UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE VETERINARIE
Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
Valutazione ecografica della cisterna mammaria
in bovine sane in asciutta
Candidato: Relatori:
Alessio Pierattini Prof.ssa Micaela Sgorbini
Dott.ssa Francesca Bonelli
Alla mia famiglia, senza la quale non sarebbe stato possibile tutto questo
RIASSUNTO
Il periodo di asciutta permette l’involuzione del tessuto mammario e la sua rigenerazione, preparando le bovine alla successiva lattazione. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare ecograficamente le dimensioni della cisterna mammaria (CM) durante il periodo di asciutta. Sono state incluse 10 bovine di razza Frisona italiana, per un totale di 40 quarti, provenienti dal medesimo allevamento e management, in base ai seguenti criteri: 1) almeno un parto all’attivo; 2) asciugate mediante protocollo di messa in asciutta drastica; 3) assenza di mastite, o altre patologie, al momento della messa in asciutta e per tutta la durata dello studio. Per ciascun quarto la sonda convex (5 MHz) era posta subito cranialmente all’inserzione del capezzolo sulla mammella. La sonda era mantenuta prima parallelamente al capezzolo per una sezione longitudinale della CM, successivamente era ruotata di 90° per una sezione trasversale della CM. I soggetti sono stati valutati: il giorno della messa in asciutta (T0) e il giorno successivo (T1), poi con cadenze regolari fino al termine dell’asciutta (T7, T14, T21, T28, T38, T48, T58), nella fase colostrale (TCPP) e al settimo giorno di lattazione (T7PP). Il test di Kolmogorov Smirnov ha valutato la distribuzione dei dati. Il test di Spearman è stato applicato per valutare la correlazione fra le dimensioni ecografiche della CM (DECM) e i tempi di valutazione dell’asciutta. Il test di Friedman e il test di Dunn per le comparazioni multiple come post-hoc sono stati eseguiti per valutare le modificazioni delle DECM per i quarti anteriori (QAT) e posteriori nelle sezioni trasversali (QPT) e longitudinali (QAL e QPL) per i tempi T0 vs T58 vs TCPP vs T7PP. Valori per p<0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. Nessun soggetto ha sviluppato mastite o altre patologie durante il periodo di studio. La valutazione ecografica delle DECM è risultata facilmente eseguibile in campo. Era presente una correlazione lineare negativa statisticamente significativa tra il tempo e le dimensioni ecografiche della CM per QAT e QAL (r = -0.95; p<0.0004) e per QPT e QPL (r = -0.90; p<0.002). Il test di Friedman è risultato statisticamente significativo (p< 0.0001) rivelando che le DECM erano inferiori a T58, rispetto ai tempi di inizio asciutta e lattazione per QAT, QAL e QPT. T0 non differiva da TCPP. In letteratura non sono presenti altri studi che valutano le DECM dall’asciutta alla ripresa della lattazione. Studi sulla proliferazione cellulare della CM avevano evidenziato che l’involuzione cellulare raggiungeva un picco 25 giorni post asciutta, poi tendeva ad aumentare. Nel nostro studio, le DECM risultavano invece diminuire durante tutta l’asciutta ed aumentare solo alla ripresa della lattazione. Queste differenze potrebbero essere dovute a una discrepanza fra le caratteristiche proliferative cellulari del tessuto mammario della CM e la sua traduzione in dimensioni macroscopiche e valutabili ecograficamente. In conclusione, la tecnica di valutazione delle DECM durante la fase di asciutta in bovine sane è facilmente fruibile in campo. Le informazioni da essa derivanti potrebbero essere utilizzate per il monitoraggio del corretto andamento dell’asciutta.
Parole chiave: bovina da latte; asciutta; ecografia; cisterna mammaria; dimensioni ecografiche. ABSTRACT
In dairy cows, the dry period allows the preparation of the mammary gland for the next lactation. The aim of this study was to evaluate the udder cistern (UC) size during the dry period by the ultrasound technique. Ten Italian Friesian cows were included, for a total of 40 quarters. All the cows underwent the same management condition. The following inclusion criteria were set: 1) no heifer; 2) abruptly drying-off; 3) no mastitis, or other diseases, at the time of drying-off and during the whole study. For each quarter the convex probe (5 MHz) was placed immediately cranial to the insertion of the teat on the udder. The probe was first held parallel to the teat for a longitudinal section of the UC, then a 90° rotation was applied in order to obtain a UC cross section. All the animals were evaluated at the drying-off (T0), at the day after drying-off (T1), then regularly until the end of the dry period (T7, T14, T21, T28, T38, T48, T58), during the colostral production phase (TCPP) and at the seventh day of lactation (T7PP). Data distribution was evaluated by the Kolmogorov Smirnov test. The Spearman test was applied in order to evaluate the correlation between ultrasonographic UC size (UUCS) assessment and time. The Friedman test and the Dunn test for multiple comparisons as post-hoc were performed to compare UUCS of the forequarters (QACS) and posterior quarters in the cross sections (QHCS) and for the longitudinal section of forequarters and hindquarters (QAL and QHL) at T0 vs T58 vs TCPP vs T7PP. Values for p <0.05 were considered statistically significant. No subject developed mastitis or other diseases during the study period. The ultrasound evaluation of the UUCS was easy to perform in field conditions. There was a statistically significant negative linear correlation between the time and the UUCS for QACS and QAL (r = -0.95; p <0.0004) and for QHCS and QHL (r = -0.90; p <0.002). The Friedman test was statistically significant (p <0.0001), showing that the UUCS at T58 were lower, compared to other times for QACS, QAL and QHCS. T0 did not differ from TCPP. No studies can be found in literature evaluating the UUCS during the dry period. Studies on UC cellular proliferation showed that the UC cellular involution during dry period peaked 25 days after the dry-off. UC cellular proliferation then increased until the beginning of the next lactation. In our study, the UUCS decreased throughout the whole dry period and started to increase at the beginning of the next lactation. This difference could be due to a discrepancy between the UC cellular proliferative and the ultrasonographic evaluation of the UC. In conclusion, the technique of UUCS assessing during the dry period in healthy cows was feasible for field conditions. UUCS might give useful information for the udder dry period monitoring.
Indice
RIASSUNTO ... 3
CAPITOLO 1 – DEFINIZIONE E STORIA DELL’ASCIUTTA ... 7
1.1 DEFINIZIONE E STORIA DELL’ASCIUTTA ... 7
1.2 L’INVOLUZIONE DELLA GHIANDOLA MAMMARIA DURANTE IL PERIODO DI ASCIUTTA ... 9
1.3 RUOLO DELL’ASCIUTTA NELLA PREVENZIONE DELLE MASTITI ... 12
CAPITOLO 2 – STATO DELL’ARTE SULL’ECOGRAFIA DELLA MAMMELLA NEI RUMINANTI ... 16
2.1 BOVINA ... 16
2.1.1MORFOLOGIA ECOGRAFICA E DIMENSIONI ECOGRAFICHE DELLA CISTERNA MAMMARIA ... 16
2.1.2VALUTAZIONE QUALITATIVA DELLA CISTERNA MAMMARIA ... 17
2.1.3VALUTAZIONE DELL’ECOGRAFIA DELLA CISTERNA MAMMARIA IN RELAZIONE ALLA PRODUZIONE DI LATTE .... 18
2.1.4VALUTAZIONE ECOGRAFICA DELLA CRESCITA DELLA MAMMELLA ... 19
2.1.5VALUTAZIONE DELLE MODIFICAZIONI ECOGRAFICHE DELLA MAMMELLA DURANTE LA MUNGITURA. ... 22
2.1.6VALUTAZIONE ECOGRAFICA DELLA MAMMELLA E MASTITI. ... 23
CAPITOLO 3 – SCOPO ... 26
CAPITOLO 4 - MATERIALI E METODI ... 27
4.1 ANIMALI ... 27
4.1.1COMITATO ETICO E CONSENSO INFORMATO ... 27
4.1.2ANIMALI E MANAGEMENT DI ALLEVAMENTO ... 27
4.2 CRITERI DI INCLUSIONE ... 30
4.3.1DATI RACCOLTI PER CIASCUN SOGGETTO INCLUSO NELLO STUDIO ... 31
4.3.2ESAME CLINICO ... 31
4.3.3PROTOCOLLO DI MESSA IN ASCIUTTA ... 32
4.3.4TECNICA ECOGRAFICA ... 35
4.3.4.1TIPO DI ECOGRAFO E SONDA ECOGRAFICA ... 35
4.3.4.2TECNICA DI MISURAZIONE ECOGRAFICA DELLA CISTERNA MAMMARIA ... 35
4.3.4.3TEMPI DI VALUTAZIONE ... 36
4.3.4.4MISURAZIONI ... 37
4.3.5SCREENING PER LA PRESENZA DI MASTITI CLINICHE O SUBCLINICHE NEL POST-PARTUM ... 38
4.3.6ANALISI STATISTICA ... 38
CAPITOLO 5 – RISULTATI ... 40
5.1 ANIMALI INCLUSI ... 40
5.2 VALUTAZIONI LEGATE ALLA MESSA IN ASCIUTTA ... 40
5.2.1VALUTAZIONE DEL CAPEZZOLO ... 40
5.2.2VALUTAZIONE DEI CMT E DELLE CELLULE SOMATICHE ALLA MESSA IN ASCIUTTA E ALLA RIPRESA DELLA LATTAZIONE ... 41
5.3 TECNICA ECOGRAFICA ... 41
5.4 MISURAZIONI ... 43
CAPITOLO 6 – DISCUSSIONI ... 46
CAPITOLO 1 – DEFINIZIONE E STORIA DELL’ASCIUTTA
1.1 DEFINIZIONE E STORIA DELL’ASCIUTTA
Il termine “asciutta” viene coniato per descrivere il periodo che si interpone tra la fine della lattazione ed il parto della vacca, per essa si intende il momento in cui un animale che produce latte è indotto “artificialmente” a cessare questa produzione (Arnold e Becker, 1936). Il passaggio dalla fase di lattazione a quella di asciutta in un allevamento correttamente gestito si ha intorno ai 305 giorni di mungitura, che corrispondono al 7° mese di gravidanza (Santschi et al., 2011). Questo periodo della durata di 60 giorni ha lo scopo di preparare la mammella della vacca alla lattazione successiva e quindi è considerato “di riposo” (Capuco et al., 1997; Annen et al., 2004). La lunghezza ottimale del periodo di asciutta però è stata, ed è tutt’ora, un argomento controverso tra le parti coinvolte e non si è ancora giunti ad una decisione definitiva in merito (Annen e Collier, 2005). In letteratura, sono stati valutati lunghi periodi di asciutta, fino alle 23 settimane, che tuttavia non sfruttano tutti i benefici di una asciutta di 60 giorni (Capuco et al., 1997); dal lato opposto, un’asciutta con una durata inferiore ai quaranta giorni, significa sovrapporre la fase di involuzione con la successiva fase di sviluppo mammario pre-parto. (Hurley et al., 1989).
