppo di animali (n = 20) ha ricevuto 5 mg / kg di levofloxacina, sia per via endovenosa (IV) e che per via orale (PO). Plasma, siero e tessuti sono stati raccolti per gli studi PK e PD. Le concentrazioni plasmatiche di levofloxacina sono state determinate mediante HPLC. La concentrazione minima inibitoria (MIC) e la minima concentrazione battericida (MBC) sono state determinate per l’E. coli, sia in brodo che in siero ottenuto da polli sani grazie al metodo della microdiluizione. L'attività antibatterica ex vivo è stata valutata usando il metodo delle killing curves. I valori medi di emivita per la levofloxacina per i gruppi IV e PO sono stati rispettivamente, 6,93 e 8,09 h. Dopo la somministrazione orale, la concentrazione plasmatica è stata raggiunta a 0,88 h (Tmax). Il valore medio della biodisponibilità orale è stato del 123,25%. I residui di
levofloxacina sono stati trovati in tutti i tessuti testati (muscolo, fegato, rene e polmone). Inoltre, i risultati della PD indicano che, se la concentrazione plasmatica è superiore a 8 × MIC, si ottiene l'eradicazione di E. coli (nel periodo di incubazione di 24 h). I risultati delle curve di inibizione della crescita ex vivo sono stati coerenti con lo studio in vitro. La levofloxacina ha mostrato un'attività antibatterica di tipo concentrazione – dipendente. Secondo la valutazione PK/PD, la somministrazione di 5 mg/kg di levofloxacina sembra essere efficace contro E. coli. Inoltre, la dose ottimale simulata, basata sull'approccio PK/PD ex vivo, è stata pari a 2,9 mg/kg/die (effetto di tipo battericida) e a 4,3 mg/kg/die (eradicazione) contro E. coli (MIC90 = 0,125 μg / mL)
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8 N Cl N N CH3 CH3 N O O O C2H5 C H3 N R R 1. INTRODUZIONE 1.1 CHINOLONI E FLUOROCHINOLONI
Figura 1. Struttura chimica base dei fluorochinoloni
I chinoloni (figura 1) appartengono ad una classe di farmaci di sintesi, chemioterapici antibatterici in continua evoluzione. La struttura fondamentale della maggior parte di essi è rappresentata dall’anello 4-ossichinolinico o da quello naftiridinico (figura 2) (Bassetti, 2001).
DERIVATI 4-OSSICHINOLINICI & DERIVATI NAFTIRIDINICI
N N O F C H3 O CH3 O-O N Acido oxolinico Ciprofloxacina Ofloxacina Norfloxacina
Il capostipite di questa famiglia è l’acido nalidissico, sintetizzato nel 1962 partendo dall’anello naftiridin-carbossilico. Ad esso hanno fatto seguito altri farmaci (acido
Acido nalidissico Acido pipemidico Acido piromidico
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ossolinico, acido piromidico) con caratteristiche praticamente sovrapponibili. Questi ultimi hanno un impiego limitato alle infezioni del tratto urinario perché non sono in grado di raggiungere concentrazioni plasmatiche efficaci. Successive modifiche alla struttura molecolare dell’acido nalidissico ne hanno allargato lo spettro di attività antibiotica e modificato la farmacocinetica (Blondeau, 2004).
Attualmente sono in commercio quattro generazione di chinoloni:
I generazione: la prima generazione comprende l’acido nalidissico (struttura naftiridinica), l’acido ossolinico (nucleo chinolinico), la cinossacina (nucleo cinnolinico) e l’acido piromidico. Questi hanno un attività contro i batteri gram-negativi non particolarmente resistenti, usati soprattutto come antisettici delle vie urinarie.
II generazione: la seconda generazione ha come rappresentate l’acido pipemidico. Questi composti sono attivi contro gram positivi e negativi, in particolare risultano vantaggiosi rispetto alla generazione precedente in quanto sono attivi contro Pseudomonas aeruginosa, principale responsabile delle infezioni urinarie (Bassetti, 2001).
III generzione: Questi composti presentano un atomo di fluoro in posizione 6 (fluorochinoloni). Essi presentano una buona biodisponibilità per via orale, un ampio spettro d’azione, il quale comprende sia batteri gram positivi che negativi e inoltre risultano attivi contro Chlamydia e Micoplasmi (Choma et al., 2004). I fluorochinoloni hanno una elevata capacità di diffusione tissutale nella prostata, nelle vie urinarie, nel tessuto osseo, nei polmoni, nella bile e nei tessuti molli. Inoltre possiedono una capacità notevole di penetrazione endocellulare (Bassetti, 2001).
IV generazione: Questa classe di farmaci è caratterizzata da una migliore attività nei confronti di batteri gram-positivi, come pneumococchi betalattamino-resistenti e nei confronti di batteri che sfuggono all’attività dei betalattamici perché a localizzazione endocellulare e perché privi di parete cellulare (Bassetti, 2001). Possiedono una elevata biodisponibilità e un tempo di emivita lungo.
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A prescindere dal tipo di classificazione, tutti i chinoloni e i fluorochinoloni hanno in comune:
Identica modalità d’azione;
Resistenza batterica di tipo esclusivamente cromosomico; Alcuni effetti indesiderati: fototossicità, neurotossicità e
tossicità cartilaginea, vomito e diarrea (Neuman, 1987).
Recentemente i fluorochinoloni sono usati in medicina veterinaria includono enrofloxacina, difloxacina, orbifloxacina e marbofloxacna.
Il successo dei fluorochinoloni può essere riassunto così: A. Possiedono un ampio spettro d’azione
B. Possono essere somministrati sia per via orale che per via sistemica, rimanendo comunque efficaci
C. Non presentano costi elevati
D. Le ultime generazioni di fluorochinoloni rientrano nei protocolli di cura nei casi di patologie respiratorie, in particolare in alcune forme di polmonite batterica.
E. Ad oggi sono largamente usati anche in ambito veterinario in quanto possiedono una elevata attività battericida, sono ben tollerati e possono essere somministrati attraverso varie vie (intramuscolo, topica, orale, endovenosa e subcutanea)
1.2 CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE
I chinoloni sono molecole anfotere che possono essere protonate sia sulla pozione carbossilica che su quella amminica terziaria. I valori di pKa variano leggermente a
seconda del composto fluochinolonico in esame, ma generalmente il pKa del gruppo
carbossilico varia tra 6.0-6.5, mentre il pKa per l’azoto del gruppo piperazinico varia tra
7.5-8 (Papich & River, 2009). A pH fisiologico, i fluorochinoloni esistono come zwitterioni, data la presenza sia del gruppo carbossilico che di quello amminico. Al punto isoelettrico (il quale si trova vicino ai valori di pH fisiologico) i fluorochinoloni sono molto più lipofili.
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Figura 3. Relazione struttura attività del fluorochinolone
1.3 RELAZIONE STRUTTURA ATTIVITA’
Esaminando la struttura base del chinolone, possiamo prevedere che la sua attività possa essere divisa in cinque zone (figura 4).
Gli elementi indispensabili sono:
Il gruppo carbossilico in posizione 3 e il gruppo chetonico in posizione 4 sono necessari per l’attività antibatterica.
Il fluoro in posizione 6 identifica in modo caratteristico la classe dei fluorochinoloni, migliorando notevolmente l’attività antibatterica sia in termini di potenza che di penetrazione cellulare.
In posizione 1, la sostituzione sull’N con un etile, o un ciclopropile, o un fluorofenile, portano ad uno spetro d’azione più ampio.
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Addizionando in posizione 7 una piperazina, aumenta l’attività contro tutti i batteri gram negativi. Questa posizione si pensa sia coinvolta nel meccanismo d’azione con la DNA-girasi.
Inoltre la sostituzione in posizione 8, così come in posizione 5, influenza la configurazione sterica della molecola chinolonica e i cambi apportati alterano l’accesso del chinolone alla tasca dell’enzima o ai siti di legame sul DNA. Inoltre la presenza del carbonio al posto di un N (in posizione 8), è importante per limitare gli effetti collaterali a livello del sistema nervoso centrale e aumentare l’attività contro gli stafilococchi (Papich & River, 2009).
