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Capitolo 1 ... 4
Importanza biologica dei lipidi ... 4
Importanza nutrizionale ... 4
Importanza fisiologica ... 4
I lipidi circolanti e il concetto delle lipoproteine ... 5
Importanza biologica del colesterolo ... 8
Biosintesi e secrezione del colesterolo ... 8
Trasporto del colesterolo ai tessuti attraverso le LDL ... 10
Metabolismo e ruolo delle HDL ... 11
Ipercolesterolemia ... 12
Ipercolesterolemia familiare ... 12
Malattie coronariche... 13
Carta del rischio cardiovascolare ... 16
Ipercolesterolemia e disfunzioni vascolari ... 19
Ipercolesterolemia ed infiammazione ... 20
Ipercolesterolemia e lo stress ossidativo ... 22
Ipercolesterolemia e terapie farmacologiche ... 24
Capitolo 2 ... 26
Caratteristiche molecolari della CETP ... 26
Il gene ... 26
Struttura primaria ... 26
Struttura secondaria e terziaria ... 27
Glicosilazione ... 28
Espressione della CETP nei tessuti ... 28
Secrezione ... 29
Regolazione dell’espressione del gene. ... 30
Funzioni della CETP ... 30
Trasferimento dei lipidi tramite la CETP ... 30
a. Trasferimento dei lipidi tra le lipoproteine. ... 30
b. Trasferimento dei lipidi con le cellule ... 32
Ruolo della CETP sui cambiamenti della taglia delle lipoproteine. ... 32
Conversione delle HDL. ... 32
Distribuzione delle dimensioni delle LDL. ... 35
2
Tappa chiave della reazione di trasferimento degli esteri del colesterolo. ... 35
a. Modello cinetico ... 35
b. Legame della CETP alle lipoproteine ... 37
c. Legame della CETP ai lipidi neutri ... 38
Fattori che modificano la reazione di trasferimento degli esteri del colesterolo. ... 39
a. Concentrazione dei substrati lipoproteici. ... 39
b. Contenuto lipidico delle lipoproteine ... 41
b.1. Composti di superficie. ... 41
b.2. Esteri del colesterolo e dei trigliceridi. ... 41
b.3 Acidi grassi non esterificati. ... 42
c. Contenuto in apolipoproteine dei substrati lipoproteici... 43
Inibitori della CETP ... 44
Inibitori proteici del trasferimento lipidico (LTIP) ... 44
Inibitori farmacologici della CETP ... 45
Concentrazione plasmatica e variazioni fisiopatologiche ... 46
Variazioni della concentrazione plasmatica della CETP ... 46
a. Concentrazione plasmatica ... 46
Variaizoni dall’attività e della concentrazione ... 46
b. Stato postprandiale ... 46
b.1. Stato patologico ... 46
b.2. Farmaci ipocolesterolemizzanti ... 47
b.3. Esercizio fisico. ... 47
Studi sperimentali sugli animali ... 47
a. iniezione della CETP esogena a degli animali CETP- deficienti……….…46
b. Anticorpi anti-CETP. ... 48
c. Topi transgenici ... 48
Conclusioni generali: CETP ed aterosclerosi ... 49
Capitolo 3 ... 52
Inibitori della CETP ... 52
Torcetrapib ... 52
Effetti del torcetrapib sulla aterosclerosi in esseri umani. ... 52
Effetti del torcetrapib sugli eventi cardiovascolari. ... 53
Possibili spiegazioni del danno causato da torcetrapib nello studio ILLUMINATE ... 53
3
Effetti del torcetrapib non correlati all’inibizione della CETP. ... 54
Dalcetrapib ... 55 Farmacocinetica ... 55 Studi clinici ... 56 Evacetrapib……….56 Farmacologia in vitro ... 57 Farmacologia in vivo ... 58 Pressione sanguigna ... 59
Sintesi aldosterone e cortisolo ... 60
ACCELERATE: l’Evacetrapib non riduce il rischio cardiovascolare ... 61
Capitolo 4 ... 63
Anacetrapib ... 63
Meccanismo d’azione ... 63
Farmacocinetica ... 64
Farmacodinamica ... 66
Studio clinico di fase II... 67
Studio clinico di fase III: DEFINE ... 68
Valutazione della sicurezza ... 69
Capitolo 5 ... 71
Conclusioni ... 71
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Capitolo 1
Importanza biologica dei lipidi
Importanza nutrizionale
I lipidi sono dei costituenti indispensabili del regime alimentare, da un lato per il loro grande valore energetico e dall’altro per le loro associazioni con delle vitamine liposolubili (A,D,E,K) e con gli acidi grassi essenziali (vitamina F).
Importanza fisiologica
Dal punto di vista fisiologico, i lipidi hanno un ruolo metabolico vario che ne consente la classificazione in lipidi di riserva, lipidi di struttura, lipidi con attività metabolica e lipidi circolanti.
1. Lipidi di riserva: la loro quantità nell’organismo varia con lo stato nutrizionale. Essi sono presenti in deboli concentrazioni in quasi tutte le cellule ma sono particolarmente abbondanti in cellule specializzate, dette adipociti. I lipidi di riserva sono costituiti per il 95% da trigliceridi.
2. Lipidi di struttura: rappresentano circa il 10% del peso secco dell’organismo e questo tasso è costante, qualsiasi sia lo stato nutrizionale. Questi lipidi sono parte integrante delle strutture cellulari. La loro grande affinità per le proteine esplica la loro localizzazione preferenziale nelle membrane cellulari, dove assicurano, oltre al ruolo strutturale, delle funzioni fisiologiche importanti. La loro composizione chimica è molto variabile (fosfolipidi, esteri del colesterolo) [1].
3. Lipidi con attività metabolica: oltre al ruolo energetico e strutturale, i lipidi hanno un ruolo funzionale importante nella sintesi degli eicosanoidi
5 (prostaglandine e leucotrieni), degli ormoni steroidei, degli diaciligliceroli e inositol-fosfato (messaggeri ormonali).
4. Lipidi circolanti: sono rappresentati da complessi lipidici (colesterolo, trigliceridi, fosfolipidi) con diverse proteine, le apolipoproteine.
I lipidi circolanti e il concetto delle lipoproteine
I lipidi circolanti sono costituiti essenzialmente dal colesterolo, dai trigliceridi e dai fosfolipidi (figura 1).
6 I principali lipidi implicati nell’aterosclerosi sono il colesterolo e i trigliceridi. I fosfolipidi sono elementi strutturali molto importanti delle lipoproteine ma non intervengono direttamente nelle complicazioni dislipoproteinemiche aterogene [2].
a. Il colesterolo
Il colesterolo è un lipide sintetizzato dal fegato a partire dagli alimenti più ricchi in grassi. Esso è presente nello strato esterno delle membrane cellulari e di tutte le cellule dell’organismo. Il colesterolo è trasportato nel sangue dalle lipoproteine e quelle maggiormente implicate sono:
Le lipoproteine a bassa densità (LDL): (colesterolo cattivo) queste sono responsabili delle patologie arteriose. Le LDL trasportano il colesterolo dal fegato verso le cellule e possono determinare lo sviluppo di un accumulo nocivo se la quantità risulta superiore a quella che può essere realmente accettata a livello cellulare.
Le lipoproteine ad alta densità (HDL): (colesterolo buono) queste consentono di prevenire lo sviluppo di patologie arteriose. Le HDL prelevano il colesterolo a livello delle cellule per trasportarlo a livello epatico, dove verrà distrutto ed eliminato dall’organismo.