Sin dagli inizi del 900 si è arrivati alla conclusione che la cessazione della mungitura al settimo mese di gravidanza fosse la migliore scelta per massimizzare la produzione di latte nella lattazione successiva, bilanciando così i costi di mantenimento di un soggetto non-produttivo, con i benefici di una ripresa vigorosa e duratura della produzione di latte
(Arnold e Becker, 1936). Bachman e Schairer (2003) illustrano i risultati degli studi sulla valutazione della durata del periodo di asciutta, che sono stati eseguiti tra il 1936 e il 1996. Gli autori riferiscono che con una lunghezza della fase di asciutta compresa tra 40-60 giorni, risulterebbe una migliore produzione di latte per la successiva lattazione (Coppock et al.,1974; Rémond et al., 1992; Makuza e McDaniel, 1996).
Ad oggi 60 giorni di asciutta sono il periodo di tempo più utilizzato dagli allevatori di bovini da latte in tutto il Mondo (Capuco et al., 1997; Annen et al., 2004a,b). Non mancano, tuttavia, studi che mirino a valutare una modifica di questi tempi, rispondendo da un lato alla ricerca della migliore fisiologia per la mammella e l’animale nel suo complesso, dall’altro alla pressione economica e produttiva crescente nell’allevamento di bovini da latte (Remond et al., 1997; Bachman, 2002; Annen et al., 2004a, 2007; Andersen et al., 2005; Rastani et al., 2005; Fitzgerald et al., 2007; Pezeshki et al., 2007, 2008).
1.2 L’INVOLUZIONE DELLA GHIANDOLA MAMMARIA DURANTE IL PERIODO DI ASCIUTTA
La lattazione dipende dalla presenza del vitello o dalla regolare mungitura giornaliera: senza questi stimoli, la secrezione di latte da parte delle ghiandole scompare e si ha l’inizio dell’involuzione mammaria (Capuco et al., 1999). Tale involuzione, negli animali da produzione come le vacche, è rallentata e differisce rispetto alle altre specie, ad esempio i roditori.
I cambiamenti morfologici del tessuto mammario nelle vacche da latte durante il periodo di asciutta riflettono più strettamente un cambiamento nello stato di secrezione della ghiandola mammaria, che una perdita di cellule e relativa regressione dei tessuti. La struttura alveolare del tessuto mammario bovino, infatti, rimane generalmente intatta durante un tipico periodo di asciutta (Holst et al., 1987; Wilde et al., 1997). Nelle vacche da latte l’area luminale del tessuto mammario raggiunge la massima involuzione, in termini di dimensioni, al venticinquesimo giorno di asciutta, mentre l’area stromale si trova nella dimensione massima. (Capuco et al., 1997).
E’ stato dimostrato che le cellule dell’epitelio mammario dei ruminanti non regrediscono nella stessa misura di altre specie, come ad esempio i roditori, e apparentemente molte attività sintetiche e secretorie di queste cellule sono mantenute per tutto il periodo di asciutta (Holst et al., 1987; Sordillo, 1987; Sordillo e Nickerson, 1988). A conferma di ciò, alcuni studi hanno evidenziato che, mentre durante le prime due settimane di involuzione mammaria nel ratto e nel topo si assiste ad una desquamazione delle cellule epiteliali apoptotiche del lume alveolare e il loro conseguente distacco dalla membrana basale, ciò non avviene nelle vacche da latte durante il periodo di asciutta (Sordillo e Nickerson,
1988; Hurley, 1989; Capuco et al., 1997). Nella vacca, si ha un aumento sia degli indici di proliferazione, che di quelli di apoptosi cellulare entro i primi 10 giorni dall’inizio del periodo di asciutta (Capuco et al., 2006). In particolare, l’apoptosi cellulare è indotta dal latte accumulato all’asciugatura (Quarrie et al., 1996; Wilde et al., 1997; Capuco et al., 2006) ed aumenta fino a raggiungere un picco durante le prime 72 ore dopo l’asciugatura (Annen e Collier, 2005). Continua poi per tutta la tarda gestazione e l’iniziale lattazione, raggiungendo un secondo picco durante la prima settimana dopo il parto (Annen et al., 2007). La proliferazione delle cellule dell’epitelio mammario, invece, aumenta in corrispondenza, o subito dopo, il picco iniziale di apoptosi (Annen e Collier, 2005).
Le ricerche condotte hanno evidenziato che nel corso di un periodo standard di asciutta non si ha un’elevata perdita complessiva di cellule mammarie, mentre risulta abbondante il rimodellamento tissutale, compresi i cambiamenti delle popolazioni cellulari e delle strutture alveolari, e la sintesi della matrice extracellulare si verifica ampiamente (Holst et al., 1987; Hurley, 1989; Capuco et al., 1997). In conclusione, durante il periodo di asciutta avviene un ampio turnover cellulare e il numero di cellule epiteliali aumenta rapidamente durante gli ultimi due mesi di gestazione (Capuco et al., 1997).
Un altro fattore da tenere in considerazione riguardo l’involuzione della ghiandola mammaria bovina è che nell’allevamento da latte intensivo avviene una sovrapposizione fra la lattazione e la gravidanza successiva. Le bovine da latte sono generalmente già gravide di sette mesi alla cessazione della mungitura, ossia alla messa in asciutta. E’ molto probabile che l’aumento del turnover delle cellule mammarie durante il periodo di asciutta sia una conseguenza della cessazione della lattazione e della gravidanza concomitante (Capuco et al., 2006). La gravidanza stimola, infatti, lo sviluppo mammario e il processo di formazione del latte e ciò tenderebbe a controbilanciare l’apoptosi indotta
dal latte accumulato all’asciugatura, mantenendo così in equilibrio la complessiva proliferazione e apoptosi cellulare (Capuco et al., 2006). La conclusione a cui gli studiosi sono giunti è che la concomitanza della gravidanza al periodo di asciutta opporrebbe gli stimoli necessari ad evitare un’involuzione mammaria completa durante il periodo di asciutta. A conferma di ciò è stato dimostrato che la ghiandola mammaria di vacche da latte non gravide subisce una più vasta distruzione della struttura lobulare-alveolare dopo l’asciugatura, inficiandone le caratteristiche produttive successive (Leitner et al., 2007). Il processo di contemporaneo rinnovamento cellulare e rimodellamento tissutale che avviene in seguito all’asciugatura con una gravidanza concomitante è stato di conseguenza definito 'involuzione rigenerativa' (Capuco et al., 2003).