1.4 MECCANISMO D’AZIONE
I chinoloni e i fluorochinoloni svolgono un’attività battericida, attraverso l’inibizione della replicazione e della trascrizione del DNA batterico. In particolare attraverso l’inibizione degli enzimi topoisomerasi IV e DNA-girasi (figura 4).
Entrambi questi enzimi sono topoisomerasi di tipo II e catalizzano la rottura di tutti e due i filamenti di DNA, fanno passare attraverso la rottura un segmento di DNA intatto e riattaccano le estremità tagliate, usando come fonte di energia l’ATP. La DNA girasi facilita i cambiamenti conformazionali del DNA durante la replicazione, mentre la topoisomerasi IV interviene nella decatenazione delle molecole figlie dopo la replicazione del DNA.
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Si pensa che i fluorochinoloni (figura 5) interagiscano con il complesso formato da enzima e DNA per indurre cambi conformazionali che inibiscono l’attività di questi enzimi e di conseguenza bloccano la forcella di replicazione e quindi la normale sintesi del DNA batterico, portando alla rapida morte delle cellule batteriche. La girasi e la topoisomerasi IV sono enzimi che mancano nelle cellule umane, mentre sono essenziali nelle cellule batteriche. La DNA girasi è il primo enzima bersaglio dei fluorochinoloni nei gram-negativi, mentre la topoisomenrasi IV lo è nei batteri gram-positivi. (Bassetti, 2001)
1.4.1 INTERAZIONE TRA IL DNA ED I FLUOROCHINOLONI
Il sito esatto ed il modo di interagire tra il DNA e i chinoloni non è chiaro. Si sa che due molecole di chinolone si inseriscono tra le basi del DNA nel sito attivo della girasi, dove il DNA è distorto. Due sono le possibilità:
a) Il fluorochinolone si può intercalare tra le basi su entrambi i lati della doppia elica (figura 6a).
b) Il chinolone può mettersi al posto della citosina e formare legami a idrogeno con la guanina sul filamento opposto (figura 6b). In questa interazione è essenziale la presenza del Mg+ che interagisce da una parte con i gruppi carbossilico e
carbonilico delle posizioni 3 e 4 dei chinoloni, e dall’altra con il gruppo fosfodiesterico del DNA.
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.
Figura 6a. Ipotesi di interazione DNA –chinolone
1.5 SPETTRO D’AZIONE
I fluorochinoloni sono dotati di ampio spettro d’azione, comprendente le specie batteriche aerobie gram-negative (anche le Pseudomondaceae) e i cocchi gram-positivi. I fluorochinoloni di oggi sono impiegati per sostituire i classici beta lattamici. Tuttavia ci sono alcuni fattori che ne possono influenzare l’attività:
a. La presenza di cationi al sito di infezione b. Il pH acido
La presenza di cationi quali Al, Mg, Fe e Ca, si possono legare al gruppo carbossilico, il quale non trovandosi in forma anionica non risulta attivo. Il pH acido invece, può far aumentare la MIC (minima concentrazione inibente), soprattutto per composti che hanno in posizione 7 una piperazina.
1.6 EFFETTI TOSSICI
I chinoloni e i fluorochinoloni sono di norma ben tollerati (Lispley e Baker, 1999). Generalmente le reazioni avverse più comuni coinvolgono il tratto gastrointestinale come vomito e nausea. Si possono presentare anche reazioni allergiche cutanee e reazioni di fotosensibilità (Neuman, 1987). Alcuni di questi composti, a causa della loro struttura chimica possono interagire con ioni metallici come Fe, Al, Ca, Mg, e possono interferire con la farmacocinetica di altri farmaci che vengono metabolizzati dal
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citocromo P-450. Trattamenti prolungati, e dosi elevate, determinano tossicità cartilaginea, mialgia e artralgia. Tradizionalmente, per questo motivo, l’impiego dei chinoloni nei bambini è controindicato (Goodman & Gilman, 2003).
1.7 FARMACOCINETICA
I fluorochinoloni sono ben assorbiti per via orale, sottocutanea e intramuscolare, con una buona biodisponibilità. In alcuni casi, ci sono fattori che possono rallentare l’assorbimento, come per esempio il cibo e il legame con le proteine plasmatiche. Sono ampiamente distribuiti nei fluidi e nei tessuti corporei (Gasco et al., 2015). La distribuzione dei fluorochinoloni è elevata e le maggiori concentrazioni si ritrovano nel rene e nel fegato. Questo è dovuto al fatto che i fluorochinoloni sono altamente lipofili e quindi passano bene le membrane cellulari e non vengono facilmente espulsi all’esterno. Inoltre hanno la capacità di concentrarsi maggiormente nei leucociti, permettendo loro di essere trasportati fino al sito di infezione, e per questo agiscono maggiormente sui tessuti infettati piuttosto che su quelli sani (Papich & Riviere, 2009). I metaboliti principali sono derivati idrossilati: quelli prodotti a livello epatico, sono più idrosolubile e quindi eliminabili con facilità, mentre i derivati 3-carbossilati sono prodotti a livello renale. Questo tipo di metabolismo da origine a prodotti ancora attivi. La via di eliminazione principale è quella renale, la quale avviene per secrezione tubulare. Si verifica così un recupero urinario nelle 24 h che varia a seconda delle molecole, da un minimo 20-30% della norfloxacina ad un 85% massimo della levofloxacina. I fluorochinoloni e i loro metaboliti possono anche essere eliminati tramite la via biliare (Rossi et al., 2011).
1.8 FARMACODINAMICA
La farmacodinamica descrive la capacità dell’antibiotico di combattere i microrganismi attraverso il valore della MIC, parametro che descrive la minima concentrazione di farmaco capace di inibire la crescita di microrganismi.
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Gli indci PK/PD sono rappresentato in figura 7. Allo stato attuale gli antibiotici si possono suddividere in 2 gruppi.
Al primo gruppo appartengono i farmaci tempo-dipendenti e il parametro a cui si fa riferimento è T>MIC, espresso come percentuale del tempo durante il quale l’antibiotico permane nel sangue a concentrazioni superiori alla MIC. Questi antibiotici hanno bisogno di tempo per ottenere la risoluzione dell’infezione. Antibiotici di questo tipo sono rappresentati ad esempio da betalattamine, penicilline e cefalosporine, il cui meccanismo d’azione si basa su un’attività di distruzione nei confronti della parete batterica.
Al secondo gruppo appartengono i farmaci dipendenti dalla concentrazione e i parametri di riferimento sono AUC/MIC e Cmax/MIC. Questo gruppo di antibiotici sono caratterizzati dal fatto che la loro attività antibatterica aumenta progressivamente con l’aumentare della concentrazione (Pea, 2011). I fluorochinoloni mostrano questo tipo di azione. Per una migliore cura clinica e una eradicazione batterica, riferito alla classe dei fluorochinoloni, il rapporto AUC/MIC contro i patogeni gram-positivi deve superare 25-30, mentre contro agenti patogeni gram-negativi il rapporto tra AUC/MIC deve superare 100-125.
Il valore di Cmax/MIC > 8-10 (Wright et al., 2000; Ahmad et al., 2016)
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1.8.2 RESISTENZA ANTIMICROBICA
Si parla di resistenze ai farmaci antimicrobici quando microrganismi quali batteri, virus, funghi o parassiti si trasformano in modo tale da rendere inefficaci i farmaci utilizzati nella cura delle infezione che essi stessi provocano. Questo fenomeno è uno dei problemi principale in medicina veterinaria, dovuto ad un uso sconsiderato degli antibiotici soprattutto, in animali da allevamento. Sono sempre più diffuse leggi a tutela dei cittadini, volte a controllare l’utilizzo di antibiotici in medicina veterinaria (Rossi et al., 2011).
Fra i fattori che possono favorire la comparsa di fenomeni di resistenza sono:
Gli errori di posologia (dosi troppo basse, durata del trattamento insufficiente o troppo prolungato)
La durata dell’esposizione al trattamento Il sito di somministrazione
Le caratteristiche farmacocinetiche degli antibiotici
La resistenza più frequentemente sviluppata per i fluorochinoloni è legata alla modificazione della struttura bersaglio, ossia la mutazione del gene gyrA, il quale codifica per la subunità A della DNA – girasi, che porta come conseguenza alla trascrizione di una subunità diversa che non viene riconosciuta dal fluorochinolone. Un'altra forma di resistenza riguarda la mutazione del gene parC (responsabile della rottura del DNA) della Topoisomerasi IV. Questo tipo di alterazione è diffuso nei batteri Gram positivi (Rossi et al., 2011).