Nell’uomo, il colesterolo circolante ha un’origine principalmente endogena ma il tasso di sintesi sembra essere modulato da certi fattori esogeni, quali il regime alimentare ed in particolare la composizione in acidi grassi dei diversi alimenti. Circa il 30% del colesterolo circolante è legato all’alimentazione. La natura delle proteine alimentari influenza anche essa la colesterolemia. Per esempio, la sostituzione delle proteine animali attraverso delle proteine di soia è associata ad una diminuzione del 20% della colesterolemia in soggetti normolipidemici ed ancora maggiormente nei soggetti affetti da ipercolesterolemia [3]. La sintesi del colesterolo, possibile in tutte le cellule è attiva soprattutto negli epatociti ed enterociti. La sua unica via catabolica è la trasformazione in acidi biliari che ha luogo nel fegato. I valori normali della colesterolemia sono compresi tra 4,40 e 5,20 mmol/l (1,70-2,00 g/l). Gli studi epidemiologici hanno mostrato che al di sotto di 4,40 mmol/l non vi sono rischi a livello coronarico e che a partire da 5,20 mmol/l può svilupparsi il rischio vascolare, aumentando in maniera esponenziale con la colesterolemia. Per esempio, tra 5,20 e
7 6,70 mmol/l, raddoppia il rischio di decesso a causa di infarto a livello del miocardio [4].
b. Trigliceridi
I trigliceridi circolanti vengono prodotti a due livelli: a livello intestinale che assorbe i grassi alimentari, soprattutto costituiti da trigliceridi e, a livello epatico che sintetizza i trigliceridi a partire dai nutrimenti assorbiti durante i pasti ed a partire dai lipidi di riserva nei periodi di digiuno. Così come accade per il colesterolo, l’influenza del regime alimentare è importante. Gli acidi grassi polinsaturi della serie 𝜔3 abbondanti nei pesci, diminuiscono la trigliceridemia (e la colesterolemia), attraverso la diminuzione della sintesi epatica del VLDL (sono lipoproteine ad alto contenuto in trigliceridi). Se il regime alimentare è povero di grassi e ricco di carboidrati, le concentrazioni di trigliceridi e VLDL aumentano, sia nei soggetti normolipidemici che negli ipertrigliceridemici, poichè il fegato sintetizza da vantaggio le VLDL e queste sono più ricche in trigliceridi e VLDL normali.
c. Fosfolipidi
I fosfolipidi intervengono nelle proprietà fisico-chimiche delle lipoproteine e delle membrane cellulari. Essi sono ugualmente i precursori di numerosi messaggeri intra e intercellulari, implicati in diversi fenomeni molto differenti, quali la stimolazione ormonale, l’infiammazione, l’aggregazione piastrinica. Il loro metabolismo, molto complesso e non molto chiaro, si sviluppa nel fegato, nell’intestino e nel plasma [5].
8
Importanza biologica del colesterolo
Il colesterolo è un costituente essenziale delle membrane cellulari ed un precursore indispensabile della sintesi degli ormoni steroidei e degli acidi biliari. L’organismo contiene circa 100g, ripartiti in maniera ineguale: il sistema nervoso centrale ne è molto ricco (30-40g) ma il rinnovamento avviene in maniera molto lenta a differenza del fegato, delle cellule sanguigne e del plasma, che ne contengono 2-3g per kg e laddove viene rinnovato rapidamente. La biosintesi del colesterolo è dell’ordine di 1g al giorno e varia in base alle necessità del tessuto ed in base all’apporto alimentare.
Biosintesi e secrezione del colesterolo
Nel momento in cui le cellule necessitano del colesterolo, queste mettono in gioco un primo meccanismo di captazione delle lipoproteine plasmatiche LDL o HDL, aumentando il numero dei loro recettori specifici e stimolando l’attività di internalizzazione. Quando la quantità di colesterolo apportata è insufficiente ha inizio il processo di biosintesi. Tutte le cellule dell’organismo sono capaci di effettuare questo processo ma l’intestino ed il fegato sono i protagonisti principali. Interamente citoplasmatica, la sintesi avviene a partire dall’acetil CoA proveniente dai mitocondri. L’ idrossimetilglutaril-CoA reduttasi (HMG CoA reduttasi) è l’enzima che regola la sintesi del colesterolo. La sua attività varia in funzione della concentrazione intracitoplasmatica del colesterolo libero che influenza la concentrazione dell’enzima e ne modula così l’attività (figura 2).
9 La biosintesi del colesterolo è particolarmente sensibile a certi fattori fisiologici: il digiuno, l’apporto del colesterolo o dalla diminuzione della sintesi epatica. Al contrario, un’alimentazione glucidica e soprattutto l’apporto di acidi gassi ne aumenta
10 la produzione. Il fegato secreta il colesterolo nel sangue e nella bile che racchiude anche i prodotti di degradazione del colesterolo, gli acidi biliari. La secrezione biliare (1-1,5g al giorno) è destinata soprattutto a favorire la digestione intestinale dei lipidi. Il colesterolo di origine epatica è secreto nel sangue incorporato alle lipoproteine VLDL e HDL. La concentrazione delle VLDL prodotte dipende dalla dimensione delle particelle secrete: il colesterolo si trova soprattutto in forma libera nello strato periferico ed associato ai fosfolipidi, a dispetto di quanto avviene a livello centrale, laddove il colesterolo è presente soprattutto nella forma esterificata. Più la particella è voluminosa, più il rapporto colesterolo/trigliceride è debole. La quantità totale di colesterolo secreto dal fegato nelle VLDL è inferiore a 2g al giorno [6].
Il colesterolo secreto sotto forma di HDL è associato ai fosfolipidi colinici in proporzioni prossime ad 1 mole di colesterolo per 2 moli di fosfolipidi. Un rivestimento di apoproteine E e A-I (E/A-I > 1) mantiene queste particelle sottoforma di dischi. Il colesterolo è in seguito esterificato grazie alla lecitina colesterolo aciltransferasi (LCAT), enzima secreto dal fegato e fissato alle HDL, contenenti le apoproteine A-I e D. L’esterificazione del colesterolo trasforma le HDL discoidali in HDL sferiche. Considerando il turnover delle HDL a livello epatico, è difficile stimare la quantità di colesterolo cosi come la quantità messa in circolazione, ma si ritiene che possa essere inferiore ad 1g al giorno.
Trasporto del colesterolo ai tessuti attraverso le LDL
Le LDL sono le lipoproteine plasmatiche più abbondanti nell’uomo (60-70%), aventi una durata di vita di 3 giorni. Queste si ottengono dal catabolismo delle VLDL ed hanno dunque un’origine principalmente epatica (figura 3).
11 La loro composizione è la meno variabile rispetto alle altre lipoproteine:
- Il cuore lipidico comprende il colesterolo esterificato (36%) e dei trigliceridi (5-7%).
- Lo strato periferico comprende dei fosfolipidi (24%), del colesterolo libero 9% e delle apoproteine B100 (21%).
Queste trasportano i due terzi del colesterolo circolante, principalmente in forma esterificata. Le cellule che hanno bisogno di colesterolo captano le LDL grazie a dei recettori di membrana specifici delle apoproteine B ed E.
Metabolismo e ruolo delle HDL
Le HDL rappresentano una classe particolare di lipoproteine, con taglia e massa molto più piccole rispetto alle LDL (7-11 nm). Presentano un’elevata densità idratata dovuta all’importante presenza di apoproteine (45-55%). Le apoproteine più abbondanti sono le A-I e A-II, ma possono essere presenti anche quelle di tipo C ed E. Certe proteine circolanti si legano alle HDL: questo è il caso delle LCAT, della CETP (Proteina di trasferimento degli esteri del colesterolo) e probabilmente di altre proteine aventi affinità con i fosfolipidi. Le HDL subiscono numerosi rimodellamenti durante il loro metabolismo, che determina importanti variazione nella loro composizione. Le nuove HDL, non possono contenere alcun lipide neutro ( colesterolo esterificato, trigliceridi), si presentano come dei dischi di fosfolipidi (a doppio foglietto) e di colesterolo, circondato da apoproteine. Le altre HDL sono sferiche, il cuore è costituito da colesterolo esterificato e da una piccola quantità di trigliceridi e la superficie è occupata da apoproteine di tipo A-I ed accessoriamente da apoproteine A-II,C o E associati a dei fosfolipidi e colesterolo libero. La presenza di LCAT associato alle HDL contribuisce a modificare la loro composizione, trasformando il colesterolo libero superficiale in colesterolo esterificato, che penetra nel cuore della struttura. Le CETP sono anche esse in grado di modificare la composizione delle HDL: le CETP trasferiscono il colesterolo esterificato delle HDL verso le lipoprotine ricche in tragliceridi (chilomicroni e VLDL), e permettono un arricchimento delle HDL in trigliceridi a spese delle lipoproteine.
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Ipercolesterolemia
L’ipercolesterolemia è una forma di iperlipidemia ed indica un’elevata concentrazione di colesterolo nel sangue. Questa può essere sporadica o familiare. La forma più comune è l’ipercolesterolemia familiare (HF). L’HF è un’iperlipidemia primaria dovuta alla presenza di mutazioni del gene codificante per i recettori delle LDL. La suscettibilità allo sviluppo di malattie a livello coronarico nei soggetti affetti da HF è influenzata da interazioni multiple gene-gene e gene-ambiente.
Ipercolesterolemia familiare
L’HF è causata da una mutazione del gene codificante per il recettore B-E, che consente il legame dell’apoproteina B delle LDL a livello delle membrane citoplasmatiche [7]. Questa mutazione porta ad una diminuzione del catabolismo delle LDL, un prolungamento della loro emivita ed un aumento del loro tasso plasmatico (figura 4).
Figura 4: schema delle LDL.