1.3 RUOLO DELL’ASCIUTTA NELLA PREVENZIONE DELLE MASTITI
L'importanza del periodo di asciutta nelle dinamiche delle infezioni intramammarie (Intra-Mammary Infections: IMI) nelle bovine da latte è stato studiato per molti anni. Il periodo di asciutta gioca un ruolo importante per le strategie di controllo delle mastiti negli allevamenti da latte (Neave et al., 1950; Smith et al., 1985a; Smith et al., 1985b; Oliver e Sordillo, 1988; Burvenich et al., 2003), perché molte IMI si sviluppano durante il periodo di asciutta e si presentano quindi durante la lattazione successiva causando spesso mastiti cliniche (Hogan e Smith, 2003; Sordillo, 2005).
Il tasso di IMI non è costante in tutto il periodo di asciutta (Smith et al., 1985a; Bradley e Green, 2004). I dati clinici e sperimentali supportano il concetto che la ghiandola mammaria della bovina sia più sensibile alla nuova IMI durante l’inizio (asciugatura) e la fine (colostrogenesi) del periodo di asciutta (Kehrli e Shuster, 1994; Burvenich et al., 2000, 2007; Sordillo e Streicher, 2002). L'aumento dei tassi di IMI in questi due periodi di transizione potrebbe essere attribuibile ai cambiamenti dei fattori protettivi naturali e dei fattori antibatterici, all'anatomia e alla fisiologia della punta del capezzolo, e al grado di esposizione agli agenti patogeni responsabili della mastite (Comalli et al., 1984; Oliver e Sordillo, 1989). Insieme ai cambiamenti istologici, avverrebbero significativi cambiamenti anche nella composizione chimica e cellulare delle secrezioni mammarie (Breau e Oliver, 1985; Bushe e Oliver, 1987; Sordillo e Nickerson, 1988; Athie et al., 1996). Subito dopo la cessazione della lattazione si ha, infatti, l’inizio della secrezione di importanti componenti del sistema immunitario innato e acquisito (Clarkson et al., 2004; Stein et al., 2004). Le concentrazioni di queste molecole nel latte aumentano per le prime 2 settimane dopo la
cessazione della lattazione, per poi diminuire e rimanere stabili durante gran parte del periodo successivo, fino al parto e alla ripresa della lattazione (Jensen e Eberhart, 1981; McDonald e Anderson, 1981; Miller et al., 1990). Le concentrazioni di grassi, citrato, caseine e lattosio, invece, diminuiscono, ma questi cambiamenti si verificano sempre nelle prime settimane di messa in asciutta. Dopo questo momento non si assiste a grosse modificazioni nella ghiandola mammaria fino al parto (Oliver e Bushe, 1987; Sordillo, 1987; Sordillo e Nickerson, 1988). La riduzione del volume della ghiandola mammaria e la stabilizzazione delle variazioni della sua secrezione rende la mammella particolarmente resistente alle nuove IMI durante la parte centrale del periodo di asciutta (Burvenich et al., 2007), in particolare per i batteri gram negativi (Oliver e Mitchell, 1983; Breau e Oliver, 1986). La lattoferrina, la principale proteina presente nelle secrezioni mammarie durante questo periodo, è un’importante componente inibitoria contro i coliformi (Oliver e Bushe, 1987; Rejman et al., 1989; Goff e Horst, 1997; Burvenich et al., 2007).
Al momento del parto, invece, si hanno basse concentrazioni di componenti antibatterici (fagociti e lattoferrina), cellule somatiche e albumina sierica, ma alte concentrazioni di caseina, lattosio, e citrato (Nonnecke e Smith, 1984; Breau e Oliver, 1986; Oliver e Sordillo, 1988). Sempre in questa fase la concentrazione di immunoglobuline raggiunge il suo massimo livello (Sordillo e Streicher, 2002). La maggior parte delle IgG nelle secrezioni mammarie è di origine umorale, considerando che le IgA e le IgM sono prodotte localmente (Lascelles, 1979). Approssimativamente, il 90% di tutte le immunoglobuline del colostro che sono trasferite ai vitelli è di tipo IgG1 e IgG2. Anche se le concentrazioni di IgG1 (924.3 mg/dl) e IgG2 (1330.4 mg/dl) nel sangue bovino sono equivalenti (Burton et al., 1991), le IgG1 nel colostro sono in concentrazione molto più elevata rispetto alle IgG2: 50-90 g/l vs 1.5-2 g/l, rispettivamente (Elfstrand et al, 2002) e l'alta concentrazione di
IgG1 è una proprietà unica del colostro. Le IgG2 potrebbero giocare un importante ruolo nella opsonizzazione e fagocitosi batterica dei PMN e dei PMN citotossici anticorpo-dipendenti (Butler, 1983; Detilleux et al., 1994). L’aumento delle concentrazioni di immunoglobuline in prossimità del parto cesserebbe con l'insorgenza di un’abbondante secrezione mammaria e con l'accumulo di secrezioni nella ghiandola stessa. Ciò diminuirebbe l’attività opsonizzante delle componenti immunitarie durante l'ultima settimana di gestazione e potrebbe essere motivo della ridotta capacità fagocitaria dei macrofagi e dei PMN durante questa fase (Craven e Williams, 1985; Smith et al., 1985b). Inoltre, in seguito ad un’ingestione indiscriminata di grassi e caseina, la fagocitosi e la batteriolisi intracellulare dei PMN sono inibite durante il periodo della colostrogenesi (Russell e Reiter, 1975; Russell et al., 1976; Paape e Guidry, 1977).
Viste queste premesse, diversi autori hanno indagato l’influenza che un accorciamento del periodo dell’asciutta potrebbe avere sull’incidenza di IMI. In favore di una diminuzione della durata della fase di asciutta, alcuni studi hanno dimostrato che i fattori protettivi naturali della mammella erano presenti in basse concentrazioni nelle secrezioni mammarie di ghiandole che producevano grandi quantità di latte durante la tarda lattazione (Smith et al., 1985b; Breau e Oliver, 1986). Accorciando la durata classica dell’asciutta, si potrebbe ottenere un volume di latte inferiore all’asciugatura. Pertanto, le concentrazioni di grassi, caseina, lattosio, e citrato, che sono alte in questo momento e che interferiscono con le difese naturali della mammella (Craven e Williams, 1985; Breau e Oliver, 1986; Hurley e Rejman, 1986), potrebbero a loro volta ridursi. Un volume di latte troppo elevato al momento dell’asciugatura rappresenta un terreno eccellente per la crescita dei batteri e può causare, inoltre, un aumento della pressione intramammaria
con perdite di latte dai capezzoli e penetrazione batterica nel canale (Cousins et al., 1980; Smith et al., 1985b; Breau e Oliver, 1986; Burvenich et al., 2007).
Oltre alla riduzione della durata del periodo di asciutta, è stato anche proposto di mungere le vacche fino al parto per rimuove l'immunodeficienza causata dall’accumulo di latte all’asciugatura. La letteratura che tratta l'effetto della mungitura continua sul contenuto di IgG e di proteine nel colostro ha risultati controversi. Alcuni autori sostengono che la mungitura continua abbia un impatto negativo sul contenuto delle IgG e delle proteine nel colostro (Brandon e Lascelles, 1975; Remond et al., 1997; Rastani et al., 2005), altri smentiscono questo concetto (Annen et al., 2004a). La discussione scientifica sul tema della durata del periodo di asciutta e sulla sua eliminazione è ancora in atto.
CAPITOLO 2 – STATO DELL’ARTE SULL’ECOGRAFIA DELLA MAMMELLA NEI
RUMINANTI
2.1 BOVINA
2.1.1 Morfologia ecografica e dimensioni ecografiche della cisterna mammaria
In letteratura sono descritte diverse metodiche per la valutazione ecografica della cisterna mammaria (CM) della mammella bovina. La tecnica principale prevede l’apposizione diretta, per mezzo di gel ecografico, di una sonda ecografica sulla mammella dell’animale in esame (Fasulkov et al., 2012). Per eseguire questa metodica viene consigliato l’utilizzo di trasduttori a bassa frequenza (3.5-5MHz) di tipo lineare, settoriale o convex (Cartee et al., 1986; Trostle & О’Brien, 1998; Flöck & Winter, 2006; Fasulkov et al., 2012). La scansione deve essere eseguita ponendo la sonda cranialmente all’inserzione del capezzolo sulla mammella, parallela e vicina ad esso, puntando in direzione della CM (Ayadi et al., 2002). Questa tecnica permette di visualizzare la CM in maniera semplice e veloce senza usare mezzi di interposizione. La CM viene visualizzata come una struttura di pattern anecoico circondato da pattern ecoico. Il primo rispecchia la visualizzazione ecografica del latte raccolto all’interno della CM, mentre il pattern ecoico rappresenta il parenchima mammario (Ayadi et al., 2002). In uno studio condotto da Ajadi e colleghi (2002) in bovine frisone sane a differenti fasi di lattazione, l’area della
CM dei quarti posteriori risultava di dimensioni maggiori rispetto a quella degli anteriori. Nel lavoro, tuttavia, non erano rilevate differenze significative tra quarti destro e sinistro.