Un ulteriore meccanismo di resistenza è quello legata all’alterazione della permeabilità della membrana esterna. Ciò comporta per la cellula batterica, una resistenza crociata con altri antibiotici che utilizzano canali porinici per entrare nello spazio periplasmico. Questo meccanismo è tipico di alcuni ceppi Gram negativi (Rossi et al., 2011).
Per valutare meglio questo fenomeno di resistenza/sensibilità agli agenti antimicrobici, bisogna considerare oltre alla MIC anche un nuovo parametro, MPC ovvero Mutant
Prevention Concentration che corrisponde alla concentrazione minima di farmaco che
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eliminati. Naturalmente la MPC è sempre sopra la MIC. Tra le due soglie, MIC e MPC, troviamo un intervallo chiamato “finestra di selezione” ovvero, MSW, Mutant Selection
Window. In questa finestra troviamo i potenziali batteri che possono indurre
farmacoresistenza (Rossi et al. 2011).
La concentrazione del farmaco somministrato dovrà dunque rimanere il meno possibile in questo intervallo ed arrivare a superare la soglia della MPC per ottenere una buona terapia con ottimi risultati. La strategia migliore sembrerebbe al momento la somministrazione di diversi antibiotici ad alto dosaggio, con trattamenti di breve durata (Canton et al. 2006). La figura 8 mostra appunto, tre diverse situazioni in cui l’antibiotico viene somministrato. Le curve rappresentano la farmacocinetica (concentrazione vs tempo) di un agente antimicrobico e i riquadri rappresentano la popolazione batterica:
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A. La curva farmacocinetica è al di sotto della MIC: non è prevista nessuna selezione di una sottopopolazione mutante resistente all’interno della popolazione wild – type.
B. La curva farmacocinetica è all’interno della MSW: pertanto la sottopopolazione può essere selezionabile.
C. La curva farmacocinetica supera MPC: i batteri sono inibiti e viene potenzialmente evitata la selezione di una sottopopolazione mutante resistente.
1.8.3 STRETEGIE PER RIDURRE LO SVILUPPO DELLA RESISTENZA ANTIMICROBICA
Esistono due strategie per restringere la finestra di selezione mutante. La prima strategia è quella di ridurre al minimo il tempo in cui la concentrazione del farmaco si trova nella finestra di selezione. In linea di principio, la riduzione del tempo di selezione
del mutante può essere effettuata utilizzando composti che rapidamente passano
attraverso la finestra dopo la somministrazione della prima dose e rimangono al di sopra del MPC durante tutto il periodo di trattamento.
Il secondo modo per ridurre la finestra è quello di ridurre la differenza tra MPC e MIC. Ad esempio, il gruppo C8-metossi dei fluorochinoloni migliora l'azione batteriostatica contro i mutanti resistenti e quindi abbassa il MPC (Zhao, 2001).
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Oltre alle precedenti strategie, si sono sviluppate altre tre recenti soluzioni (figura 9):
Mantenere le concentrazioni di farmaco sopra la MPC attraverso le multi-somministrazioni (figura 9A);
Somministrare farmaci che hanno un valore di MIC e di MPC molto simili, in questo modo la finestra di selezione mutante viene ridotta drasticamente (figura
9B);
Somministrare due farmaci che hanno lo stesso valore di MIC e di MPC. In questo caso la finestra di selezione sarebbe totalmente schiacciata (figura 9C).
Figura 9. Strategie per ridurre la finestra di selezione mutante MSW. 9A, concentrazioni di farmaco sopra MPC. 9B, MIC e MPC hanno un valore molto simile. 9C, somministrazione di due farmaci con lo stesso
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Un'altra strategia recentemente sviluppata, è quella di utilizzare due farmici, in cui la concentrazione supera la MIC in tempi diversi. Questa sovrapposizione delle curve crea così la chiusura della finestra di selezione. Come si vede nella figura 10 è rappresentato l’andamento della concentrazione di due antibiotici, che scendono sotto la MIC in tempi diversi. Possiamo evincere che esistono situazioni in cui solo un composto è al di sopra della sua MIC (situazioni # 1 e # 3), con finestra MSW aperta. I mutanti sono facilmente selezionabili in queste condizioni. Solo nella situazione # 2 sono entrambi agenti superiori alle rispettive MIC e la finestra MSW è chiusa (Zhao, 2001).
Figura 10. Rappresentazione dell’uso di due antibiotici la cui concentrazione supera la MIC in tempi diversi.
In altri studi è stato osservato che, somministrando lo stesso farmaco con formulazione giornaliera (curva blu) e con formulazione a rilascio lento (curva rossa), entrambi superano il valore di MPC (figura 11). La formulazione giornaliera permane per minor tempo all’interno della finestra MSW, riducendo così la possibilità di avere resistenza batterica. Al contrario, la formulazione a lento rilascio permane più a lungo all’interno della finestra MSW formando così, fenomeni di resistenza.
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Figura 11. Somministrazione di due antibiotici diversi. Curva rossa a lungo rilascio. Curva blu, somministrazione giornaliera.
1.9 USO CLINICO
L’impiego clinico dei fluorochinoloni riguarda prevalentemente (Gasco et al., 2015): Infezioni del tratto gastrointestinale (diarrea del viaggiatore, shighellosi e
salmonellosi);
Infezioni delle alte vie respiratorie e infezione sessualmente trasmesse (gonorrea e clamidia)
Prostatiti, osteomieliti croniche, meningiti, endocarditi, sinusiti e otiti.
In ambito veterinario, come precedentemente riportato, sono stati approvati: enrofloxacina, difloxacina, orbifloxacina e marbofloxacna. Sono utilizzati in particolar modo per la cura di:
Mammiferi: i fluorochinoloni vengono utilizzati in patologie del tratto urinario, della pelle, dei tessuti molli, delle ossa e della cavità orale. Questa classe di farmaci risulta vantaggiosa perché è totalmente assorbito per via orale. Le dosi consigliate vanno da 2,5-5,0mg/kg a 10-20 mg/kg per via intramuscolo, sottocutanea o orale (Papich & Riviere, 2009).
Volatili: i fluorochinoloni sono usati per trattare i “pet-birds” che sono specie esotiche tenute in cattività negli zoo. La somministrazione si
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effettua sia per via orale che per via sistemica, in casi di infezioni da Chlamydia Psittacci e batteri gram negativi, ciò può portare a gravi danni vascolari ed epatotossicità.
Rettili e anfibi: poiché questi tipi di animali sono portatori d’infezione all’uomo (Papich, 1999).
1.10 LEVOFLOXACINA
La levofloxacina [acido-(S)-9-fluoro-2,3-diidro-3-methil-10-(4-methilpiperazin-1-il)-7-oxo-7H-pirido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazina-6-acido carbossilico] (figura 12), appartiene alla famiglia dei fluorchinoloni di terza generazione ed è stata creata isolando l’enantiomero attivo S dell’ofloxacina. Questo isolamento ha aumentato notevolmente la sua attività. Essa ha una migliorata suscettibilità contro batteri gram-positivi come
Streptococcus pneumoniae e viridans (Bassetti, 2001). Inoltre è attivo contro diverse
specie di stafilococchi, streptococchi compresi batterioidi, clostridium, haemophilus, moraxella, legionella, mycoplasma e clamidia.
L'effetto battericida della levofloxacina è ottenuto attraverso un legame reversibile con la DNA - girasi e successiva inibizione della replicazione batterica del DNA.
Levofloxacina si distribuisce bene in tutti i tessuti e nei liquidi corporei. Tuttavia, penetra male nel sistema nervoso centrale. Come tutti fluorochinoloni agisce con un meccanismo dipendente dalla concentrazione, per cui l'effetto ottimale è raggiunto dalla somministrazione di dosi elevate per un breve periodo di tempo.