Il gene responsabile è situato sul cromosoma 19. I soggetti omozigoti non hanno dei recettori funzionali [8], mentre gli eterozigoti sono portatori della metà dei recettori
13 presenti nei normocolesterolemici [9]. Tra le malattie monogeniche, la forma eterozigote dell’ipercolesterolemia familiare è una delle forme più frequenti. Sono state descritte più di 200 mutazioni del recettore delle LDL fino ad oggi. La mutazione è generalmente completa e l’ipercolesterolemia può essere identificata fin dalla nascita. La metà dei recettori sono inefficaci, le concentrazioni plasmatiche di questi ultimi aumentano ed un numero più grande di particelle sono eliminate attraverso altre vie. Esistono delle classi di deficit dei recettori: queste sono cinque (tabella 5).
Classe luogo effetto
1 2 3 4 5 RE Golgi Legato all’apoB Superficie cellulare cellula Assenza di sintesi
Diffetto trasporto nella superficie cellulare Assenza di legame LDL-recettore
Legame senza internalizzazione
Mancanza di dissociazione del recettore dalle LDL
Tabella 5: classi delle mutazioni per i recettori delle LDL.
Nella classe I, la sintesi del recettore avviene per difetto; nella classe II, il recettore non viene trasportato in superficie. Nella classe III, le LDL non possono fissarsi al recettore. Nella classe IV, il complesso recettore-LDL non viene internalizzato; infine nella classe V non avviene la degradazione del complesso LDL-recettore. Nella classe I, il deficit è assoluto, mentre nelle altre classi, i recettori possono legare una debole porzione di LDL. Il deficit dei recettori ha per effetto quello di determinare un aumento della concentrazione delle LDL in circolo, che porta a delle eventuali forme di aterosclerosi ed alla formazione di depositi di colesterolo negli altri tessuti, per esempio a livello dei tendini. L’importanza delle manifestazioni può essere differente in base alle mutazioni.
Malattie coronariche
La complicazione dell’ipercolesterolemia familiare è l’aterosclerosi coronarica prematura. Il 50% degli uomini di 45 anni e le donne di 55 anni hanno delle
14 complicazioni coronariche che possono risultare sintomatiche a partire dai 20 anni negli uomini e 30 nelle donne. Si sospetta lo sviluppo dell’ipercolesterolemia familiare nei seguenti soggetti:
- Malati coronarici, con meno di 40 anni negli uomini e nelle donne in pre-menopausa;
- Le persone con una storia familiare di ipercolesterolemia e/o di malattie coronarie premature;
- Adulti con un rapporto colesterolo-LDL superiore a 6.0 mmol/L; - Bambini con rapporto colesterolo/LDL superiore a 3,5 mmol/L. Gli xantomi tendinei confermano la diagnosi (Figura 6).
L’ipercolesterolemia familiare si esprime già in giovane età e si cerca si prevenirla durante l’età pediatrica. In modo generale, il contesto clinico e familiare sono sufficienti per effettuare una diagnosi che può essere confermata da test genetici. È conveniente esaminare i genitori per ricercare gli xantomi tendinei talvolta presenti. I principi generali dei trattamenti non vengono tutti applicati ad una popolazione durante l’età pediatrica: bisogna tenere in considerazione la crescita e la tossicità potenziale dei medicinali utilizzati a lungo termine. Raramente la sola dieta può
15 consentire il controllo del tasso lipidico, ma costituisce una buona occasione per includere delle abitudini di vita adeguata.
L’espressione clinica dell’ipercolesterolemia è molto eterogenea. In effetti, i valori del rapporto colesterolo-LDL sono molto variabili da un individuo all’altro (4,0 fino a 10,0 mmol/L), così come l’aggressività delle manifestazioni cliniche [10-15]. Queste differenze fenotipiche possono esplicarsi attraverso la presenza o l’assenza di altri fattori di rischio, attraverso l’azione dei fattori di protezione o ancora, per il tipo di mutazioni. Le interazioni “gene-gene” e “gene-ambiente” sono degli elementi importanti per effettuare una diagnosi, il pronostico e il trattamento di questa iperlipidemia [16]. La conoscenza di questi aspetti è uno dei domini più promettenti. La malattia vascolare aterosclerotica è la principale complicazione attribuita alla maggior parte delle dislipoproteinemie, tra le quali l’HF [17-23]. L’aterosclerosi può interessare tutto il sistema arterioso ed è all’origine delle malattie coronariche, che rappresentano la maggior parte delle cause di decesso nelle popolazioni occidentali [24]. La malattia coronarica colpisce spesso gli individui durante i loro periodi di vita più produttivi. È una causa importante di morbilità ed i suoi costi economici e sociali sono considerevoli [25,26]. L’aterosclerosi è un fenomeno dai meccanismi complessi [27-29]. Per definizione, non sarebbe possibile soffrire di aterosclerosi, senza colesterolo e neppure senza una soglia di pressione intravascolare. Così, non vi è aterosclerosi a livello delle vene, a meno che queste non vengano utilizzate per effettuare del CABG (Coronary Artery Bypass Graft Surgery) e che si ritrovano allora sottomessi alla tensione arteriosa. Altri fattori come l’età, il sesso ed il tabagismo intervengono nei processi e più elementi partecipano alla sua evoluzione: le cellule della parete arteriosa, alcune cellule circolanti, diverse sostanze secrete ed i fattori emodinamici. La striscia lipidica costituisce la lesione aterosclerotica iniziale. Essa è caratterizzata da un accumulo di colesterolo a livello dell’intima. Questa lesione iniziale può essere seguita dalla formazione di una placca fibrosa, la quale è caratterizzata da un centro necrotico, ricco in lipidi, da una proliferazione ed una migrazione delle cellule muscolari lisce della media verso l’intima e dall’accumulo di materiale extracellulare fibroso. La rottura endoteliale costituisce la complicazione della placca fibrosa. Questa rottura è intasata dalla formazione di un trombo, in grado di ostruire la struttura vascolare e di sviluppare la sindrome ischemica. Il trombo è, in seguito, incorporato a livello della lesione aterosclerotica (Figura 7).
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Più ipotesi sono state formulate per dare una spiegazione all’aterosclerosi [30-34]. I cambiamenti nei meccanismi di controllo della fibrinolisi e della vasotonicità, così come le interazioni multiple tra il metabolismo dell’endotelio e quello delle cellule lisce, definiscono un modello che può determinare lo sviluppo di manifestazioni acute e croniche di aterosclerosi. Questo modello mette in gioco centinaia di sostanze emostatiche, tra le quali si nota l’attivatore della plasmogenesi (t-pa), l’urochinasi, l’inibitore dell’attivatore della plasmogenesi (PAI-I) e la trombina. Dei tassi elevati di lipoproteine LDL, il monossido di carbonio (tabagismo) e l’ipertensione arteriosa fanno parte delle variabili in grado di destabilizzare il meccanismo di protezione dell’endotelio. Tutti questi fattori possono causare delle disfunzioni endoteliali, anche in assenza di aterosclerosi anatomica. Questa disfunzione facilita l’accesso delle LDL circolanti a livello sotto-endoteliale, dove verranno ossidate.
Carta del rischio cardiovascolare
La carta del rischio cardiovascolare serve a stimare la probabilità di andare incontro a un primo evento cardiovascolare maggiore (infarto del miocardio o ictus) nei 10 anni successivi, conoscendo il valore di sei fattori di rischio: sesso, diabete, abitudine al fumo, età, pressione arteriosa sistolica e colesterolemia. Sono state studiate 7.475 persone di età compresa tra i 40 e i 69 anni, di cui 3.700 donne e 3.775 uomini, provenienti dal campione casuale dell’Osservatorio Epidemiologico Cardiovascolare (OEC). Le carte del rischio e il punteggio individuale sono strumenti messi a punto
17 dal Progetto CUORE per valutare, nelle persone esenti da precedente evento, il rischio cardiovascolare globale assoluto, cioè la probabilità di andare incontro ad un primo evento cardiovascolare maggiore nei successivi 10 anni, sulla base del livello dei principali fattori di rischio. Carte e punteggio considerano come end-point l’infarto del miocardio, la morte coronarica, la morte improvvisa, l’ictus e gli interventi di rivascolarizzazione. La valutazione del rischio offerta dal punteggio è peraltro più precisa rispetto a quella delle carte del rischio cardiovascolare che esprimono classi di rischio globale assoluto calcolate per categorie di fattori di rischio: il sesso; lo stato di diabetico; l’età in anni è considerata in tre decenni: 40-49, 50-59, 60-69 anni; l’abitudine al fumo di sigaretta; la pressione arteriosa sistolica suddivisa in 4 categorie: 90-129 mmHg; 130-149 mmHg; 150-169 mmHg; 170-200 mmHg; la colesterolemia totale, espressa in mg/dl, è stata suddivisa in 5 categorie: 130-173 mg/dl; 174-212 mg/dl; 213-251 mg/dl; 252-290 mg/dl; 291-320 mg/dl (Figure 8,9).