Un metodo alternativo viene descritto da Bruckmaier e colleghi (1994) che hanno valutato il capezzolo e la CM in 10 vacche frisone in differenti fasi di lattazione. Per lo studio utilizzavano una sonda lineare da 5 MHz. La tecnica sviluppata dai colleghi prevedeva l’immersione della mammella in un contenitore pieno d’acqua e il posizionamento del trasduttore lateralmente alla mammella. Questa tecnica, mirata alla visualizzazione più del capezzolo che della CM, presentava però lo svantaggio di non poter visualizzare per intero la CM, di necessitare dell’aiuto di un secondo operatore e, utilizzando l’acqua come mezzo di interposizione, di poter favorire la contaminazione da parte di agenti batterici potenzialmente mastidogeni (Fasulkov et al., 2012).
2.1.2 Valutazione qualitativa della cisterna mammaria
L’ecogenicità della ghiandola mammaria è direttamente correlata al volume e allo stato di replezione della stessa. Sia utilizzando il metodo proposto da Ajadi e colleghi (2002), che quello valutato da Bruckmaier e colleghi (1994), il parenchima mammario è visibile come una struttura omogeneamente ipoecoica in cui sono presenti aree anecogene di dimensioni differenti, indicative della presenza della CM, dei dotti lattiferi e dei vasi sanguigni. Il latte contenuto nella cisterna e nei dotti, seppur anecoico, può presentare degli spot iperecogeni (Cartee et al., 1986; Flöck & Winter, 2006; Franz et al., 2009). A
conoscenza degli autori, non sembrano essere riportati in letteratura scores o descrizioni di particolari pattern per la descrizione qualitativa della CM nella bovina da latte.
2.1.3 Valutazione dell’ecografia della cisterna mammaria in relazione alla produzione di latte
La conoscenza delle caratteristiche anatomiche e funzionali della mammella bovina risulta fondamentale per capire il meccanismo di produzione del latte ed ha potenziali implicazioni per il funzionamento della mungitura meccanica. A livello mammario lo stoccaggio del latte è extra cellulare all’interno di due distinti compartimenti: il latte alveolare, stoccato a livello del parenchima alveolare, è ottenibile solo tramite riflesso di eiezione, mentre il latte cisternale, che rappresenta invece il latte proveniente dagli alveoli e stoccato nei dotti lattiferi e nelle CM e del capezzolo, è prontamente disponibile (Wilde et al., 1996).
Vacche ad alta produzione con CM più grandi producono più latte e sono tolleranti ad intervalli di mungitura più ampi (Wilde et al., 1996; Dewhurst & Knight, 1994). Esiste poi una correlazione positiva tra la grandezza della cisterna e l’ormone inibitorio della secrezione di latte (Wilde et al., 1996). Differenti studi hanno valutato il possibile utilizzo dell’ecografia della CM in relazione alla quantità di latte prodotto.
Ayadi e colleghi (2002), mediante la tecnica ecografica descritta nel capitolo 2.1.1 trovavano, in 4 vacche frisone sane in differenti fasi di lattazione, le eventuali correlazioni riscontrando che esiste una correlazione positiva tra area della CM e quantità di latte prodotto.
Usando il metodo di valutazione ecografica proposto da Ajadi (2002), Caja e colleghi (2004) hanno condotto uno studio su 18 frisone a differenti fasi di lattazione, valutando ecograficamente la CM 12h dopo la mungitura giornaliera. Essi hanno trovato una correlazione positiva tra la quantità di latte cisternale prodotta e l’area ecografica della cisterna, come precedentemente validato da Ajadi. Lo studio evidenziava come, con l’avanzare dello stadio di lattazione, i volumi di latte alveolari e cisternali e l’area ecografica della CM diminuissero (Caja et al., 2004). La regressione della CM risultava più evidente rispetto a quella delle altre strutture. Lo studio trovava una correlazione positiva tra lo stadio di lattazione e l’area ecografica della CM, provando che l’area della CM diminuiva con l’avanzare della lattazione (Caja et al., 2004).
2.1.4 Valutazione ecografica della crescita della mammella
Gli studi che riguardano lo sviluppo della ghiandola mammaria spesso richiedono procedure invasive come la biopsia per un’analisi istopatologica dei tessuti e frequentemente terminano con l’eutanasia dei soggetti coinvolti (Albino et al., 2017). In letteratura è stato proposto che l’ecografia possa rappresentare un metodo valido e non invasivo, alternativo alle procedure prima descritte (Albino et al., 2017).
Da un punto di vista anatomico e fisiologico, lo sviluppo della ghiandola mammaria si suddivide in diverse fasi che iniziano a partire dalla nascita della bovina e si articolano lungo le varie fasi produttive di questo animale (Albino et al., 2017; Nishimura et al., 2010). È stato ampiamente dimostrato che i cambiamenti maggiori si verificano durante la pubertà e la gravidanza (Albino et al., 2017; Nishimura et al., 2010). La ghiandola
mammaria pre gravidanza consta di due tipi di tessuti: il tessuto epiteliale con elementi stromali intorno, chiamato parenchima mammario, e il tessuto stromale adiacente al parenchima, ma che non contiene strutture epiteliali e che risulta costituito per la maggior parte da connettivo e tessuto adiposo (Esselburn et al., 2015). La ghiandola mammaria post gravidanza presenta invece parenchima mammario senza la presenza del tessuto adiposo, sostituito dalla presenza della CM repleta di latte (Esselburn et al., 2015; Albino et al., 2017).
In animali la cui carriera è basata sulla produzione di latte, è stata indagata la valutazione ecografica dell’evoluzione mammaria come mezzo per una potenziale stima su quella che potrebbe essere la produzione di latte di quel soggetto (Strzetelski et al., 2004; Nishimura et al., 2010). Nishimura e colleghi (2010) hanno analizzato la differenza nello sviluppo mammario di 25 bovine a differenti stati di sviluppo eseguendo un’ecografia della CM con sonda convex da 5 MHz. Le misurazioni dell’area occupata dal tessuto adiposo sono state eseguite a due mesi e cinque mesi di età, subito dopo la pubertà, a metà e a fine gravidanza. Lo sviluppo dei quarti è risultato omogeneo tra quelli anteriori e quelli posteriori. Nei primi mesi post nascita, lo studio ha evidenziato una crescita isometrica rispetto al corpo e un parenchima mammario prevalentemente costituito da grasso (Nishimura et al., 2010). All’ecografia, la mammella si presentava con strutture ipoecogene poco definite contornate da una banda iperecogena, identificate come parenchima mammario. Intorno ai tre mesi di vita, continuando poi fino alla pubertà, la crescita esterna della mammella diviene allometrica, cioè più veloce rispetto al corpo. Con l’avvento della pubertà, grazie all’incremento della produzione di estrogeni, oltre allo sviluppo allometrico esterno, si ha proliferazione ghiandolare. All’ecografia, l’area
ipoecogena diventa più definita e non è più visualizzabile la banda iperecogena di contorno che era presente nelle vitelle giovani. Dal primo trimestre di gravidanza in poi il grasso incomincia a diminuire, lasciando spazio allo sviluppo massivo di alveoli e lobuli: all’ecografia si apprezzano i primi dotti lattiferi e l’area ipoecogena risulta notevolmente più ampia rispetto a manze della stessa età non gravide. Lo sviluppo dei seni lattiferi alla base del capezzolo risulta molto più profondo nelle manze gravide rispetto alle vitelle post pubertà e la densità del tessuto mammario aumenta man mano che la gravidanza progredisce.