Figura 12. Struttura chimica
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Il farmaco subisce un metabolismo limitato nei ratti e nell'uomo ed è principalmente escreto dal rene come farmaco attivo. I metaboliti inattivi (N- ossido e metaboliti dimetilici) rappresentano <5% della dose totale (Goudah et al., 2008). La farmacocinetica della levofloxacina è stata completamente studiata nell'uomo (Chulavatnatol et al., 1999), nei tacchini (Aboubakr et al., 2014), nelle quaglie (Aboubakr, 2012) e nei vitelli (Dumka & Srivastava, 2006, 2007).
1.10.1 POLLI
Per questo studio è stato scelto il pollo in quanto è diventato ormai la fonte alimentare più importante per il mondo; considerando che i costi di produzione sono bassi (rispetto ad esempio, al maiale), l'industria del pollame è probabilmente la più diffusa in tutto il mondo. Il pollo e le uova fanno parte del mercato globale e sono cresciuti dal 2006 al 2010 rispettivamente del 19% e del 9,52% (Annuario Statistico FAO, 2013). La produzione di pollame commerciale è molto intensa nel sistema agricolo e si stima che una casa o un fienile possa contenere 100.000 di polli da carne. Ciò significa che il controllo e la prevenzione di malattie a tutti i livelli deve essere un obiettivo principale per il veterinario del pollame. Gli agenti antimicrobici sono fondamentali nella prevenzione e nel trattamento delle malattie nella produzione di pollame. Nonostante la scienza e le politiche, dibattiti e controversie, è impossibile immaginare un'industria sostenibile del pollame senza l’uso di un antimicrobico. In questo contesto, è fondamentale capire le interrelazioni tra batteri e agenti antimicrobici, tra ospite e consumatore nella progettazione di programmi razionali di somministrazione di farmaci
(Landoni & Albarellos, 2015).
In questo studio, è stato scelto come agente antimicrobico, la levofloxacina, un fluorochinolone molto usato in medicina umana, non registrato attualmente per la medicina veterinaria. I fluorochinoloni si stanno sempre più diffondendo in medicina veterinaria, grazie proprio alla loro attività ad ampio spettro. Per tutti questi motivi, negli ultimi anni si stanno facendo studi sugli animali legati a questo farmaco (Jatin et al., 2009).
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Lo scopo di questo studio è stato quello di apportare le informazioni utili per razionalizzare l’uso degli antibiotici, in questo caso della levofloxacina.
Sono state effettuate diverse sperimentazioni. Nella prima sperimentazione è stata valutata la farmacocinetica e la distribuzione nei tessuti della levofloxacina dopo somministrazioni endovenose (IV) e orali (PO) alla dose di 5 mg / kg nei polli da carne. Inseguito si è calcolato la MIC e MBC di levofoxacina contro E. Coli in due matrici (brodo e siero). Successivamente si è valutato in vitro ed ex vivo gli effetti antibatterici della levofloxacina contro E. coli utilizzando le killig curves. Al termine di questo studio si sono calcolate le dosi ottimali corrispondenti agli effetti batteriostatici, battericidi e di eradicazione basati su AUC24h/MIC.
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3. MATERIALI E METODI
3.1 PRODOTTI CHIMICI E REAGENTI
La levofloxacina e l'enrofloxacina (quest ultimo considerato lo standard interno IS) hanno una purezza standard > 99,0% e sono state acquistate da Sigma-Aldrich (Milano, Italia).
Acetonitrile (ACN) di grado HPLC, metanolo (MeOH), triclorometano (CHCl3) e
isopropanolo (C3H8O) sono stati acquistati da Merck.
La tetraetilammina è stata acquistata da Sigma Chemical Co (Milano, Italia).
L'acido ortofosforico, l'idrogeno fosfato di sodio, sodio monoidrogenofosfato e il potassio diidrogenofosfato sono stati acquistati da Carlo Erba Reagenti (Milano, Italia). L'acqua deionizzata è stata prodotta da un sistema di acqua Milli-Q Millipore (Millipore, Milano, Italia). L'acqua e la componente organica della fase mobile, degassati sotto pressione, sono stati mescolati dalla HPLC. Le fasi mobili sono state filtrate con filtri 0,2 μm a membrana di acetato di cellulosa (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germania) con un dispositivo di filtrazione a vuoto.
3.2 FASE DI SPERIMENTAZIONE ANIMALE
Per questo studio sono stati scelti 65 polli sani (Ross 308), di 35 giorni, e aventi un peso di circa 2,2 ± 0,3 kg. Gli animali sono stati forniti da un'azienda agricola locale controllata da un veterinario che ha certificato lo stato di salute, l'assenza di trattamenti farmacologici e la presenza o meno di parassiti.
Gli animali sono stati acclimatati per 2 settimane prima dell'inizio dello studio. Durante questo periodo, i polli sono stati mantenuti liberi in una zona coperta. Sono stati effettuati controlli veterinari regolari, basati sull'esame fisico quotidiano attraverso l'osservazione del comportamento e dell'appetito; i veterinari hanno valutato che gli animali erano in buona salute.
La cura e la manipolazione degli animali sono state effettuate in conformità delle direttive del Consiglio CE 2010/63 e anche secondo le direttive istituzionali in materia di
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cura degli animali rilasciate dal Comitato per la protezione degli animali della Lettonia (autorizzazione n. 025564), che hanno approvato il progetto di studio.
Il giorno prima dell'inizio dell'esperimento, gli animali sono stati divisi in modo casuale in 4 gruppi (65 foglietti di carta contrassegnati con i numeri da 1 a 65 selezionati casualmente da una scatola): gruppi A, B e C con 20 soggetti e gruppo D con 5 soggetti. Un anello con un codice di identificazione è stato applicato alla gamba destra di ogni animale. Gli animali sono stati poi trasferiti in gabbie (4 polli/gabbia) fino alla fine dell'esperimento. L'acqua è stata fornita ad libitum. Le pratiche standard di manutenzione degli animali sono state seguite per mantenerli privi di stress.
I gruppi A, B e C hanno ricevuto levofloxacina alla dose di 5 mg/kg di peso corporeo (Levofoxacin Kabi 5 mg/mL, Fresenius Kabi, Verona, Italia) secondo un disegno di studio parallelo randomizzato.
Il gruppo D ha ricevuto una soluzione salina dello stesso volume di farmaco (gruppo di controllo).
Dopo il digiuno durante la notte, i gruppi A e B hanno ricevuto direttamente il farmaco per via orale, usando una sonda gastrica metallica di 18 gauge collegata ad una siringa da 2,5 mL.
Il gruppo C ha ricevuto il farmaco per via endovenosa attraverso la vena dell'ala destra usando una siringa da 2,5 mL e un ago da 26 gauge. Il gruppo D ha ricevuto la soluzione salina per somministrazione orale tramite lo stesso metodo riportato per la somministrazione di farmaco per via orale (gruppi A e B).
Per quanto riguarda le raccolte di sangue, i campioni sono stati raccolti (0,7 ml) e divisi in due provette, una delle quali contenente litio eparina.
I campioni di sangue sono stati raccolti dai gruppi A e C al momento 0 (prima della somministrazione del farmaco), poi a seguire 5, 30 min e 1, 4, 6, 8, 10, 24, 48 h (ore), utilizzando un catetere IV (26Gx25mm, BD Venflon, Milano, Italia) inserito nella vena dell'ala sinistra.
Dopo centrifugazione a 400 x g per 10 minuti, il plasma e il siero sono stati separati e suddivisi in due aliquote utili per analisi PK e PD. Questi campioni sono stati conservati a -20 ° C per 30 giorni dalla raccolta.
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Gli animali del gruppo B sono stati divisi in 5 sottogruppi (n = 4) e sono stati sacrificati attraverso dislocazione cervicale a 1, 6, 10, 24 e 48 h dopo la somministrazione del farmaco per le raccolte di organi.
Una porzione di muscolo pettorale, il fegato, il polmone e il rene sono stati separati da ogni carcassa, subito lavati in soluzione salina e conservati a -80 ° C fino all'analisi. Per fornire il controllo del sangue e degli organi a scopo analitico, gli animali del gruppo D (gruppo di controllo) sono stati dissanguati e gli organi raccolti a 1, 6, 10, 24 e 48 h (un animale per ogni punto).