18 Dal campione selezionato sono stati identificati ed esclusi dall’analisi i pazienti con manifestazioni cliniche dell’aterosclerosi quali cardiopatia ischemica (angina pectoris, infarto del miocardio, interventi di rivascolarizzazione), accidenti cerebrovascolari, claudicatio intermittens, interventi di rivascolarizzazione periferica. Le carte e il punteggio individuale sono validi se applicati su individui con valori inclusi nei seguenti intervalli: pressione arteriosa sistolica 90-200 mmHg e colesterolemia totale 130-320 mg/dl; inoltre, per il punteggio: HDL-colesterolemia compresa tra 20 e 100 mg/dl. Pertanto sono stati esclusi dall’analisi le persone con valori estremi. Sul campione così selezionato, sono state calcolate le distribuzioni di frequenza per classi di rischio cardiovascolare a 10 anni classificato in 6 categorie (< 5%, 5-9%, 10-14%, 15-19%, 20-29%, ≥ 30%) utilizzando sia la carta che il punteggio. L’attenzione è stata successivamente focalizzata sui soggetti con rischio cardiovascolare a 10 anni ≥ 20% in modo da capire se i soggetti ad alto rischio secondo la valutazione con la carta sono confermati dalle stime del punteggio e viceversa, ed approfondire l’analisi comparativa individuando i motivi legati alle diversità di classificazione. Per la classificazione del rischio in 6 categorie e dicotomica (< 20%, ≥ 20%), è stato utilizzato come misura dell’accordo tra carta e punteggio il coefficiente kappa di Cohen (k). Per la classificazione in 6 classi si è calcolato inoltre il coefficiente kappa pesato secondo Cicchetti e Allison (k pesato) che tiene conto del principio per cui il disaccordo nell’attribuzione di un soggetto a due categorie differenti è da ritenere meno grave se le due categorie sono confinanti.
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Ipercolesterolemia e disfunzioni vascolari
L’endotelio vascolare, un singolo strato di cellule, è in grado di produrre numerose molecole bioattive, agendo così come organo autocrino, paracrino ed endocrino [35]. In un sistema normale, le cellule endoteliali mantengono il tono vascolare tramite la sintesi di fattori rilassanti, tra cui NO, prostaciclina e fattori iperpolarizzanti [36] in equilibrio con il tono simpatico e miogenico. Queste molecole aiutano a regolare l’omeostasi del sistema vascolare, regolando una serie di richieste sistematiche sul flusso ematico, coagulazione, infiammazione, aggregazione piastrinica e trasduzione del segnale, ed in cui qualsiasi alterazione provoca delle disfunzioni [37]. L’ossido nitrico (NO), gas sintetizzato dall’enzima ossido nitrico sintetasi (NOS) a partire dalla L-arginina, è stato ampiamente considerato come un regolatore del tono vascolare grazie alla sua azione a livello dell’endotelio, con l’aggiunta di ruoli nel prevenire l’attivazione piastrinica, nell’inibire lo stress ossidativo, nella crescita cellulare e nell’infiammazione [38,39]. La dimetilarginina asimmetrica (ADMA) è un inibitore endogeno di NOS attraverso la competizione con L-arginina [40]. Studi recenti dimostrano un dato aumento della produzione endogena di ADMA nell’ipercolesterolemia e la relazione inversa tra la produzione di NO e la concentrazione di ADMA [41]. Studi precedenti hanno dimostrato che l’attività dilatatrice in risposta agli stimoli NO-dipendenti è moderatamente compromessa nei topi ipercolesterolemici rispetto agli animali di controllo [42-48]. Questa riduzione è dovuta ad una diminuzione della biodisponibiltà dell’NO all’interno della struttura vascolare, dovuta sia ad un deficit di produzione che ad un aumento delle strutture in grado di eliminare le forme ossidanti [49]. Inoltre nei topi ipercolesterolemici ed in conigli in cui l’ipercolesterolemia è stata indotta tramite la dieta, si evolvono dei meccanismi di compensazione per mantenere la dilatazione a livello dell’endotelio, poiché soggetta ad una diminuzione della biodisponibilità dell’NO. Questi meccanismi sembrano coinvolgere il metabolismo dell’acido arachidonico, coinvolgendo così sia la cicloossigenasi che la lipoossigenasi [50-54]. L’acido arachidonico, nell’ipercolesterolemia, non è solo in grado di indurre la dilatazione, ma consente anche la produzione di trombossano A2 (TXA2), un potente vasocostrittore [55,56]. Animali ipercolesterolemici hanno mostrato una limitazione nel processo
20 della dilatazione indotta dall’acido arachidonico, a causa di un aumento della produzione di TXA2 durante il metabolismo vascolare.
Alcuni animali ipercolesterolemici hanno mostrato un miglioramento dell’attività vascolare, mentre altri, con recettori carenti per il trombossano presentavano lesioni aterosclerotiche [57,58]. L’ipercolesterolemia, oltre alle conseguenze vascolari ed endoteliali può portare alla disfunzione degli organi, con successive conseguenze sistemiche, a causa di una compromissione della perfusione tissutale. Questa perdita può essere attribuita ad una ristrutturazione arteriolare oppure ad una rarefazione capillare, dovuta all’accumulo di colesterolo. Queste alterazioni possono indurre dei cambiamenti a livello della pelle, glomerulopatia che porta alla disfunzione renale ed ipertensione, riduzione della riserva di flusso coronarico portando ad una malattia coronarica precoce ed epatica, la disfunzione che conduce verso la steatosi epatica non alcolica [59-63].
Ipercolesterolemia ed infiammazione
Numerosi studi hanno chiaramente stabilito che l'ipercolesterolemia porta ad una risposta infiammatoria all'interno il microcircolo, che si riflette nell’attivazione delle cellule endoteliali, nel reclutamento dei leucociti, nonché nell'attivazione piastrinica e nell'adesione [64] (Figura 8).
21 L'attivazione piastrinica può avviare il reclutamento dei leucociti a livello delle aree soggette, come evidenziato da una maggiore espressione di CD40 sulla superficie, indicativa dell’attivazione cellulare [65]. L’attivazione dei leucociti può successivamente ostacolare le reti capillari, riducendo la perfusione capillare.
La diminuzione della biodisponibilità di NO nell’ ipercolesterolemia diminuisce anche le proprietà anti-infiammatorie delle cellule endoteliali, permettendo l'attività di crescita dei fattori sulla superficie cellulare e l'attivazione piastrinica ad agire come chemioattrattanti ad una serie di eventi infiammatori. I leucociti cominciano a rotolare lungo il lume e la parete cellulare, oltrepassandola a causa di un aumento della permeabilità vascolare, risiedendo perciò all'interno dello spazio intimale [66]. La proteina chemiotattica per i monociti-1 (MCP-1) e interleuchina-8 (IL-8) sono entrambi importanti nei pazienti ipercolesterolemici, agendo per aumentare il reclutamento dei monociti e l'adesione che conduce al rimodellamento della parete [67-69]. I macrofagi, derivati da monociti, cominciano ad accumulare LDL e LDL ossidato (OxLDL) che si sviluppano in cellule schiumose tra la lamina basale dell'endotelio e lo strato di muscolatura liscia. Queste cellule schiumose portano alla produzione di numerosi marcatori infiammatori e allo stress ossidativo, alla
22 produzione di citochine, chemochine e fattori di crescita che aggravano la condizione di equilibrio endoteliale che porta alla disfunzione vascolare [70]. È stato dimostrato che la concentrazione elevata di colesterolo sia in grado di innescare il rilascio della proteina C-reattiva mediatore infiammatorio (CRP), un utile indicatore clinico della malattia cardiovascolare. Si ipotizza che CRP, tramite l'IL-6, possa esacerbare la disfunzione vascolare inibendo l’enzima NOS, stimolando la produzione di specie reattive dell'ossigeno e aumentando la permeabilità vascolare e, può anche avviare l'espressione e la stimolazione di molecole di adesione, la produzione di chemochine, e la formazione di trombi all'interno delle cellule endoteliali. Purtroppo, come marker cellulare di infiammazione vascolare, la fonte di CRP nelle condizioni di ipercolesterolemia non è chiara [71].