Albino (2017) propone l’uso dell’ecografia come tecnica non invasiva per la stima del parenchima mammario nelle vitelle prepuberi. In questo studio, lo sviluppo mammario è stato indagato in 18 vitelle frisone prepuberi alimentate con 3 diete diverse, in particolare un gruppo con una razione di mantenimento, un gruppo con una razione ricca di energia e un terzo gruppo con una razione povera di energia (Albino et al., 2017). Gli animali oggetto dello studio erano poi macellati subito post ecografia al fine di valutare la mammella post mortem. L’ecografia è stata eseguita in vivo mediante l’apposizione diretta della sonda senza l’utilizzo di gel sulla faccia laterale della mammella con sonda micro convex da 6.5 MHz misurando l’area del tessuto adiposo presente all’ecografia circondato da parenchima (Albino et al., 2017).
L’esperimento evidenziava una correlazione tra i risultati ottenuti ecograficamente e l’analisi istopatologica eseguita post mortem sui singoli quarti, proponendo quindi l’ecografia come metodo alternativo non invasivo per valutare lo sviluppo mammario (Albino et al., 2017). Lo studio ha inoltre trovato una correlazione fra una dieta ricca di energia e uno sviluppo mammario precoce, aprendo le porte al potenziale utilizzo del
monitoraggio ecografico come metodo non invasivo per la selezione di razioni migliori e manze più produttive (Albino et al., 2017).
2.1.5 Valutazione delle modificazioni ecografiche della mammella durante la mungitura.
Ajadi (2002) ha eseguito un’indagine ecografica su 4 bovine di razza frisona tramite contatto diretto tra la sonda ecografica e la mammella. Lo studio aveva lo scopo di valutare la produzione di latte rispetto alle dimensioni della CM, a differenti intervalli post mungitura. La tecnica ecografica per la visualizzazione della CM è stata descritta nel capitolo 2.1.1. Le valutazioni erano eseguite post mungitura ad intervalli di 4-8-12-16-20-24 ore dopo la mungitura giornaliera. Era inoltre effettuata la somministrazione di Atosiban, un agente bloccante i recettori dell’ossitocina (Tractocile®), alla dose di 10 mg/kg peso vivo al fine di prevenire l’eiezione di latte prima della valutazione ecografica (Ajadi et al., 2002). Il lavoro di Ajadi (2002) evidenziava come la cisterna mammaria si riempisse fino alle 16 ore post mungitura per poi assistere ad un plateau fino alle 24 ore post mungitura. Le aree delle CM dei quarti posteriori risultavano di dimensioni maggiori rispetto a quelle degli anteriori e le vacche con CM più grandi risentivano meno del fattore inibente lattazione (FIL), come precedentemente descritto in letteratura (Ajadi et al., 2002). Individuando l’ecografia come un ottimo metodo non invasivo per la determinazione delle caratteristiche di stoccaggio di latte e per valutare la CM post mungitura, l’autore proponeva che l’intervallo migliore in cui effettuare la valutazione ecografica fosse quello di otto ore post mungitura, rendendo così possibile attuare
differenti strategie di mungitura a seconda di avere vacche con piccole o grosse cisterne e che quindi risentono più o meno del FIL (Ajadi et al., 2002).
Caja (2004) ha investigato quello che viene definito in letteratura “cisternal recoil”, ovvero il fenomeno di riassorbimento del latte cisternale grazie all’elasticità intrinseca della mammella. Se alla stimolazione del riflesso di eiezione del latte della mammella non faceva seguito la mungitura, infatti, il latte che si era accumulato nella parte cisternale della mammella veniva riassorbito dalla parte alveolare (Caja et al., 2004). Nello studio erano somministrati 5 UI di ossitocina EV pre valutazione ecografica per stimolare l’accumulo di latte cisternale e valutare l’area della cisterna pre iniezione e post iniezione ad intervalli di 0-3-15-30-60 min. (Caja et al., 2004). Lo studio evidenziava che l’area massima post iniezione veniva rilevata al minuto 3, con un aumento dell’area del 98% rispetto alla precedente senza iniezione di ossitocina. L’area cisternale regrediva significativamente poi fino ai 15 min., che risultava essere il tempo necessario alla mammella per rilassarsi (Caja et al., 2004).
2.1.6 Valutazione ecografica della mammella e mastiti.
Flöck & Winter (2006) descrivono il parenchima di una mammella sana come una struttura omogenea ecogena con la presenza di vasi sanguigni e dotti lattiferi anecogeni. Nel loro studio analizzano, nell’arco di quattro anni, 52 vacche con malattie solo a carico della mammella o generali ma che si ripercuotono poi sull’apparato mammario. Usando un ecografo (Esaote®) con sonda convex da 5 MHz, categorizzano in 7 gruppi le aberrazioni riscontrate all’ecografia:
• 0 = pattern fisiologico, omogeneo, ecogenicità media con isolati dotti lattiferi anecogeni;
• 1 = pattern non omogeneo ed iperecoico;
• 2 = presenza di ascessi, rotondi di varia grandezza con capsula e contenuto ipoecogeno;
• 3 = pattern non omogeneo con zone iperecoiche e presenza di formazioni di gas; • 4 = presenza di ematomi, con celle riempite di fluido ipoecoico;
• 5 = pattern non omogeneo ed ipoecoico;
• 6 = pattern con spot ipoecoici, rotondi di un cm con un centro di alta densità ecogenica.
L’immagine ecografica della mammella, in caso di mastiti, dipende dal grado di cambiamento delle sue strutture interne. Trostle e O Brien (1998) documentano un pattern ipoecoico non omogeneo in caso di mastite acuta ed un pattern iperecoico quando la mastite si fa cronica, con presenza di fibrosi. Al contrario, Flock & Winter (2006) non trovano invece alcuna correlazione tra il pattern ipoecoico e la presenza di mastite, in quanto questo pattern nel loro studio viene riscontrato sia in mammelle sane e non in alcune mammelle malate. Flock & Winter (2006) trovano però una correlazione tra infezioni di batteri gram negativi come A. Piogenes e la presenza di lesioni caratteristiche con la presenza di pattern di tipo 6.
Gli autori suggeriscono quindi che, sebbene l’ecografia non possa rimpiazzare l’esame batteriologico e la conta delle cellule somatiche, il suo utilizzo ci può dare informazioni maggiori sullo stato della mammella, aiutare a fornire una prognosi e, nel caso di alcuni
batteri gram negativi, permettere di fornire una diagnosi sulla base del pattern riscontrato.
CAPITOLO 3 – SCOPO
Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare le dimensioni ecografiche della cisterna mammaria di quarti di bovine sane durante l’asciutta e alla ripresa della lattazione successiva.
CAPITOLO 4 - MATERIALI E METODI
4.1 ANIMALI
4.1.1 Comitato etico e consenso informato
Il presente studio in vivo è stato approvato dal comitato etico per il benessere animale dell’Università di Pisa (Prot. N. 33479/2016, 29/06/2016) ed è stato interamente svolto presso il Centro Interdipartimentale di Ricerche Agro-Ambientali (C.I.R.A.A.) “E. Avanzi”, di proprietà dell’Università di Pisa. Un consenso informato alle procedure svolte è stato firmato dal proprietario degli animali.
4.1.2 Animali e management di allevamento
Il C.I.R.A.A. “E. Avanzi” consiste in un allevamento intensivo a stabulazione libera di bovine da latte di razza Frisona Italiana, per un totale di circa 110 animali. Al momento dello studio l’allevamento era composto da 50/110 (45,5%) bovine in lattazione, 15/110 (13,6%) bovine in asciutta, 20/110 (18,2%) manze e 25/110 (22,7%) vitelli nelle varie fasi di accrescimento. I soggetti sono suddivisi in recinti e aree differenti in base alla loro età e al loro momento produttivo.
Le bovine in lattazione sono alloggiate in un recinto che comunica con la sala di mungitura. L’area ad esse dedicata presenta una zona per la ginnastica funzionale, una
zona di riposo con lettiera in paglia e una zona di alimentazione. La lettiera viene totalmente sostituita a giorni alterni, mentre quotidianamente la sporcizia più superficiale viene rimossa e sostituita con paglia fresca. Le bovine in lattazione sono alimentate due volte al giorno, al termine rispettivamente della mungitura della mattina e di quella della sera. La razione consiste in un bilanciamento di alimenti fibrosi ed energia, somministrati sotto forma di unifeed. L’acqua è sempre a disposizione. Il periodo di attesa volontario è di 60 giorni. Le fecondazioni avvengono in media in un intervallo di tempo compreso tra i 60 e gli 85 giorni post-partum. La prima diagnosi di gravidanza è eseguita fra i 28 e 30 giorni post inseminazione. Entro i 60 giorni post inseminazione viene effettuato il secondo controllo di gravidanza e il sessaggio dell’embrione. Le bovine in lattazione e gravide rimangono nel recinto di lattazione fino ai 270-305 giorni in mungitura (GIM), che corrispondono circa al 7° mese di gravidanza. Raggiunto questo momento, si procede alla messa in asciutta.