3.3 PREPARAZIONE DI SOLUZIONI
Nella prima fase in laboratorio, sono state preparate soluzioni acquose delle sostanze madri partendo da sostanze pure di levofloxacina e dello standard interno enrofloxacina (IS) in MeOH. Entrambe sono state preparate usando matracci a concentrazione di 1000 μg/mL e sono state conservate a -20 ° C. Successivamente le soluzioni sostate diluite al fine di ottenere una concentrazione finale di 100 μg/mL per ciascuna sostanza madre. Quindi, sono state preparate appropriate diluizioni di soluzioni madre diluendo 1 mL di ciascuna soluzione a 10 mL.
La soluzione di levofloxacina è stata diluita in tubi di vetro (10 mL) per raggiungere concentrazioni finali di 5, 2 e 1 μg/mL e in seguito sono state conservate a 4 ° C. Queste ultime concentrazioni sono state quindi diluite per preparare una curva di calibrazione a 6 punti alle seguenti concentrazioni: 5, 1, 0.500, 0.250, 0,100, 0,050 μg/mL e 2, 1, 0.500, 0.250, 0,100, 0,050 μg/mL di levofloxacina, rispettivamente per il plasma e per gli organi. L'analita rimane stabile per almeno 10 settimane se conservato a 4 ° C.
3.4 STRUMENTZIONE E CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
Il sistema HPLC (High Performance Liquid Cromatography) è costituito da una pompa ad alta pressione (modello PU 980 Plus), un rilevatore spettrofluorometrico (modello 2020 Plus) e un loop di 50 μL.
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I dati sono stati elaborati utilizzando il software Borwin (Jasco Inc., Easton, Maryland, USA).
Figura 13. Sistema HPLC
L’analisi di separazione cromatografica, è basata su un metodo precedentemente descritto da Giorgi et al. (2013) con lievi modifiche ed eseguita usando una colonna analitica Gemini C18 (diametro interno 250 x 4,6 mm, particella di 5 μm, Phenomenex, Torrance, California, USA) mantenuta a 25 ° C.
La fase mobile è composta da acetonitrile e una soluzione acquosa (20:80 v/v%) ad una portata di 1 mL/min.
La soluzione acquosa è costituita da diidrogenofosfato di potassio (0,02 M) e 860 μL di tetraetilammina (0,012 M) in acqua portata a pH 4 con acido ortofosforico all’85 %. Le lunghezze d'onda di eccitazione e emissione sono state impostate rispettivamente a 295 e 490 nm. Il gain è stato settato a 1 ed l’attenuazione a 128.
3.5 PREPARAZIONI DEI CAMPIONI
La procedura di estrazione di levofloxacina dal plasma e dagli organi è stata basata su quella precedentemente riportata da Giorgi et al. (2013) con lievi modifiche.
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3.5.1 ESTRAZIONE DAL PLASMA
Si prelevano dal plasma aliquote da 0,2 mL alle quali sono stati aggiunti a 0,1 mL di IS (10 μg/mL) diluiti con 800 mL di tampone fosfato 0,1 M a pH 7,1. Si vortexa la miscela per qualche secondo. Il tampone fosfato è stato precedentemente preparato ed è composto da sodio fosfato monobasico e disodiofosfato eptaidrato.
Successivamente, si aggiungono 4 mL di miscela di triclorometano: isopropanolo (5:1 v/v). A questo punto i campioni sono stati agitati a 200 oscillazioni/min per 10 minuti e centrifugati a 4000 x g per 5 minuti. Infine, sono stati prelevati 3 mL dello strato organico e sono stati trasferiti in un tubo pulito e essiccati a 40 ° C sotto flusso di N2. Il residuo è
stato sciolto in 0,2 mL di MeOH, vortexato, e un’aliquota è stata iniettata sul sistema cromatografico.
3.5.2 ESTRAZIONI ORGANI
Il fegato, il rene, il polmone e il muscolo sono stati congelati e immediatamente sezionati in piccoli pezzi. Per ogni campione è stato prelevato 1 g di organo e collocato in tubi da 10 mL di vetro. Successivamente, sono stati aggiunti 3 mL di reagente di omogeneizzazione, composto da 0,1 M tampone di fosfato a pH 7,1. La sospensione è stata omogeneizzata utilizzando Ultra Turrax per 30 secondi. Al termine di ogni omogenizzazione sono state prelevate aliquote da 500 μL e aggiunte a 0,1 mL di IS (10 μg/mL), e vortexato il tutto per 1 minuto. Successivamente, sono state aggiunti 4 mL di una miscela di triclorometano:isopropanolo (5: 1 v/v).
Infine i campioni sono stati agitati a 200 oscillazioni/min per 10 minuti e centrifugati a 4000 x g per 5 minuti. Al termine sono stati prelevati 3 mL dello strato organico e sono stati trasferiti in un tubo pulito ed essiccati a 40 ° C sotto flusso di N2. Il residuo è stato
sciolto in 0,2 mL di MeOH, vortexato, e un’aliquota è stata iniettata sul sistema cromatografico.
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3.6 QUANTIFICAZIONE
Le curve di calibrazione sono state costruite aggiungendo una concentrazione nota di levofloxacina e di standard interno (IS) alle matrici in oggetto.
La linearità delle curve di regressione nell'intervallo 50-5000 ng/mL e 50-2000 ng/mL rispettivamente per il plasma e gli organi sono state valutate sulla base dei residui, del test di fit e del “back calculation” (entro 20% dell'importo noto).
LOD (segnale) = valore medio dei bianchi +3 volte la deviazione standard dei bianchi.
Il limite di determinazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati come concentrazioni di analitiche, dando rapporti segnale-rumore rispettivamente di 3 e di 10.
LOQ (segnale) = valore medio dei bianchi +10 volte la deviazione standard dei bianchi.
Il valore della concentrazione corrispondente al segnale misurabile sul campione a partire dal quale si può ragionevolmente cominciare a quantificare la concentrazione dello campione stesso (LOQ).
Il range lineare è stato valutato determinando l’intervallo di concentrazione nel quale il segnale varia linearmente con la concentrazione (area proporzionale alla concentrazione).
Il metodo quantitativo HPLC per il plasma e per ciascun organo è stato validato esaminando:
la ripetibilità dei risultati (intervallo ed esecuzione),
la correlazione (coefficiente di determinazione della curva standard) l'efficienza di estrazione.
La variazione intra-day ed inter-day è stata determinata effettuando analisi ripetute dei
campioni di controllo qualità (CQ). In particolare la ripetibilità del metodo è stata dimostrata confrontando i risultati derivanti dall’iniezione di tre campioni in matrice a tre concentrazioni diverse: 10 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL per un numero totale di tre volte nello stesso giorno.
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L’efficienza di estrazione (recupero) è stata determinata comparando i risultati delle tre concentrazioni in matrice con le stesse pure.
3.7 ANALISI FARMACOCINETICA
I parametri farmacocinetici per somministrazione endovenosa e orale sono stati determinati individualmente attraverso un modello non compartimentale utilizzando il software WinNonlin 5.3.1 (Pharsight, Princeton, New Jersey, USA).
La concentrazione massima (Cmax) e il tempo per raggiungere la concentrazione massima
(Tmax) sono stati determinati dai dati grezzi. La costante di eliminazione (z) è stata
stimata mediante regressione lineare semi-log della pendenza nella parte terminale e l'emivita di eliminazione (HLz) è stata stimata da ln2/z.
L'area sotto la curva plasmatica in rapporto al tempo (AUC) e l'area sotto la curva del primo momento (AUMC) sono stati calcolati da 0 all'ultima concentrazione quantificabile utilizzando un metodo trapezoidale lineare. Il tempo medio di permanenza (MRT) è stato calcolato come AUMC/AUC.