Ipercolesterolemia e lo stress ossidativo
L’eccesso di stress ossidativo è causato da uno squilibrio tra gli enzimi pro e anti-ossidanti, che porta ad una sovrapproduzione di radicali liberi, tra cui superossido, radicali idrossile e lipidi, i quali danneggiano i componenti cellulari che interferiscono con la normale funzione normale. Altre molecole quali perossinitrito, perossido di idrogeno e acido ipocloroso sono anche ossidanti, ma non sono radicali liberi. Le due principali fonti di ossidanti all'interno del sistema vascolare sono i leucociti (macrofagi) reclutati a causa di un segnale endoteliale di lesione ed inefficienze del metabolismo mitocondriale all'interno della muscolatura liscia [72]. L'ipercolesterolemia può aumentare anche l’attività di tre principali sistemi enzimatici ossidanti: ossidasi NADPH (NOX), xantina ossidasi, e mieloperossidasi. NOX agisce per trasferire un elettrone di una molecola di ossigeno, formando infine superossido H2O2 [73]. Sono state identificate sette isoforme di NOX (NOX1-5, Duox1 e 2),
quattro di queste (NOX1,2,4 e 5) sono state identificate all’interno della parete vascolare, con NOX2 responsabile dell’impatto correlato al ROS ed alla diminuzione della biodisponibilità dell’NO [74]. Le xantine ossidasi formano il superossido e H2O2
con la riduzione di ossigeno, mentre la mieloperossidasi è prodotta dai neutrofili e dai monociti ed è in grado di produrre l’acido ipocloroso tossico; in casi patologici gli enzimi possono portare ad una sovrapproduzione di questi radicali. Il disaccoppiamento di NOS e la riduzione del substrato (tetraidrobiopterina,BH4 e
L-23 arginina), possono determinare delle trasformazioni che portano alla produzione di una maggiore quantità di radicali ossidanti e del perossido di idrogeno, oltre che la produzione di NO [75]. Una serie di meccanismi antiossidanti contribuiscono per ridurre al minimo e bilanciare gli effetti dei ROS, tra cui superossido dismutasi (SOD), glutatione perossidasi (GPX4), catalasi e tioredossina reduttasi. SOD, che viene fornito in tre forme, citoplasmatica solubile (SOD1), extracellulare (SOD3) contenente rame e zinco e mitocondriale (SOD2) contenente manganese è il principale sistema antiossidante cellulare di tutti i tipi di cellule ed è in grado di convertire i radicali in H2O2 e ossigeno [76]. GPX4 riduce H2O2 e lipidi perossidi in acqua e,
riduce lo sviluppo di aterosclerosi in caso di ipercolesterolemia attraverso l'inibizione della perossidazione dei lipidi e una minore sensibilità delle cellule endoteliali ai lipidi ossidati [77]. La catalasi agisce per ridurre il perossido d’idrogeno in molecole di ossigeno e acqua. In caso di ipercolesterolemia, sistemi antiossidanti sono in grado di gestire l'aumento della domanda e la produzione di ROS supera la capacità. In caso di ipercolesterolemia, le reazioni tra l’ossigeno ed i radicali, l’ossidazione enzimatica, le lipoproteine o più in particolare i fosfolipidi possono determinare la produzione di lipidi quali oxLDL o fosfolipidi ossidasi (oxPL). Queste OxPL possono interagire con recettori di membrana accumulandosi all'interno della membrana cellulare, interrompendo la normale funzione cellulare, tramite una ridotta biodisponibilità di NO, suscitando una risposta immunitaria con conseguente scarsa funzione vascolare e, in ultima, lo sviluppo dell’aterosclerosi [78,79]. Questa conclusione è ulteriormente supportata in animali alimentati con polietilene-glicolate-SOD in cui aumenta il colesterolo e si ha una dilatazione dipendente da un miglioramento dell’endotelio, mentre altri animali normocolesterolemici non hanno evidenziato alcun effetto [80]. OxPL può interagire direttamente con la cellule endoteliali attraverso le interazioni con la lecitina simile al recettore oxLDL (LOX-1), un recettore endoteliale per LDL ossidato nelle cellule endoteliali; questo recettore induce una varietà di citochine infiammatorie, stress ossidativo, cambiamenti emodinamici e l'abbondanza di ox-LDL [81].
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Ipercolesterolemia e terapie farmacologiche
Le statine, 3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reduttasi, rappresentano attualmente una delle categorie di farmaci maggiormente prescritte sul mercato. Prendono di mira la HMG-CoA reduttasi nel fegato e inibiscono la produzione di un precursore del colesterolo, l’acido mevalonico. Possono anche agire specificamente per cambiare la conformazione della HMG-CoA reduttasi quando si lega, impedendo la formazione di una struttura funzionale [82]. Questo processo limita la produzione di colesterolo a livello epatico, impedendo l’attivazione della proteasi di steroli. Le statine sono state identificate per avere numerosi effetti positivi associati all’abbassamento della concentrazione di colesterolo [83-86]. Tuttavia, in aggiunta a queste, vi sono altre proprietà delle statine in grado di migliorare le funzioni endoteliali tra le quali le proprietà vasculoprotettive, una maggiore biodisponibilità di NO, proprietà antiossidanti, antinfiammatorie ed immunomodulatorie; rimane comunque difficile comprendere nel dettaglio gli effetti benefici nei soggetti ipercolesterolemici [87,88]. Inoltre, è stato osservato che la terapia con statine migliora in modo significato la funzione endoteliale in pazienti ipercolesterolemici, per cui è stata applicata anche a soggetti affetti da arteriopatia periferica [89]. Anche se questo effetto benefico può essere il risultato di un aumento della biodisponibilità di NO, i meccanismi non sono stati pienamente compresi [90]. Vi sono diversi effetti correlati all’abbassamento del colesterolo: riduzione dell’'infiammazione, diminuzioni di ROS, aumento della biodisponibilità di NO e la funzione endoteliale, diminuzione dell’attivazione e dell’aggregazione piastrinica, riduzione della coagulazione e diminuzione della proliferazione cellulare.
L’ezetimibe (Zetia) è un agente selettivo che agisce per prevenire l'assorbimento del colesterolo nell'intestino avendo come bersaglio la proteina Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1), presente sia nelle cellule epiteliali intestinali che in quelle epatiche, e responsabile della captazione intestinale di colesterolo e fitosteroli. Ezetimibe inibisce questa proteina in modo da bloccare l’assorbimento dell’LDL dall'intestino [91]. La successiva riduzione del trasporto del colesterolo stimola a livello del fegato un aumento compensatorio dell’ espressione dei recettori per LDL, aumentando così lo spazio vascolare senza gravi effetti collaterali noti [92]. In generale, le terapie che inducono un abbassamento del colesterolo hanno dimostrato una correlazione positiva,
25 con riduzione degli eventi cardiovascolari; dall’altro lato l’ezetimibe ha recentemente iniziato a mostrare degli effetti pleiotropici, quali la riduzione a livello del fegato di lipidi, riduzione dei livelli di ADMA e livelli di espressione di eNOS. Quando le statine e l’ezetimibe vengono usati in combinazione, agiscono attraverso delle vie complementari per prevenire il colesterolo, ossia limitando l’assorbimento a livello intestinale e la produzione a livello epatico. A lungo termine, la co-somministrazione di questi farmaci ha dimostrato di ridurre i livelli di colesterolo LDL nel sangue del 60% con un aumento dei livelli di HDL e una limitazione della tossicità del fegato, della miotossicità e/o rabdomiolisi tradizionalmente causati da trattamento con le sole statine [93,94]. Tuttavia, attualmente, gli effetti collaterali della terapia combinata non sono ben chiari, e non è ancora noto quanto sia efficace a livello infiammatorio [95]. Un’altra molecola utilizzata è la niacina o vitamina B3. Questa è in grado di abbassare il colesterolo e prevenire le malattie cardiovascolari. Agli inizi degli anni 50 alcuni ricercatori avevano constatato che l’acido nicotinico poteva abbassare il tasso di colesterolo e la percentuale di trigliceridi.
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Capitolo 2
Caratteristiche molecolari della CETP
Il gene
Nell’uomo il gene della CETP, presente come una copia unica per genoma aploide, occupa un locus di circa 25 kpb [96] sulle braccia del lungo cromosoma 16 (regione 16q12-21) [97], in prossimità del gene del LCAT (regione 16q22) [98]. Il gene, sequenziato al 42%, è composto da 16 esoni e 15 introni. Gli esoni, presenti solo all’8%, presentano una taglia variabile da 32 pb a 20 pb. Gli introni variano da 87 pb a 6000 pb. Delle forme di polimorfismo a livello del gene della CETP possono indurre delle variazioni della concentrazione plasmatica della CETP stessa [99-102]. Il DNA complementare (DNAc) della CETP è stato clonato e sequenziato in numerose specie, tra cui l’uomo [103], nelle scimmie cynomolgus [104] e nel coniglio [105]. La CETP della scimmia e quella dell’uomo presentano delle sequenze in acidi nucleici ed in amminoacidi omologhe per quasi il 95%, mentre la percentuale di omologie raggiunge appena l’80% comparando l’essere umano con il coniglio.