Le bovine in lattazione sono munte 2 volte al giorno a distanza di circa 11 ore. La sala di mungitura è a lisca di pesce e contiene 8 poste di mungitura. Si eseguono il pre e post dipping per detergere e disinfettare correttamente il capezzolo.
Per la gestione della messa in asciutta si rimanda al sottocapitolo dedicato (4.3.2).
In prossimità del parto, le vacche in asciutta vengono spostate in sala parto, un recinto appositamente dedicato che ha lo scopo di limitare gli stress della vacca e favorire un monitoraggio costante da parte di operatori qualificati. Il parto eutocico avviene senza l’intervento di operatori. In caso di complicazioni, il personale esperto è invece chiamato ad intervenire. Il vitello viene separato dalla madre subito dopo il parto per essere messo
in un box singolo. La vacca viene visitata e successivamente inserita nel gruppo delle bovine in lattazione.
4.2 CRITERI DI INCLUSIONE
I criteri di inclusione sono stati:
• bovine con almeno un parto all’attivo;
• bovine sottoposte a una messa in asciutta drastica, eseguita fra i 270 e i 305 GIM, previa valutazione della mammella e delle cellule somatiche;
• bovine che non presentassero mastite al momento della messa in asciutta e per tutta la durata dello studio, o altre patologie non correlate all’apparato mammario.
4.3 METODI
4.3.1 Dati raccolti per ciascun soggetto incluso nello studio
I dati anamnestici di ciascuna bovina venivano recuperati alla messa in asciutta tramite il software aziendale di stalla “Afifarm™” (Afimilk®, Kibbutz Afikim, Israel):
• numero identificativo individuale della BDN • numero di stalla
• data di nascita • numero di lattazioni • GIM alla messa in asciutta
• eventuale anamnesi patologica pregressa.
4.3.2 Esame clinico
Contestualmente alla raccolta dati per il segnalamento e l’anamnesi (T0), ciascuna vacca era sottoposta ad un esame clinico completo secondo lo schema riportato in letteratura (Tabella 4-2) (Rosemberger, 1993).
Tabella 4-2 Schema riassuntivo dell’esame clinico completo di un bovino adulto, come riportato da Rosemberger (1993).
4.3.3 Protocollo di messa in asciutta
Nell’allevamento in cui è stato svolto lo studio era eseguita la messa in asciutta drastica che prevede l’interruzione repentina della mungitura in un’unica giornata. Al termine delle operazioni di messa in asciutta, si eseguiva lo spostamento degli animali in un gruppo omogeneo e con una gestione alimentare specifica per questa fase produttiva. La messa in asciutta veniva eseguita sempre contestualmente alla mungitura della sera, per permettere una migliore gestione delle varie procedure.
Al momento della messa in asciutta, contestualmente all’ultima mungitura pre-asciutta (T0), erano effettuate le seguenti operazioni e valutazioni:
Zona/Apparato Valutazioni Osservazione del soggetto a
distanza
Valutazione atteggiamento e postura animale: posizione collo e dorso. Valutazione mantello, stato del sensorio e appetito.
Valutazione Body Condition Score (BCS; Wildman et al., 1982).
Linfonodi esplorabili Valutazione linfonodi intermandibolari, scapolari e precrurali.
Apparato cardiovascolare Valutazione frequenza, intensità, ritmo e purezza dei toni cardiaci
all’auscultazione.
Apparato respiratorio
Caratterizzazione respiro per tipo, ampiezza, celerità, frequenza e presenza di eventuali rumori respiratori patologici all’auscultazione.
Palpazione spazi intercostali per valutare la dolorabilità pleurica.
Apparato gastroenterico Ispezione, palpazione, percussione e auscultazione semplice e con
percussione delle regioni del fianco destra e sinistra.
1. Valutazione del capezzolo tramite teat score (Neijenhuis et al., 2000). In particolare, per ogni quarto venivano effettuate le seguenti misurazioni e valutazioni:
• Forma del capezzolo • Lunghezza del capezzolo
• Forma della parte finale del capezzolo • Condizioni della pelle
• Presenza di eventuali lesioni sul capezzolo con score da 1 a 5 in base alla gravità.
2. Valutazione del latte tramite California Mastitis Test (CMT) (Harmon et al., 1990) eseguita mediante kit DeLaval (DeLaval S.p.a., San Donato Milanese, Italia). Il CMT è un test rapido per la valutazione della presenza di mastite nella mammella bovina. La diagnosi è fatta sui singoli quarti tramite l’utilizzo di una piastra su cui è presente una linea che demarca i 2 ml di latte da campionare per l’esame. Un uguale quantitativo di reagente viene poi aggiunto al latte ruotando gentilmente la piastra per mescolare il composto. La soluzione nel giro di pochi secondi addensa in base al numero di cellule presenti nel latte campionato. La classificazione del campione era in linea con quanto riportato in letteratura e dalla casa produttrice:
• Negativo: Miscela liquida senza formazione di precipitato o addensamento (gelatina) < 200.000. No mastite
• Tracce: Leggero addensamento che tende a sparire col movimento del piatto Tra 150.000 e 500.000. Sospetto mastite
• 1: Addensamento marcato senza tendenza alla formazione di gel. Tra 400.000 e 1.500.000. Sospetto mastite
• 2: Il liquido addensa immediatamente. Il gel si posiziona al centro con la rotazione del piatto. Tra 800.000 e 5.000.000. Mastite
• 3: Marcata gelificazione che tende ad aderire al fondo del piatto. > 5.000.000. Mastite
3. Conta delle cellule somatiche (SCC) tramite apposito macchinario (DeLaval cell counter DCC, DeLaval S.p.a., San Donato Milanese, Italia).
4. Al termine della mungitura si procedeva alla somministrazione intramammaria con siringa da 5 ml di antibiotico registrato per la specie bovina in fase di asciutta a base di cloxacillina benzatina 765 mg (pari a cloxacillina 600 mg) e ampicillina triidrato 346 mg (pari ad ampicillina 300 mg) (Cloxalene Max, Fatro SpA, Italia) e di subnitrato di bismuto (EasySeal), sostanza sigillante per proteggere la mammella da infezioni batteriche.
Le procedure da 1 a 3 rientravano nel protocollo di messa in asciutta ed erano finalizzate alla diagnosi di mastite (Smith, 2015)
4.3.4 Tecnica ecografica
4.3.4.1 Tipo di ecografo e sonda ecografica
Lo studio è stato eseguito tramite l’utilizzo di un ecografo Mindray DP30Vet (Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd., Shenzhen, Cina), con sonda convex a frequenza di 5 MHz. Non è mai stato necessario rasare la zona interessata. Le valutazioni ecografiche erano eseguite mediante utilizzo di gel per ultrasuoni ed apposizione diretta della sonda alla porzione in esame. Le immagini erano salvate e le misurazioni eseguite in un secondo momento mediante il software “Imagej” (National Institutes of Health, USA)
4.3.4.2 Tecnica di misurazione ecografica della cisterna mammaria
Il contenimento dell’animale avveniva mediante l’utilizzo di apposite rastrelliere “a cattura” che erano installate lungo la corsia di alimentazione. Le rastrelliere “a cattura” sono il metodo contenitivo normalmente utilizzato nella stalla oggetto dello studio per i diversi tipi di procedure da condurre sull’animale. Le bovine risultavano perciò particolarmente tranquille ed abituate a tale contenzione. In nessun caso è stato necessario ricorrere ad un contenimento farmacologico.
Le valutazioni ecografiche erano eseguite sulla mammella non rasata mediante l’utilizzo di gel per ultrasuoni ed apposizione diretta della sonda alla porzione in esame. Veniva
applicata una lieve pressione per il mantenimento del contatto fra la sonda e la cute della mammella, senza però deformarne l’immagine all’ecografo.
Le ecografie erano sempre eseguite alle 11 di mattina e sempre dal medesimo operatore esperto (LT). La sonda ecografica era settata per una frequenza di 5MHz (Ayadi et al., 2003).