Per la somministrazione endovenosa, la clearance plasmatica totale (Cl) e il volume di distribuzione durante la fase terminale (Vd) sono stati determinati dalle equazioni:
Cl =(𝐷𝑜𝑠𝑒 (𝐼𝑉))/(𝐴𝑈𝐶 (𝐼𝑉)) Vd = 𝐶𝑙/𝐻𝐿𝜆𝑧
La biodisponibilità orale è stata calcolata come:
F = (𝐴𝑈𝐶 (𝑃𝑂))/(𝐴𝑈𝐶 (𝐼𝑉))
3.8 LEGAME CON LE PROTEINE DEL SIERO
Il metodo di ultrafiltrazione è stato utilizzato secondo il metodo di Whitlam e Kenneth (1981). Per questa fase si sono utilizzati 5 campioni di concentrazioni di levofloxacina (50, 100, 250, 500, 1000 ng/mL). Ogni esperimento è stato eseguito tre volte.
La membrana filtrante usata è il tipo EMIT (Syva Co., Palo Alto, California, USA). All’interno della provetta è stata inserita la membrana filtrante e 1 mL di siero con
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diverse concentrazioni di levofloxacina. I campioni sono stati centrifugati per 10 minuti a 2000 x g, 37 ° C.
Il volume ottenuto di ultra-filtrato contenente la levofloxacina libera è stato sottoposto ad analisi HPLC.
3.9 ISOLAMENTO ESCHERICHIA COLI
Due ceppi isolati di Escherichia coli sono stati raccolti da tamponi cloacali provenienti da polli da carne sani alloggiati in una fattoria vicino Torino (Italia), ai quali non è stato somministrato nessun trattamento farmacologico nei due mesi precedenti. I campioni sono stati coltivati su MacConkey agar (Oxoid, Milano, Italia) e incubati a 37 ° C per una notte. Le colonie batteriche sono state fermentate con lattosio e quelle risultate indolo-positive sono state valutate usando il test BBL Crystal (Becton Dickinson, Milano, Italia). Le colonie E. Coli identificate sono state coltivate in un brodo Luria-Bertani (Oxoid, Milano, Italia) contenente il 15% di glicerolo e portate a -80 ° C fino a ulteriori test. Il ceppo di E. coli 25922 di American Type Culture Collection (ATCC, Virginia, USA) è stato utilizzato come ceppo di riferimento.
3.9.1 DETERMINAZIONE DEI VALORI DI MIC e MBC NEL BRODO E NEL SIERO
La concentrazione minima inibitoria (MIC) è stata determinata nel brodo e nel siero ottenuto da polli sani utilizzando il metodo della microdiluzione secondo le linee guida Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (CLSI, 2009). I ceppi di E. coli sono stati seminati su Trypticase Soy Agar (TSA) (Oxoid, Milano, Italia) e durante la notte le colonie di crescita sono state sospese direttamente nel brodo di tipo Mueller-Hinton (MHB) (Oxoid, Milano, Italia), in modo da ottenere una torbidità comparabile con lo standard di torbidità di 0,5 McFarland.
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Figura 14. Metodo della microdiluizione per la determinazione della MIC
Successivamente, le colture sono state diluite 1: 100 con brodo per raggiungere una concentrazione finale di 106 unità di formazione della colonia (CFU)/mL. La soluzione di
levofloxacina (concentrazione finale di 64 μg/mL) è stata poi, aggiunta a MHB o al siero ottenuto dai polli da carne di controllo. Le diluizioni provenienti da questa soluzione sono state preparate in brodo e in siero per raggiungere concentrazioni che vanno da 32 μg/mL a 0,008 μg/mL e in presenza di circa 5 × 105 CFU/mL.
Le piastre sono state incubate a 37°C per 18 h e lette a 600 nm, utilizzando lo spettrofotometro Ultraspec 2000 (Pharmacia Biotech, Milano, Italia).
La MIC è stata riportata come la più bassa concentrazione di farmaco esaminato in grado di inibire la crescita batterica (figura 14). Dai pozzetti che non hanno mostrato alcun segno visibile di crescita o torbidità nella determinazione della MIC, i batteri sono stati trasferiti in piastre TSA mediante metodo a piastra di striatura. Le piastre sono state quindi incubate a 37 ° C per 24 h. La concentrazione minima che non ha mostrato alcuna crescita degli organismi sperimentati è stata considerata come la concentrazione minima battericida (MBC). MIC e MBC di levofloxacina contro E. coli ATCC 25922 sono stati determinati solo in MHB, mentre gli stessi parametri sono stati valutati per i ceppi sensibili sia in MHB che in siero. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti tre volte.
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3.9.2 KILLING CURVE IN VITRO
Venti campioni di sangue sono stati ottenuti da polli sani non trattati. I campioni di sangue sono stati raccolti prima della macellazione degli animali in una fattoria di pollame vicino a Torino (Italia).
Questi sono stati posti a temperatura ambiente per 60 minuti e poi centrifugati a 2000 x g per 10 minuti e immediatamente congelati a -20 ° C fino a ulteriori analisi.
Otto colonie incubate da 24 h in coltura TSA in un campo sensibile ai ceppi di E. coli sono stati sospesi in 9 mL di MHB (brodo) e incubati per 20 h a 37 ° C. Le soluzioni di levofloxacina predisposte nel siero (1 mL) sono state preparate alle seguenti concentrazioni: 0 μg/mL (controllo), 0,03 μg/mL, 0,06 μg/mL, 0,125 μg/mL, 0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL e 1 μg/mL. Le soluzioni precedentemente preparate sono state aggiunte in presenza di 10 μL di brodo di coltura fino al raggiungimento della concentrazione finale di 2 × 107 CFU/mL.
Per determinare i valori di CFU, sono state predisposte diluizioni seriali da 10-2 a 10-6 in
soluzione salina sterile (controllo = 10-8) e sono state incubate per 3, 6 e 24 h a 37 ° C. In
seguito, 10 μL di ciascuna diluizione sono stati inoculati su TSA e le CFU sono state contate dopo 16 h. La diluizione apprezzabile è la diluizione che dà 3 a 30 colonie per 10 μL per goccia di campione erogato (Herigstad et al., 2001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti tre volte.
3.9.3 KILLING CURVES EX VIVO
Otto-dieci colonie di E. coli sono state incubate durante la notte in TSA (come descritto sopra) e sono stati utilizzate per inoculare 9 mL di MHB e quindi successivamente incubate per una notte a 37 ° C.
A ciascun campione di siero da 0,5 mL proveniente dall’animale trattato, è stato aggiunto a 5 μL di colture batteriche stazionarie per dare una concentrazione finale di circa 3 × 107 CFU/mL.
Per determinare i valori di CFU, sono state preparate diluizioni seriali (da 10-2 a 10-6) con
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10 μL sono state portate su piastre TSA e i valori di CFU sono stati contati dopo 16 h di incubazione. La diluizione apprezzabile è la diluizione che dà 3 a 30 colonie per 10 μL per goccia di campione erogato (Herigstad et al., 2001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti tre volte.
3.10 INTEGRAZIONE PK/PD E DETERMINAZIONE DELLA DOSE OTTIMALE
Gli indici PK/PD calcolati in vivo sono Cmax/MIC e AUC24h/MIC. Il parametro PK/PD è stato
calcolato anche ex vivo è AUC24h/MIC. Questo parametro è stato ricavato utilizzando la
killing curve ex vivo e il modello inibitore sigmoidale Emax.
Il modello sigmoidale Emax segue l’equazione:
E= Emax – ((Emax – E0) x CN) / (EC50N + CN)
Emax è il log10 della differenza nella conta batterica nel campione di prova
contenente levofloxacina dopo 24 h di incubazione, quando il limite di rilevazione è stato raggiunto;
E0 è il log10 della differenza nella conta batterica tra il campione di controllo
(senza trattamento) dopo 24 h di incubazione, e la conta iniziale inoculata in campioni incubati tra il tempo 0 e 24 h;
C in questo caso corrisponde al valore AUC24h/MIC ex vivo;
N è il coefficiente Hill che descrive la pendenza della curva AUC24h/MIC ex vivo.
Questi indici PD sono stati calcolati utilizzando un software di regressione non lineare (WinNonlin, Princeton, New Jersey, USA).
