RELAZIONE SCIENTIFICA FINALE Assegno di Ricerca (AdR2342/14)
Università degli Studi di Verona
Dipartimento di Biotecnologie
Nome e Cognome del Beneficiario Dott.ssa Chiara Santi
Titolo del Programma di Ricerca
Strategie molecolari per l’acquisizione della resistenza a stress biotici in piante di interesse interesse agrario
Settore Scientifico Disciplinare di riferimento BIO/04
Nome e Cognome del Responsabile Scientifico Prof.ssa Tiziana Pandolfini
Durata dell’Assegno di Ricerca (da…a…) 1/10/2014 – 30/09/2015
Periodo di riferimento della relazione (da…a…) 1/10/2014 – 30/09/2015
Note
(es.: eventuali periodi di sospensione dell’Assegno, etc.)
Università degli Studi di Verona
Dipartimento di Biotecnologie
DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ DI RICERCA (presupposti/obbiettivi, metodologie applicate,
risultati intermedi e conclusivi, discussione)
L’assegno di ricerca ha previsto l’analisi molecolare di linee di portainnesto GF677 di pesco putativamente trasformate mediante il costrutto antivirale ihp35S-PPV194.
Il costrutto a forcina ihp35S-PPV194 contiene il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) posto a monte di due porzioni di 194 bp ciascuna del genoma di PPV strain D
(X16415, dalla base 134 alla base 327) inserite come ripetizioni invertite e separate dall’introne
(lunghezza 115 bp) del gene LAX1 di Medicago truncatula. Una volta introdotto stabilmente nel genoma del portainnesto GF677 mediante trasformazione genetica mediata da Agrobacterium
tumefaciens, l’espressione del costrutto innesca il meccanismo dell’RNA silencing e rende la
pianta resistente all’attacco da parte del Plum Pox Virus.
La trasformazione genetica del GF677 è stata condotta da membri del Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Ambientali dell’Università Politecnica delle Marche.
Essendo il pesco una specie vegetale vegetale da cui risulta molto difficile estrarre DNA genomico di buona qualità (in termini di purezza), poiché molto ricca in carboidrati, si sono rese necessarie diverse prove preliminari per la messa a punto del protocollo di estrazione. Il metodo che ha permesso di ottenere DNA genomico integro e puro ha previsto l’impiego, prima della lisi cellulare, di un tampone di estrazione contenente alte concentrazioni di saccarosio (soluzione STE: 0.25 M saccarosio, 0.03 M Tris, 0.05 M EDTA; Kaufman et al., 1999), allo scopo di rimuovere i carboidrati presenti nel tessuto vegetale. A questa fase è seguita poi una fase di lisi cellulare, che ha previsto l’impiego del kit commerciale Nucleon Phytopure (GEHealthcare). Una volta messo a punto il metodo per l’isolamento del DNA, si è proceduto ad analizzare, mediante tecniche di PCR e Dot Blot, il materiale vegetale proveniente da diverse linee di GF677 putativamente trasformate e cresciute in vitro. Da questa prima analisi alcune linee sono risultate positive sia all’analisi PCR sia all’ibridazione con sonde opportunamente disegnate su diverse porzioni del costrutto genico
ihp35S-PPV194. Le linee una volta trasferite in terra ed ambientate in serra verranno analizzate
Università degli Studi di Verona
Dipartimento di Biotecnologie
mediante Southern blot allo scopo di identificare l’effettiva presenza di copie del transgene nel genoma.
Parallelamente, mantenendo la struttura della cassetta genica del costrutto ihp35S-PPV194, nell’ambito di questo assegno di ricerca, sono stati realizzati due nuovi costrutti genici antivirali. Si è scelto di mantenere la struttura a forcina del costrutto e di sostituire il promotore 35S con due diversi promotori tessuto-specifici, in particolare floema-specifici. L’impiego di promotori in grado di guidare l’espressione del costrutto a forcina in maniera specifica nel floema, sembra facilitare il movimento sistemico dell’RNA silencing (Pandolfini et al., 2003). E’ stata scelta la sequenza regolatrice di 941 bp del gene SUC2 (sucrose transporter 2) di Arabidopsis thaliana (JQ733913.1). E’ noto che il prodotto del gene Suc2 codifica per un trasportatore del saccarosio localizzato nel floema (Srivastava et al., 2008 and 2009). L’altro costrutto contiene la sequenza regolatrice di 980 bp del gene PP2 (phloem protein 2) di Arabidopsis thaliana, che codifica per un prodotto proteico espresso nelle cellule compagne del floema (Zhang et al., 2011). Nonostante le sequenze regolatrici scelte siano derivate dalla specie eterologa Arabidopsis, è riportato in letteratura che l’espressione preferenziale nel floema è mantenuta anche in specie legnose (es:
Citrus sinensis) (Miyata et al., 2012; Dutt et al., 2012). I costrutti sono stati realizzati e clonati nel
T-DNA di un vettore derrelazioivativo del pBin19 ed successivamente introdotti in cellule di
Agrobacterium tumefaciens. Sono attualmente in corso prove di trasformazione della pianta
erbacea Nicotiana benthamiana, specie modello per lo studio delle infezioni virali, allo scopo di verificare, una volta che le piante verranno infettate con il virus PPV, l’azione di questi promotori nel conferire resistenza locale e sistemica al virus. Una volta testata l’efficacia di questi costrutti nel conferire resistenza locale e sistemica al virus PPV in Nicotiana, verranno effettuate prove di trasformazione sul portainnesto GF677.
Il Responsabile Scientifico L’Assegnista di Ricerca
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