La tecnica utilizzata per eseguire l’ecografia della cisterna mammaria (CM) è stata quella riportata e validata da Ajadi e colleghi (2003). L’ordine di esame dei quarti era sempre il medesimo: quarto anteriore sinistro (QAsx), quarto anteriore destro (QAdx), quarto posteriore sinistro (QPsx) e quarto posteriore destro (QPdx). Per ciascun quarto la sonda ecografica era posta subito cranialmente all’inserzione del capezzolo sulla mammella. La sonda era mantenuta prima parallelamente al capezzolo per una sezione longitudinale della CM, successivamente era ruotata di 90° per una sezione trasversale della CM. Per ciascun quarto si salvavano 3 immagini della CM in sezione longitudinale e 3 immagini della CM in sezione trasversale (Ajadi et al., 2003). Al termine dell’ecografia, la mammella era accuratamente pulita con carta asciutta in modo da non lasciare residui di gel.
A conclusione delle osservazioni, le immagini salvate sull’ecografo erano stoccate all’interno di una penna USB (SanDisk Cruzer) e trasferite su un computer (Acer Aspire 5750G) per la successiva valutazione.
4.3.4.3 Tempi di valutazione
Ciascun animale era sottoposto allo screening ecografico con cadenze di seguito riportate, per un totale di 11 osservazioni:
• T0 – valutazione eseguita il giorno della messa in asciutta, alle 11 del mattino, orario equidistante fra la mungitura della mattina e la mungitura della sera conclusiva della lattazione in corso del soggetto;
• T1 – valutazione eseguita il giorno successivo alla messa in asciutta, sempre alle 11 di mattina, a distanza di circa 18-20 ore dopo l’ultima mungitura. A partire da questo momento, la CM è stata valutata con cadenza settimanale, in particolare a T7, T14, T21 e T28. A circa 28 giorni post messa in asciutta, si raggiunge secondo la letteratura il picco di involuzione della mammella di bovine da latte gravide (Capuco et al., 1997). Da questo momento in poi la CM è stata valutata con cadenze di 10 giorni fino alla data del parto, in particolare a T38, T48 e T58.
• TCPP – entro il terzo giorno post-partum per la valutazione della ripresa della lattazione nella fase colostrale;
T7pp – a 7 giorni dal parto, per la valutazione della CM all’inizio della fase di produzione di latte.
4.3.4.4 Misurazioni
L’elaborazione delle immagini ottenute con l’ecografia veniva effettuata tramite pc (Acer Aspire 5750G) il pomeriggio stesso e con l’ausilio del software “ImageJ” (National Institutes of Health, USA).
Per ciascuna immagine ecografica, si delimitava a mano libera il contorno della CM seguendone il margine ecogeno, ben visibile perché in contrasto con il contenuto
anecogeno della CM stessa. Il software elaborava automaticamente l’immagine ritagliata determinando l’area della CM, espressa in cm2. In base alle indicazioni della casa editrice
del software, 23 pixel corrispondevano a 1cm.
4.3.5 Screening per la presenza di mastiti cliniche o subcliniche nel post-partum
Al termine della fase colostrale (T7PP), era eseguito il controllo delle cellule somatiche del latte come descritto nel cap. 4.3.2 (punti da 2 a 3), al fine di individuare bovine affette da mastite subclinica. I soggetti che presentassero segni di mastite subclinica o di mastite clinica erano esclusi dallo studio.
4.3.6 Analisi statistica
Il test di Kolmogorov Smirnov è stato applicato per valutare la distribuzione dei dati. Il test di Spearman è stato applicato per valutare la correlazione fra le dimensioni ecografiche della CM e i tempi di valutazione della fase di asciutta (T0, T1, T7, T14, T21, T28, T38, T48, T58).
Il test di Friedman con il test di Dunn per le comparazioni multiple come post-hoc sono stati eseguiti per valutare le modificazioni delle dimensioni ecografiche della CM per i quarti anteriori e posteriori nelle sezioni trasversali e longitudinali per i tempi T0 vs T58 vs TCPP vs T7PP.
Valori per p<0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. Per l’analisi statistica è stato utilizzato un software commerciale (GraphPad Prism® 6.0, USA).
CAPITOLO 5 – RISULTATI
5.1 Animali inclusi
Tutti gli animali inclusi nello studio erano bovine di razza Frisona Italiana dalla 1° alla 4° lattazione, con un’età media di 5.6 ± 1.6 anni, un peso medio di 722 kg e un BCS medio di 3.
Nel periodo di interesse dello studio, erano presenti in azienda un totale di 15 animali compatibili con il periodo produttivo richiesto, aventi almeno un parto all’attivo e messe in asciutta con protocollo standard di messa in asciutta drastica. Dei 15 soggetti iniziali, 10 bovine presentavano tutti i criteri per poter essere incluse nello studio. Il motivo unico di esclusione di 5/15 animali è stata la diagnosi di mastite al momento della messa in asciutta. Nessuno dei soggetti inclusi ha sviluppato patologie dell’apparato mammario o di altri apparati durante il periodo dello studio, perciò non sono state escluse bovine in corso di valutazione.
5.2 Valutazioni legate alla messa in asciutta
5.2.1 Valutazione del capezzolo
Tramite la valutazione del capezzolo, è stato rilevato che:
• 3 animali su 10 presentavano capezzoli dei quarti anteriori con forma omogenea, 7 su 10 con punta più larga rispetto al corpo; 1 su 10 presentava capezzolo piano,
9 su 10 presentavano capezzoli a punta; 6 animali su 10 presentavano pelle liscia e umida, 4 su 10 presentavano pelli secche con crepe
• 3 animali su 10 presentavano capezzoli dei quarti posteriori con forma omogenea, 7 su 10 con punta più larga rispetto al corpo; 1 su 10 presentava capezzolo piano, 9 su 10 presentavano capezzoli a punta; 6 animali su 10 presentavano pelle liscia e umida, 4 su 10 presentavano pelli secche con crepe
• La lunghezza media dei capezzoli anteriori sinistri era 5,1 cm; anteriori destri 5.3 cm.
• La lunghezza media dei capezzoli posteriori sinistri era 4.6; posteriori destri 4.8
5.2.2 Valutazione dei CMT e delle cellule somatiche alla messa in asciutta e alla ripresa della lattazione
I CMT eseguiti su ciascun quarto, di ciascun soggetto incluso a T0 e a T7PP hanno dato esito negativo. La media delle cellule somatiche a T0 era 170±83 cell/µl, mentre la media delle cellule somatiche a T7PP era 194±98 cell/µl.
5.3 Tecnica ecografica
La tecnica ecografica utilizzata in questo studio per la valutazione delle dimensioni della cisterna mammaria è risultata agevole, semplice e di facile esecuzione in campo e in tutti i soggetti. Non è stato necessario utilizzare mezzi contenitivi salvo la rastrelliera auto-catturante. La visualizzazione della CM è stata ottimale anche senza la tosatura
pre-ecografia e con il solo utilizzo di gel ecografico applicato direttamente sulla mammella. La CM è risultata facilmente visualizzabile in tutti i quarti in ogni T incluso dello studio (Fig. 1).
Fig. 1 A-D. Immagine ecografica della CM di quarti mammari di una bovina sana al momento della messa in asciutta eseguita con sonda convex 5.0 MHz di frequenza con ecografo Mindray DP30Vet (Shenzhen, Cina). La CM è visibile come una zona ipoecogena delimitata dal parenchima mammario ecogeno. A) Quarto anteriore sinistro in sezione trasversale; B) quarto sinistro in sezione longitudinale; C) quarto posteriore sinistro in sezione trasversale; D) quarto posteriore sinistro in sezione longitudinale.
5.4 Misurazioni
I dati relativi alle misurazioni della cisterna mammaria non erano distribuiti normalmente. I valori per tutti i tempi e suddivisi per quarti (QA e QP) della mediana, minimi e massimi per ciascuna proiezione sono stati riportati nelle Tabella 1-4.
ANT T T0 T1 T7 T14 T21 T28 T38 T48 T58 TCPP T7PP
Min 2.12 2.80 1.25 1.28 0.68 0.41 0.68 0.65 0.55 1.06 3.22
Mediana 10.54 19.25 11.61 8.465 6.97 6.50 3.90 2.53 2.50 8.84 17.58
Max 29.08 35.13 25.21 22.02 26.52 15.11 18.84 8.910 161.0 31.87 37.61
Tabella 1. Valori della mediana, massimi e minimi delle dimensioni dei quarti anteriori per la sezione trasversale a tutti i tempi di valutazione. Legenda: ANT T – quarti anteriori sezione trasversale; Min – valori minimi; Max – valori massimi.
ANT L T0 T1 T7 T14 T21 T28 T38 T48 T58 TCPP T7PP
Min 3.43 4.12 2.96 2.11 1.06 0.72 0.83 1.02 1.08 1.67 3.03
Mediana 12.3 24.75 15.20 11.63 7.41 7.78 5.30 4.05 4.17 14.09 19.66
Max 28.82 36.48 25.22 27.26 23.88 17.70 28.95 11.16 6.280 34.73 51.00
Tabella 2. Valori della mediana, massimi e minimi delle dimensioni dei quarti anteriori per la sezione longitudinale a tutti i tempi di valutazione. Legenda: ANT L – quarti anteriori sezione longitudinale; Min – valori minimi; Max – valori massimi.