L'effetto antibatterico della levofloxacina è stato quantificato dal modello Emax per tre
livelli di inibizione della crescita: batteriostatico (nessun cambiamento nel conteggio batterico dal tempo zero di controllo), effetto battericida (99,9% di riduzione della conta batterica) e eradicazione batterica (l'AUC24h/MIC ex vivo è il più basso, e ha prodotto una
riduzione nella conta batterica fino al limite di rilevazione). Quindi, i valori di AUC24h/MIC
ex vivo per gli effetti batteriostatici e battericidi sono stati i valori che hanno prodotto
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Usando la modellazione PK/PD, è stata prevista la dose orale ottimale nei polli da carne ed è stata calcolata utilizzando la seguente equazione (McKellar et al.,2004):
Dose giornaliera = Cl x AUC24h/MIC ex vivo x MIC/fu x F x 24h
dove Cl è la clearence; l’AUC24 h/MIC ex vivo è il rapporto AUC24 h/MIC ex vivo per
un'efficacia ottimale; F è la biodisponibilità; MIC è la minima concentrazione inibitoria;
fu è la frazione libera del farmaco nel plasma.
3.11 ANALISI STATISTICA
I dati PK e PD sono stati espressi come media ± SD, ad eccezione di indici PK/PD che sono stati presentati come media ± SE. Il confronto statistico dei parametri PK sono stati determinati con t-test Student ed eseguiti da Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA).
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4. RISULTATI
4.1 DETERMINAZIONE MIC e MBC
I risultati della determinazione della MIC in MHB hanno mostrato che due ceppi isolati di E. coli sono risulatati sensibili alla levofloxacina. I valori della MIC e della MBC sono riassunti nella Tabella 1. La MIC di levofloxacina in MHB e in siero sono stati rispettivamente 0,03 μg/mL e 0,06 μg/mL. I valori di MBC in MHB e siero sono stati rispettivamente 0,03 e 0,125 μg/mL. Ceppi di E. coli MIC μg/mL MBC μg/mL MHB Siero MHB Siero E. coli A sensibile 0,03 0,06 0,03 0,125 E. coli B sensibile 0,03 0,06 0,03 0,125 E. coli ATCC 25922 0,015 - 0,03 -
Tabella 1. MIC e MBC calcolati nel brodo e nel siero.
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4.2 FARMACOCINETICA DELLA LEVOFLOXACINA
Durante l'esperimento non sono stati osservati effetti avversi. In figura 15 sono riportate le curve PK dopo somministrazione IV e PO di levofloxacina a una dose di 5 mg/kg. Le concentrazioni di levofloxacina dopo somministrazione di IV e PO sono state rilevabili nel plasma fino a 24 h.
I parametri PK di levofloxacina sono presentati nella tabella 2. Dopo somministrazione orale (PO), la levofloxacina ha dimostrato un rapido assorbimento con un valore medio di Tmax di 0,88 h. I valori medi di HLλZ per IV e PO sono rispettivamente 6,93 e 8,09 h, ma
questa differenza non è statisticamente significativa. MRT è coerente tra i due gruppi. La biodisponibilità per la somministrazione PO è stata completa con un valore medio di 123,25%.
Figura 15. La curva rappresenta la media della concentrazione plasmatica vs tempo della levofloxacina dopo somministrazione IV (- ○ -) e PO (- □ -) con una dose 5 mg/kg nei polli da carne. Le barre
rappresentano l'SD. 0 5 10 15 20 25 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Time (h) P la sm a c o n ce n tr a ti o n ( n g /m L ) Co n cent ra zi on e p la sma ti ca (n g/m L) Tempo (h)
43 Parametri Unità IV PO Media SD Media SD R2 0,99 ± 0,02 0,97 ± 0,04 λZ 1/hr 0,12 ± 0,04 0,09 ± 0,02 HLλZ hr 6,93 ± 2,94 8,09 ± 1,71 Tmax hr ± / 0,88 ± 0,23 Cmax ng/mL ± / 1949 ± 382 C0 ng/mL 3543 ± 2278 / ± / AUC0-24 hr*ng/mL 12734 ± 3772 15695 ± 1464 Vss mL/kg 2881 ± 1071 / / V/Fa mL/kg 3599 ± 1335 3288 ± 659 CL/Fa mL/hr/kg 381,17 ± 90,10 282,69 ± 26,42 AUMC hr*hr*ng/mL 68569b ± 27012 108156 ± 9980 MRT hr 5,37 ± 1,31 6,90 ± 0,37 F % / ± / 123,25 ± NA
Tabella 2. Parametri farmacocinetici della levofloxacina dopo somministrazione IV e PO alla dose di 5 mg/kg in polli da carne.
aQuesto valore è diviso per F% nel gruppo PO.
44
4.3 DISTRIBUZIONE DI LEVOFLOXACINA NEI TESSUTI
I residui di levofloxacina sono stati quantificati nei tessuti esaminati fino a 48 h dopo somministrazione orale alla dose di 5 mg/kg (figura 16).
Dopo 1 h dalla somministrazione orale, le concentrazioni di levofloxacina a livello del fegato, del rene e del polmone sono risultate elevate, ad eccezione dei muscoli. La massima concentrazione nel muscolo è stata raggiunta 6 h dopo la somministrazione. Il più alto livello di levofloxacina (6,576 ± 1,741 ng/mL) è stato osservato nel fegato, a seguire nel rene, nei polmoni ed infine nei muscoli. I livelli di levofloxacina erano simili nel fegato e nei reni, e superiori a quelli del muscolo e del polmone.
4.4 LEGAME ALLE PROTEINE DEL SIERO
La levofloxacina è circa 20-30% legata alle proteine del siero. Il valore medio è stato di circa 24±5%.
Figura 16. Distribuzione tissutale della levofloxacina dopo somministrazione di PO alla dose di 5 mg/kg nei polli da carne. Le barre rappresentano la SD.
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
3000
6000
9000
Time (h)
T
is
su
e
co
n
ce
n
tr
a
ti
o
n
(
n
g
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L
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Muscle
Liver
Kidney
Lung
Muscolo Fegato Rene Polmone(ng
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Conce
nt
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zio
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su
ta
le
(
ng
/g
)
Tempo (h)
45
4.5 KILLING CURVES IN VITRO
Nella figura 17A, viene presentata l’attività batterica in vitro della levofloxacina contro
E. coli. Il numero di batteri nel campione di controllo è aumentato di ~ 5 log10 CFU/mL
dopo 24 h di incubazione. Per il trattamento sia di ½ x MIC e che di 1 x MIC, la crescita dei batteri è stata ridotta fino a 6 h, dopo di che c’è stato un leggero aumento della crescita visibile. A 2 x MIC, il numero di batteri è diminuito >3 log10 CFU/mL dopo 3 h di
esposizione, è quindi ridotto al di sotto del limite di rilevazione.
Concentrazioni che vanno da 4 a 16 x MIC hanno mostrato eradicazione batterica dopo 3 h di esposizione. 0 5 10 15 20 25 105 1010 1015 Time (h) B ac te ri al c ou n t (l og 1 0 C F U /m L ) con 1/2MIC (30) 1MIC (60) 2MIC (120) 4MIC (240) 8MIC (480) 16MIC (960) A) 0 5 10 15 20 25 104 108 1012 Time (h) B ac te ri al c ou n t (l og 1 0 C F U /m L ) con 10min 30min 1h 4h 6h 10h 24h 48h B)
Figura 17. In vitro (A) ed ex vivo (B) effetti antibatterici della levofloxacina nel siero di polli da carne contro
E. coli dopo somministrazione PO alla dose di 5 mg/kg.
Fi Fig ZB Tempo (h) Tempo (h) Co n ta b at ter ica ( log 10 CF U/m L) Co n ta b at ter ica ( log 10 CF U/m L)
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4.6 KILLING CURVES EX VIVO
L'attività antibatterica ex vivo della levofloxacina contro ceppi E. coli sensibili è stata determinata, utilizzando campioni di siero raccolti a diversi tempi (10, 30 minuti, 1, 4, 6, 10, 24 e 48 h), corrispondenti a diverse concentrazioni di levofloxacina rispettivamente a 841, 1591, 2135, 981, 651, 329, 137 e 27 ng/mL.