Struttura primaria
Nell’uomo, il DNA della CETP codifica per una pre-proteina di 493 amminacidi, comprendenti un segnale pre-peptidico di secrezione di 17 amminoacidi e la proteina matura di 476 amminoacidi [103]. La CETP presenta una massa molecolare di 53108 Da, mentre la massa molecolare apparente della proteina matura di circa 74 kDa. Questa differenza è dovuta ad una forte glicosilazione della proteina. In effetti, diversi studi hanno riportato una massa molecolare compresa tra 58 e 74 kDa [106-117]. Esiste una sequenza comune nel peptide segnale della CETP dell’uomo, dell’apoAIV, dell’apoAI e della LPL. Queste proteine presentano in particolare un pentapeptide Val-Leu-Thr-Leu-Ala identico [96]. La composizione amminoacidica della CETP
27 mette in evidenza una forte porzione (45%) di amminoacidi idrofobi (Val: 8,4%; Ile: 6,0%; Leu: 11,7%; Ala: 7,3%; Phe: 6,0%; Met: 1,8% et Pro: 4,3%) che conferisce un’idrofobicità superiore a quella delle apolipoproteine plasmatiche [111]. Queste proprietà consentono di spiegare il suo ruolo nel trasferimento degli esteri del colesterolo idrofobi.
Struttura secondaria e terziaria
La CETP (fig,11) è composta dal 32 al 35% da una struttura ad elica α ed il 35% di struttura β [103,118,119]. Essa può esistere sotto forma di monomero [120], ma è stato dimostrato che nel momento in cui questa è sottoposta ad elettroforesi in condizioni native, essa migra preferenzialmente sotto forma di dimero. La porzione carbossi terminale della CETP (amminoacidi 412-476) è particolarmente idrofoba. Confrontando l’apoB, che è l’apolipoproteina più idrofoba, la CETP è molto solubile in un mezzo acquoso. Queste proprietà possono essere spiegate poiché i residui apolari sono suscettibili a formare delle tasche idrofobe all’interno della molecola. Queste strutture sono implicate nel trasporto degli esteri del colesterolo e dei trigliceridi nel mezzo acquoso [111].
figura 11: struttura cristallina della CETP
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Glicosilazione
Delle modifiche post-trasduzionali della CETP, quali la glicosilazione permettono di spiegare le differenze delle masse osservate [117]. Questa glicosilazione avviene su quattro siti: residui Asn88, Asn240, Asn341 et Asn396 . Sembra che la glicosilazione, ed in particolare l’addizione degli zuccheri in posizione N-terminale, sia necessaria alla normale secrezione della CETP nel mezzo, poiché la CETP non glicosilata viene trattenuta dalle cellule [121]. La N-glicosilazione a livello dei residui Asn88 e Asn396 è
una tappa critica per la secrezione della CETP. All’opposto, delle mutazioni a livello dei residui Asn240 o Asn341 non portano a delle modifiche della secrezione e delle
mutazioni presentano un’attività di trasferimento simili. In effetti si suppone che l’attacco di glucidi a livello dei residui Asn88, che è situato vicino alla porzione
N-terminale della molecola, può influire sulle tappe di replicazione della proteina durante la traslocazione attraverso il reticolo. Utilizzando delle tecniche di mutazione guidata, si possono sostituire certi residui amminoacidici di Asn con residui di Gln che permettono di eliminare ogni sito di N-glicosilazione. È stato dimostrato che le variazioni della glicosilazione modificano l’attività delle proteine. Il sito della N-glicosilazione sull’Asn341 sembra essere utilizzato in maniera variabile e sembra
responsabile della presenza delle due principali forme della CEPT (66 e 69 kDa) riscontata nel plasma umano [113,122]. Il rapporto tra queste due isoforme potrebbe essere fonte delle variazioni delle attività della CETP nel plasma [122].
Espressione della CETP nei tessuti
Nell’uomo la distribuzione della CETP è relativamente ubiquitaria. Essa è principalmente epatica, nelle altre specie. Nell’uomo, il fegato, l’intestino tenue, le ghiandole surrenali e la milza [111] sintetizzano la CETP. Un’attività di trasferimento è stata ugualmente misurata nel liquido cefalo-rachidiano, mettendo così in evidenza
29 una sintesi della CETP a livello del cervello [123,124]. L’attività di trasferimento a livello cerebrale rappresenta circa il 12% dell’attività plasmatica. La CETP può dunque avere un ruolo nel trasporto e nella ridistribuzione dei lipidi nel sistema nervoso centrale. A livello del tessuto adiposo, la taglia degli adipociti e la concentrazione del colesterolo di membrana sembrano influenzare l’espressione del gene della CETP [125]. Nel criceto, il tessuto adiposo, il cuore ed i muscoli scheletrici sono le principali fonti dell’mRNA della CETP, mentre l’espressione è minore a livello dello stomaco, della milza e del fegato [126]. Nella scimmia, l’analisi tissutale mostra che il fegato e l’aorta toracica esprimono dei livelli elevati di mRNA della CETP mentre è minore a livello delle ghiandole surrenali, della milza e dell’aorta addominale ed irrilevante a livello del cervello, dei reni, dell’intestino e dei muscoli scheletrici [127]. È stato dimostrato che il fegato e il tessuto adiposo, nella scimmia, sono i principali responsabili della produzione della CETP. Nel coniglio e nella scimmia, le forme mRNA della CETP sono localizzati principalmente nel fegato, a livello delle cellule epatiche non parenchimatose ed in maniera minore a livello delle surrenali, dei reni e risultano irrilevanti a livello della milza [128-130].
Secrezione
La CETP può essere sintetizzata e secreta da numerosi tipi di cellule, quali i macrofagi umani [131-133], le cellule epatiche HepG2 [134], le cellule Caco2 [135] e da altre linee cellulari SW872 isolate a partire dai liposarcomi umani [136]. Questa secrezione può essere regolata dalla presenza, in un mezzo di incubazione, di acidi grassi quali il butirrato di sodio per le cellule HepG2. Ugualmente, l’addizione di LDL, nel mezzo di coltura contenenti le cellule SW872, aumenta la secrezione della CETP. Il colesterolo LDL ed il 25(OH)-colesterolo sono capaci nella stessa miniera di aumentare il tasso di mRNA della CETP. Questi dati suggeriscono che il colesterolo può indurre un aumento della quantità di mRNA e induce secondariamente un aumento del tasso della CETP.
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Regolazione dell’espressione del gene
Numerosi studi hanno dimostrato che il gene della CETP può essere regolato dalle variazioni del metabolismo e dalla nutrizione. In particolare, il regime ricco in colesterolo induce a livello dei differenti tessuti (tessuto adiposo, cuore, muscoli scheletrici, epatociti) un aumento della trascrizione del gene della CETP, da cui deriva un aumento del tasso di mRNA [137-140]. La regolazione dell’espressione del gene della CETP, in risposta al regime ricco in colesterolo o a forme di ipercolesterolemia endogene, sembra essere dipendente dalla presenza di sequenze di questo gene [141-143]. Questa risposta varia in funzione dei diversi genotipi in apoE. L’espressione del gene può ugualmente essere influenzata da altri fattori quali i lipopolisaccaridi (LPS) e i corticosteroidi che possono indurre, nell’uomo e nei topi delle forme di CETP-transgeniche, una diminuzione della sintesi epatica dell’mRNA o una riduzione del tasso plasmatico della CETP [144]. Allo stesso modo, il tasso di mRNA epatico, adiposo, cardiaco o muscolare possono essere diminuiti tramite l’iniezione intravenosa di oligodesossinucleotidi antisenso nei conigli [145] o attraverso delle endotossine e citochine nei criceti [146] che inducono delle modificazioni del profilo lipoproteico.
Funzioni della CETP
Trasferimento dei lipidi tramite la CETP
a. Trasferimento dei lipidi tra le lipoproteine
In vitro, la CETP catalizza il trasferimento bidirezionale dei lipidi neutri tra tutte le frazioni lipoproteiche isolate [147-151], ossia un trasferimento degli esteri del colesterolo delle LDL e HDL verso le VLDL, e dei trigliceridi delle VLDL
(lipoproteine ricche in TG) verso le HDL e le LDL (lipoproteine povere in TG). In vitro, le LDL e le HDL hanno una velocità di catabolismo relativamente debole, il loro pool come esteri del colesterolo e trigliceridi si equilibra (figura 12). In vitro, viene
31 spesso messo in evidenza uno scambio sia di trigliceridi [152] che di esteri del
colesterolo [153] senza trasferimento di massa. Tuttavia, dopo che le lipoproteie sono state incubate per 24 ore, la CETP presente nel mezzo dell’incubazione induce un trasferimento netto massiccio degli esteri del colesterolo delle HDL verso le LDL [154,155].
Figura 12: Equilibrio degli esteri del colesterolo e dei trigliceridi tra HDL e LDL.