Nella figura 17B sono rappresentate le killing curves ex vivo. L'effetto antibatterico ex
vivo della levofloxacina è simile alla killing curves in vitro. Ciò suggerisce che una
concentrazione di levofloxacina sopra il 2 x MIC che porta all'eradicazione di E. coli dopo 24 h di incubazione. Nel campione a concentrazione plasmatica minima (48 h), il numero dei batteri è rimasto stabile a partire da 3 h di incubazione, quindi, il livello dei batteri è aumentato in quantità simile a quello del campione di controllo dopo 6 h. Tutti gli altri campioni sperimentati, che vanno da 10 min a 10 h, hanno mostrato un alto effetto battericida, che è iniziato dopo 3 h di incubazione ed è stato mantenuto per tutta la durata dell’esperimento. I campioni a 24 h hanno dimostrato efficienza dopo 6 h di incubazione fino alla fine dell'esperimento.
4.7 INTEGRAZIONE PK/PD
I valori medi di Cmax/MIC, AUC24h/MIC, Cmax/MBC e AUC24h/MBC in vivo contro E. coli
sono rappresentati nella tabella 3. Dopo somministrazione PO di levofloxacina, Cmax/MIC
e AUC24h/MIC in vivo ottenuti contro E. coli sono risultati rispettivamente 32,48 e 261,59
h. Inoltre, la media dei valori per Cmax/MBC e AUC24h/MBC in vivo sono stati
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Tabella 3. Indici di integrazione PK / PD dopo la somministrazione di PO di levofloxacina a 5 mg/kg nei polli da carne.
4.8 MODELLAZIONE PK / PD E DETERMINAZIONE DELLA DOSE OTTIMALE
Gli indici PK / PD ottenuti dal modello Emax sono presentati in tabella 4. I valori medi di
AUC24h/MIC ex vivo corrispondenti ad effetti di tipo batteriostatico, battericida e di
eradicazione hanno rispettivamente i seguenti valori 18,77, 24,02 e 36,27 h. La pendenza del modello Emax è ripida ed N (coefficiente di Hill) è pari al valore di 5,21.
Parametri Unità Media ± SD
Log10 Emax CFU/mL -6,65 ± 0,18
Log10 E0 CFU/mL 3,35 ± 0,08
Log10 Emax-E0 CFU/mL -10,01 ± 0,21
EC50 h 21,46 ± 6,94
AUC24h/MIC effetto batteriostatico h 18,77 ± 0,12
AUC24h/MIC effetto battericida h 24,02 ± 0,28
AUC24h/MIC eradicazione batterica h 36,27 ± 0,88
Slope (N) - 5,21 ± 0,83
Tabella 4. Parametri PK/PD provenienti da esperimenti ex vivo dopo somministrazione orale di levofloxacina a 5 mg/kg nei polli da carne.
Sulla base di AUC24h/MIC ex vivo ottenuto dalla modellazione PK-PD, si è potuto
determinare la dose giornaliera ottimale di levofloxacina per gli effetti di tipo
Parametri Unità Media ± SD
Cmax/MIC - 32,48 ± 6,37
AUC24h/MIC h 261,59 ± 24,41
Cmax/MBC - 15,59 ± 3,06
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batteriostatico, battericida e di eradicazione. Le dosi ottimali per effetti antibatterici, sono rappresentati in tabella 5.
Effetti previsti MIC90: 0,06 µg/mL MIC90: 0,125 µg/mL Dose per effetto batteriostatico 1,1 mg/kg 2,2 mg/kg Dose per effetto battericida 1,4 mg/kg 2,9 mg/kg
Dose per eradicazione 2,1 mg/kg 4,3 mg/kg
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5. Discussione
Lo sviluppo dell’antibiotico-resistenza negli ultimi decenni ha portato ad un uso moderato degli agenti antimicrobici, sia in medicina umana che veterinaria. Sono state osservate associazioni positive tra il consumo di antibiotici e la comparsa di resistenza dei batteri per la maggior parte delle combinazioni di farmaci presenti in commercio. Nello specifico, la World Health Organization (WHO) e la Food and Drug Administration (FDA) hanno riscontrato che una parte della resistenza batterica poteva essere causata dall’uso di antibiotici negli animali ed hanno stabilito misure preventive come restrizioni sull’uso di fluorochinoloni in medicina veterinaria, al fine di ridurre al minimo la comparsa di questi fenomeni (Blesa et al., 2012).
In questo studio è stato utilizzato un antimicrobico, la levofloxacina, che è un fluorochinolone di terza generazione. Questo farmaco è adoperato in medicina umana, ma non è registrato per la medicina veterinaria.
Secondo recenti studi autorevoli, dovrebbe essere il dosaggio appropriato a determinare, non solo l'efficacia clinica, ma anche ridurre al minimo l'emergere di resistenza per le specie animali bersaglio (Schentag, 2000; Dagan et al., 2001; Toutain et al., 2002). L'approccio PK/PD è considerato un mezzo collaudato nella progettazione di strategie di dosaggio ottimale. Inoltre, la modellazione PK/PD usando le killing curves ex
vivo ha il vantaggio di mostrare l’effetto dei parametri PD, dai quali si ricava la potenza
e l'efficacia del farmaco.
Le conoscenze sulla PK/PD della levofloxacina nel pollame sono limitate, e questo è il primo studio completo che considera PK/PD della levofloxacina nei polli da carne. Dopo la somministrazione IV e PO di levofloxacina nei polli, la media dei valori di emivita per i gruppi IV e PO sono stati rispettivamente 6,93 e 8,09 h, che sono più lunghi di quelli riportati nelle pecore (Patel et al., 2012), nei cammelli (Goudah, 2009), nelle capre (Goudah & Abo El Sooud, 2009) e nei vitelli (Kumar et al., 2012), ma più corti di quelli dei gatti (Albarellos et al., 2005). Questi dati indicano che la levofloxacina mostra una certa differenza nel tasso di eliminazione tra le specie animali. Tuttavia, questi risultati non sono coerenti con i dati riportati nello studio di Varia et al. (2009) in cui la levofloxacina è stata somministrata a 10 mg/kg nei polli da carne. Queste differenze
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possono essere attribuite a diversi fattori quali età, razza e numero di animali tra i due studi.
Il volume di distribuzione allo stato stazionario (Vss) è stato di 2,881 mL/kg, ciò indica una distribuzione relativamente ampia e superiore a quello riportato nelle pecore (Patel et al., 2012), nei cammelli (Goudah, 2009), nelle capre (Goudah & Abo El Sooud, 2009) e nei gatti (Albarellos et al., 2005). Inoltre è stato coerente con quello riportato per i polli nello studio di Varia et al. (2009).
La levofloxacina viene eliminata principalmente dal rene con il coinvolgimento della filtrazione glomerulare e della secrezione tubolare. La clearence (Cl) ha un valore medio di 381,17 mL/h/kg nei polli, molto simile a quello osservato nei vitelli (Kumar et al., 2012), nelle pecore (Patel et al., 2012) e nei cammelli (Goudah, 2009).
La biodisponibilità assoluta della levofloxacina nei polli da carne dopo la somministrazione PO è stata completa, con un valore medio % F (123,25%) che indica il completo assorbimento PO della levofloxacina nei polli.
In alcuni studi sono state riscontrate diverse variazioni nella biodisponibilità orale tra le specie animali, in particolare nei cammelli si è osservato un valore simile pari al 94% (Goudah, 2009), ma superiore a quelli osservato nei vitelli, 62% (Kumar et al., 2012) e nei gatti 71%, (Albarellos et al., 2005).
A seguito della somministrazione PO di levofloxacina alla dose di 5 mg/kg, la concentrazione di farmaco nel fegato è stata rispettivamente di 6,57 ± 1,74 μg/g dopo 1 h e di 0,14 ± 0,01 μg/g dopo 48 h. Nei muscoli la concentrazione è stata rispettivamente di 0,94 ± 0,07 μg/g dopo 1 h, e 0,04 ± 0,01 μg/g dopo 48 h.
Questa persistenza del farmaco nel tessuto supporta l'ampio valore del Vss.
I livelli di levofloxacina nel fegato e nei reni sono risultati più alti (4-5 volte) di quelli misurati nel muscolo e nei polmoni dopo 1 h dalla somministrazione. Ciò potrebbe suggerire una specifica affinità della levofloxacina per questi due organi.
L'approccio PK/PD consente di determinare il dosaggio ottimale sulla base della suscettibilità microbiologica e sulla variazione nella disposizione cinetica (Hyatt et al.,