L’equilibrio delle concentrazioni di esteri del colesterolo tra queste due frazioni lipoproteiche non si osserva che dopo 1-3 ore di incubazione. Nei soggetti presentanti un’iperlipidemia combinata (dislipidemia caratterizzata da un aumento del tasso di VLDL e LDL ed una riduzione della concentrazione delle HDL) è stata messa in evidenza un aumento del trasferimento netto massiccio degli esteri del costerolo delle HDL verso le VLDL ed uno scambio degli esteri del colesterolo, senza trasferimento della massa, delle HDL verso le LDL [156]. All’opposto, le VLDL presentano un tasso di catabolismo relativamente elevato (10-40%h) [157] ed un rapporto EC/TG debole in rapporto alle HDL e LDL. In queste condizioni, non si osserva in vitro un equilibrio tra le concentrazioni degli esteri del colesterolo e dei trigliceridi nelle frazioni lipoproteiche. In vitro, si osserva un trasferimento netto massiccio dei
32 trigliceridi delle lipoproteine ricche in trigliceridi (VLDL) verso le lipoproteine povere in trigliceridi (HDL e LDL) e un trasferimento netto massiccio, reciproco e equimolare degli esteri del colesterolo delle HDL e LDL verso le VLDL [158,159].
b. Trasferimento dei lipidi con le cellule
Oltre al suo ruolo nel trasferimento dei lipidi neutri tra le lipoproteine, la CETP favorisce ugualmente il flusso di esteri del colesterolo e di trigliceridi a partire da diverse cellule (cellule muscolari lisce dell’aorta, macrofagi peritoneali) verso il mezzo di coltura [159-161]. Essa permette ugualmente il trasferimento degli esteri del colesterolo delle HDL verso le cellule epatocitarie tumorali (HepG2) [162-164], verso le cellule muscolari lisce ed in misura minore verso i fibroblasti ma sembra senza influenza sul trasferimento degli esteri del colesterolo delle HDL verso le cellule endoteliali. Le differenze nella velocità di trasferimento sono state messe in evidenza da Francis e al. (1991) che hanno evidenziato che nel momento in cui il trasferimento degli esteri del colesterolo è effettuato dalle LDL verso le cellule HepG2 era circa 25 volte superiore a quello osservato a partire dalle HDL. La CETP interviene ugualmente a livello dell’omeostasi cellulare del colesterolo, poiché l’aumento degli esteri del colesterolo a livello dei macrofagi porta ad un aumento, dose-dipendente, della sintesi della CETP nelle cellule. Questo meccanismo può essere importante nella captazione degli esteri del colesterolo a partire dalle cellule cariche di lipidi, come quelle presenti nelle lesioni aterosclerotiche e può costituire un meccanismo di protezione in risposta all’accumulo del colesterolo a livello dei macrofagi della parete arteriosa.
Ruolo della CETP sui cambiamenti della taglia delle lipoproteine
33 Le HDL intervengono nel trasporto del colesterolo dai tessuti periferici verso il fegato, che rappresenta il trasporto inverso del colesterolo. Queste lipoproteine sono costituite da due frazioni principali, diverse in dimensioni, densità e composizione apolipoproteica [165]. Viene messa in evidenza una frazione di grande taglia (HDL2)
e un’altra di taglia minore (HDL3). Ciascuna di esse è essa stessa eterogenea, poiché
utilizzando delle tecniche di elettroforesi su gel in gradiente hanno mostrato che le HDL2 possono essere separate in due sotto frazioni (HDL2b e HDL2a) e le HDL3 in tre
sotto frazioni (HDL3a, HDL3b e HDL3c) (figura 13).
Figura 13: Caratterizzazione dell’HDL nel plasma umano.
L’eterogeneità delle sotto popolazioni delle HDL implica delle funzioni metaboliche [166] e fisiopatologiche differenti, poiché il ruolo di protezione contro l’aterosclerosi è stata conferita alle HDL2 [167,168]. Un tasso debole di HDL è associato ad un
aumento del rischio cardiovascolare, che riflette una riduzione delle sotto popolazioni delle HDL di taglia più grandi e più dense [169, 170]. Dei fattori che possono modulare le sotto popolazioni di HDL possono dunque presentare un’importanza particolare in termini di metabolismo normale e di predisposizione all’aterosclerosi. In vitro, l’incubazione del plasma umano non trattato porta ad una diminuzione della
34 popolazione di HDL3a e HDL3b ed alla formazione di particelle di grandi dimensioni
(HDL2a) e più piccole (HDL3c) [171]. Diversi fattori possono essere implicati in
questo fenomeno di conversione:
La LCAT che permette l’esterificazione del colesterolo libero in colesterolo esterificato. Quest’ultimo si accumula nel cuore delle particelle delle HDL e ne aumenta la taglia [172-174].
La LPL, idrolizzando i trigliceridi nei chilomicroni e nelle VLDL, libera dei composti di superficie che possono associarsi con le HDL e contribuiscono alla conversione delle HDL3 in HDL2 [175,176].
L’HL, idrolizzando i trigliceridi ed i fosfolipidi delle HDL2, produce le HDL3
[177,178] e le β1 HDL di taglia più piccola [179].
La PLTP può ugualmente intervenire nei fenomeni di conversione delle HDL in assenza di altre frazioni lipoproteiche formando così delle HDL di grandi dimensioni e delle particelle di piccola taglia a partire da una popolazione di HDL intermedie [180-185].
La CETP favorendo il trasferimento degli esteri del colesterolo delle HDL verso le altre particelle lipoproteiche porta all’apparizione delle popolazioni di HDL di dimensioni differenti [186,187].
Questo fenomeno di conversione delle HDL tramite la CETP, che è stimolata dagli acidi grassi, può essere prodotta in assenza dei trasferimenti lipidici tra le HDL e le altre frazioni lipoproteiche [188,189]. È stato dimostrato che il trasferimento degli esteri del colesterolo delle HDL verso le altre lipoproteine è caratterizzato da un trasferimento equimolare di trigliceridi in senso inverso [190]. Il volume molecolare dei trigliceridi è di circa 1,5 volte superiore di quello degli esteri del colesterolo [191], la sostituzione degli esteri del colesterolo attraverso i trigliceridi nel cuore delle particelle lipoproteiche può spiegare l’aumento della taglia delle HDL3, osservato in
certi studi [192]. La formazione delle particelle di dimensioni più piccole può essere spiegata tramite il trasferimento degli esteri del colesterolo delle HDL verso le VLDL non associate a un trasferimento reciproco, mole per mole, dei trigliceridi sia per la dissociazione delle apoAI sulla superficie delle lipoproteine dopo il fenomeno della conversione [193] oppure ancora attraverso un meccanismo che implica la fusione delle particelle. In effetti, alcuni studiosi hanno recentemente dimostrato che la CETP,
35 favorendo la fusione di due particelle di HDL ricostituite (HDLr), porta alla formazione di un composto instabile che si riorganizza in tre particelle di taglia più piccola.
Distribuzione delle dimensioni delle LDL
La CETP gioca un ruolo nei cambiamenti della dimensione delle LDL [194-197]. In effetti gli studi effettuati in soggetti carenti in CETP mostrano che questi ultimi presentano delle LDL di dimensioni inferiori. Contrariamente, nel momento in cui la CETP è presente, essa permette la formazione, a partire delle LDL più piccole e dense, di una popolazione omogenea di dimmensione più grande trasferendo gli esteri del colesterolo dalle HDL o dei trigliceridi dalle VLDL verso le LDL. L’azione di idrolisi dei trigliceridi sulle LDL può portare alla formazione delle LDL di taglia più piccola.
Meccanismo d’azione e regolazione dell’attività della CETP
Tappa chiave della reazione di trasferimento degli esteri del colesterolo a. Modello cinetico
Il meccanismo cinetico che permette di spiegare il trasferimento dei lipidi neutri da un substrato all’altro è, attualmente, controverso. A tale riguardo, come osservato nella figura 3, sono stati proposti due modelli cinetici [198,199].
36
Figura 14: Modelli cinetici della reazione di trasferimento degli esteri dal colesterolo e trigliceridi, CETP-dipendenti.
In un primo modello (figura 14) la CETP agisce come una “navetta” che trasporta gli esteri del colesterolo e i trigliceridi tra le diverse frazioni lipoproteiche [200]. In questo caso, la CETP si lega con una lipoproteina donatrice alla superficie della quale capta una molecola lipidica neutra (CE) sul sito di legame. Essa si dissocia in seguito dalla HDL, si diffonde nel mezzo ed entra in contatto con una lipoproteina accettatrice (VLDL o LDL) con la quale scambia un’altra molecola lipidica neutra (TG). Nel secondo modello, osservato nella figura 4B, la CETP permette la formazione di un “complesso ternario”, che implica una lipoproteina donatrice ed una lipoproteina accettatrice [201,202]. In questa situazione, la cavità N-terminale della CETP penetra la superficie della lipoproteina HDL e forma un complesso binario in cui la CETP interagisce con il nucleo della lipoproteina dove sono presenti gli esteri del colesterolo. Il complesso binario interagisce poi con LDL o VLD tramite la cavità C-terminale della CETP per formare un complesso ternario costituito da HDL, CETP e LDL o VLDL. Le forze molecolari prodotte dalle lipoproteine alle due estremità della CETP causano nella molecola stessa una torsione molecolare che provoca la formazione di un tunnel attraverso il quale gli esteri del colesterolo e i trigliceridi vengono trasferiti dalle HDL alle LDL o VLDL. Il complesso ternario quindi si dissocia per formare particelle LDL/VLDL che si arricchiscono di CE e particelle di HDL che si impoveriscono di CE e diminuiscono di dimensioni. [203]. Era stato proposto un terzo modello, simile al secondo, che implica la presenza di un dimero
37 della CETP [204]. Sembra che la CETP si leghi alle HDL sotto forma di monomero e che in condizioni fisiologiche si trova sotto forma di monomero in soluzione [205]. È dunque poco probabile che il meccanismo del trasferimento dei lipidi neutri implichi la formazione di un dimero della CETP. Sembra che questi meccanismi (della “navetta” e del “complesso ternario”) non si escludano a vicenda. Il modello della “navetta” può spiegare gli scambi eterogeni degli esteri del colesterolo e trigliceridi tra le lipoproteine, mentre il modello del “complesso ternario” spiega la conversione delle HDL in particelle di taglia più piccola, povere in lipidi. In effetti, qualunque sia il meccanismo della CETP, è generalmente ammesso che lo scambio di lipidi neutri comprende due tappe principali:
Interazione della CETP con le particelle lipoproteiche. Il legame con i lipidi neutri.
b. Legame della CETP alle lipoproteine
La reazione di trasferimento dei lipidi implica un’associazione fisica tra la CETP ed i substrati lipoproteici [206]. In effetti, esiste una forte correlazione tra l’aumento del legame della CETP alle lipoproteine e l’attività di trasferimento [207]. Il legame tra la CETP, le VLDL e le LDL è più debole di quello presente tra la CETP e le HDL [208,209]. L’affinità della CETP per le lipoproteine è governata da interazioni elettrostatiche ed idrofile [210]. Si ritiene che queste interazioni possono interessare dei tripli legami di lisina (amminoacidi 377-379) carichi positivamente, presenti sulla superficie della CETP [211] oppure una sequenza carbossi-terminale Phe454-Leu455
-Leu456-Leu457. Attualmente si ritiene che il legame tra la CETP e le lipoproteine sia:
I residui Lys233 e Arg259 [212], carichi positivamente, presente sulla superficie
della CETP,
Ed i composti lipoproteici di superficie carichi negativamente (gruppo fosfato dei fosfolipidi, gruppo carbossilico degli acidi grassi non esterificati o i residui carichi negativamente delle molecole apolipoproteiche) [213].
Sembra che una carica elettronegativa ottimale sulla superfice della lipoproteina sia necessaria per ottenere un’interazione ottimale della CETP con il substrato lipoproteico e di conseguenza un’attività di trasferimento ottimale. È stato così
38 dimostrato che: modifiche della carica elettronegativa sulla superficie delle lipoproteine, l’accumulo degli acidi grassi durante la lipolisi attraverso variazioni del pH oppure delle modificazioni chimiche (succinalazione o acetilazione), modificano sia l’interazione tra la CETP e le lipoproteine sia l’efficacia della reazione di trasferimento. Considerando questi principi di interazione elettrostatica , possono essere proposti degli inibitori farmacologici della CETP [214].
c. Legame della CETP ai lipidi neutri
La CETP presenta un sito di legame dei lipidi neutri a livello dei 26 aminoacidi dalla sua porzione carbossi-terminale. In effetti, gli anticorpi TP2 che si legano a questo epitopo di 26 amminoacidi sono suscettibili ad inibire il trasporto lipidico sia bloccando il legame dei lipidi alla CETP sia creando un ingombro sterico locale [215]. Gli aminoacidi 454-457 oppure 470-475, che formano la parte carbossi-terminale della CETP, potrebbero fare parte di un sito di legame dei lipidi neutri direttamente implicati nel meccanismo di trasporto. L’elica carbossi-terminale ella CETP formerebbe una coda flessibile che penetrerebbe nelle lipoproteine dopo il legame con quest’ultimo. La faccia idrofobica dell’elica può allora entrare in contatto con una molecola lipidica neutra e legarsi in una tasca formata dall’elica carbossi-terminale e le regioni idrofobiche vicine. Sembra che a livello di queste tasche idrofobiche esiste un residuo di cisteina essenziale alla reazione di trasferimento [216]. Nella scimmia, esistono due siti specifici di legame dei trigliceridi e degli esteri del colesterolo [217]. Le modificazioni conformazionali, indotte dal legame di una molecola di estere del colesterolo sul sito di legame, impediscono l’accesso ai trigliceridi sul secondo sito e viceversa. Riassumendo, si possono constatare due tappe principali che permettono di esplicare la reazione di trasferimento degli esteri del colesterolo (figura15).
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Figura 15: Meccanismo di legame supposto tra le lipoproteine e la CETP.
In un prima tappa (tappa I), uno o più gruppi carichi positivamente, presenti sulla superficie della CETP, interagiscono con dei gruppi carichi negativamente (gruppi fosfato dei fosfolipidi, gruppi carbossilici degli acidi grassi non esterificati o carichi negativamente delle molecole apolipoproteiche), presenti sulla superficie della lipoproteina. Queste interazioni inducono dei cambiamenti conformazionali della CETP che permettono lo smascheramento di un sito di legame specifico per i lipidi neutri (tappa II) che possono così captare una molecola di estere del colesterolo o di trigliceride.
Fattori che modificano la reazione di trasferimento degli esteri del colesterolo
40 Oltre alla massa della CETP, diversi fattori plasmatici possono modificare l’attività di trasferimento. Il tasso di trasferimento degli esteri del colesterolo tra le HDL e le lipoproteine contenenti l’apoB sembra essere influenzato sia dalla concentrazione relativa che la concentrazione assoluta delle diverse frazioni lipoproteiche [218,219]. È stato dimostrato che il tasso di trasferimento degli esteri del colesterolo tra le HDL e le LDL aumenta parallelamente con la concentrazione in LDL [220-222] oppure in VLDL [223-225] per raggiungere un massimo al di là di un rapporto molare accettore/donatore di 2/1. All’opposto, l’aumento della concentrazione di HDL riduce il tasso di trasferimento degli esteri del colesterolo tra le HDL e le VLDL+LDL. In effetti, sembra che il rapporto lipoproteine donatrici (HDL) sulle lipoproteine accettatrici (VLDL o LDL) sia un fattore determinante nella regolazione dei fenomeni di trasferimento egli esteri del colesterolo poiché delle forti concentrazioni di HDL, in rapporto alle VLDL o alle LDL, possono totalmente sopprimere il trasporto degli esteri del colesterolo associato alle HDL verso le VLDL e le LDL [226]. Questa osservazione può spiegare perché la CETP non favorisce unicamente il trasferimento degli esteri del colesterolo dalle HDL verso altre frazioni lipoproteiche ma ugualmente tra differenti frazioni di HDL. Il complesso CETP/HDL è più stabile di quello che si forma con altre lipoproteine si può dunque prevedere che un aumento della concentrazione delle HDL aumenta la probabilità di trasferimento degli esteri del colesterolo, CETP-dipendente. La concentrazione in lipoproteine ricche in trigliceridi sembra ugualmente essere un fattore importante nella regolazione dell’attività della CETP, poiché un aumento del tasso di lipoproteine accettatrici ricche in trigliceridi porta ad un aumento del trasporto netto degli esteri del colesterolo a partire dalle HDL [227-229]. In vivo, nei soggetti normolipidemici, la concentrazione in VLDL plasmatica è un fattore limitante del trasporto massiccio degli esteri del colesterolo verso quello delle lipoproteine. All’opposto, nei soggetti affetti da ipertrigliceridemia che presentano un tasso elevato di VLDL plasmatiche, il fattore limitante è la massa della CETP. In altri termini, nei soggetti normolipidemici, dove la CETP è in eccesso, la disponibilità in trigliceridi (concentrazioni VLDL) limita il tasso del trasporto netto degli esteri del colesterolo mentre nei soggetti ipertrigliceridemici, dove la concentrazione in VLDL plasmatica è maggiore, il trasporto netto degli esteri del colesterolo è dipendente dalla massa della CETP.