POST T T0 T1 T7 T14 T21 T28 T38 T48 T58 TCPP T7PP
Min 3.45 17.33 9.79 4.97 4.61 5.22 1.00 0.90 0.88 1.74 3.09
Mediana 16.92 33.58 21.28 18.25 13.13 10.55 7.115 3.410 4.245 17.43 28.10 Max 45.23 88.78 49.54 51.17 41.42 31.0 29.24 24.24 22.30 50.29 88.25
Tabella 3. Valori della mediana, massimi e minimi delle dimensioni dei quarti posteriori per la sezione trasversale a tutti i tempi di valutazione. Legenda: POST T – quarti posteriori sezione trasversale; Min – valori minimi; Max – valori massimi.
POST L T0 T1 T7 T14 T21 T28 T38 T48 T58 TCPP T7PP
Min 5.58 13.57 8.34 6.49 4.35 3.12 0.83 0.88 0.89 1.94 2.61
Mediana 20.43 32.80 22.57 19.07 13.58 10.88 7.23 3.34 3.15 15.14 26.53
Max 63.28 63.81 54.50 53.41 49.06 40.05 27.53 20.81 24.32 40.34 65.46
Tabella 4. Valori della mediana, massimi e minimi delle dimensioni dei quarti posteriori per la sezione longitudinale a tutti i tempi di valutazione. Legenda: POST L – quarti posteriori sezione longitudinale; Min – valori minimi; Max – valori massimi.
L’analisi statistica ha evidenziato una correlazione lineare negativa statisticamente significativa tra il tempo e le dimensioni ecografiche della CM per i quarti anteriori in sezione longitudinale e trasversale (r = -0.95; p<0.0004) e per i quarti posteriori in sezione longitudinale e trasversale (r = -0.90; p<0.002).
Il test di Friedman è risultato statisticamente significativo (p< 0.0001) e la comparazione fra i valori dei singoli tempi è riportato nel Grafico 1.
Grafico 1 – Grafico a colonne relativo alle comparazioni fra le dimensioni ecografiche dei quarti anteriori in sezione trasversale (ANTERIORE-T), posteriori in sezione trasversale (POSTERIORE-T), anteriori in sezione longitudinale (ANTERIORI-L) e posteriori in sezione longitudinale (POSTERIORI-L) ai diversi tempi di osservazione. Legenda: T0 – valutazione eseguita il giorno della messa in asciutta; T58 – valutazione eseguita 58 giorni dopo la messa in asciutta; TCPP – valutazione eseguita nella fase colostrale (entro il 3° giorno di lattazione); T7pp – valutazione eseguita 7 giorni dopo la ripresa della lattazione (a≠b≠c≠d p<0.05).
CAPITOLO 6 – DISCUSSIONI
In letteratura sono presenti studi che valutano da un punto di vista ecografico la CM nella fase di crescita della manza (Albino et al., 2017; Nishimura et al., 2010), nella lattazione (Wilde et al., 1996; Dewhurst & Knight, 1994; Ayadi et al., 2002; Caja et al., 2004; Bruckmaier et al., 1994) e che valutano la presenza di pattern non fisiologici come ascessi ed edemi mammari (Flock & Winter, 2006). A conoscenza degli autori non sono presenti studi che valutano le dimensioni ecografiche della CM durante la fase di asciutta dell’animale e fino alla ripresa della lattazione successiva.
La valutazione ecografica della CM è stata realizzata in letteratura sia mediante immersione della mammella in esame in una bacinella d’acqua, che attraverso il contatto diretto della sonda ecografica con la cute dell’animale (Bruckmaier et al., 1994; Ayadi et al., 2002). La tecnica ecografica utilizzata in questo studio è stata in accordo a quanto riportato da Ayadi e colleghi (2002), ossia mediante l’apposizione della sonda ecografica direttamente sulla mammella. La tecnica è risultata semplice e di facile esecuzione per tutta la durata dello studio e la cisterna mammaria era facilmente visibile, a conferma di quanto riportato in letteratura (Ajadi et al., 2002). La possibilità di eseguire l’indagine ecografica senza utilizzare il mezzo acquoso, è auspicabile nella bovina da latte, essendo l’acqua potenziale fattore di rischio per la contaminazione del capezzolo e l’instaurarsi di un processo mastitico (Bruckmaier et al., 1994; Oliver e Sordillo, 1989).
Le dimensioni calcolate per ciascun quarto in sezione longitudinale e trasversale, a T0 ed a T1, sono risultate in linea con il lavoro di Ajadi e colleghi (2002). In mancanza di letteratura simile, non è stato possibile confrontare i dati relativi alle dimensioni della cisterna mammaria ottenuti per gli altri tempi.
L’analisi statistica ha evidenziato una correlazione lineare negativa statisticamente significativa tra il tempo e le dimensioni ecografiche della CM sia per i quarti anteriori che per i posteriori. Le dimensioni ecografiche della CM risultano, dunque, diminuire in maniera statisticamente significativa durante tutta la fase di asciutta. Tale involuzione dimensionale ecografica è stata valutabile in entrambe le sezioni utilizzate.
A conoscenza degli autori, in letteratura non esistono studi ecografici sulla valutazione delle dimensioni della CM, ma sono presenti alcuni lavori che dimostrano una significativa diminuzione della proliferazione cellulare della CM fino ai 25 giorni dalla messa in asciutta (Holst et al., 1987, Capuco et al., 1997, Wilde et al., 1997). Sempre secondo gli stessi autori, in animali in asciutta e gravidi, tale proliferazione riprenderebbe a partire dal mese post messa in asciutta e culminando con la ripresa della lattazione e un ulteriore aumento di tale intensità di replicazione (Capuco et al., 1997, Wilde et al., 1997). I nostri risultati evidenziano che la diminuzione delle dimensioni ecografiche della CM è invece costante per tutta la durata della fase di asciutta. Queste differenze potrebbero essere dovute a una discrepanza fra le caratteristiche proliferative cellulari del tessuto mammario della CM e la sua traduzione in dimensioni macroscopiche e valutabili ecograficamente.
L’aumentare invece delle dimensioni ecografiche della CM a T1, ossia circa 18 h dopo la messa in asciutta, era un risultato prevedibile considerando che la drastica cessazione della mungitura di una mammella ancora in produzione porta ad un accumulo di latte nella CM. Questo accumulo di latte successivo alla messa in asciutta, spiegherebbe perché le dimensioni ecografiche della CM siano maggiori a questo tempo, rispetto agli altri.
La comparazione fra le dimensioni ecografiche della CM alla messa in asciutta (T0) e alla ripresa della lattazione in fase colostrale (TCPP) non ha evidenziato differenze né per i quarti anteriori né per i quarti posteriori. Da un punto di vista fisiologico, ciò è in linea con il momento produttivo della bovina.
Alcune differenze sono state invece trovate fra le dimensioni ecografiche della CM alla messa in asciutta (T0) e alla ripresa della lattazione al termine della fase colostrale (T7pp), in particolare per i quarti anteriori in sezione longitudinale e per i quarti posteriori in sezione trasversale. Tale differenze potrebbero essere dovute a un fisiologico maggiore sviluppo della mammella “fresca”, 7 giorni dopo il parto, rispetto allo sviluppo di una mammella “stanca”, ossia al termine della precedente lattazione.
Le dimensioni ecografiche della CM al termine della fase di asciutta (T58) sono risultate statisticamente più basse rispetto agli altri tempi (T0 vs TCPP vs T7pp) per entrambe le sezioni dei quarti anteriori e per i quarti posteriori in sezione trasversale, a conferma di quanto riportato in letteratura (Ajadi et al., 2002; Caja et al., 2004). Studi che hanno valutato le modificazioni delle dimensioni della CM in relazione alla produzione di latte, avevano confermato che l’area della CM aumenta man a mano che il latte si accumula in cisterna (Ajadi et al., 2002). Il parto della bovina coincide con il meccanismo endocrino di stimolazione alla produzione ed eiezione di latte e dunque con la ripresa della lattazione
(Smith, 2015). Un aumento delle dimensioni ecografiche della CM con l’inizio della nuova lattazione è risultato perciò compatibile con quanto riportato in letteratura (Ayadi et al., 2002; Caja et al., 2004).
La CM valutata in sezione longitudinale per i quarti posteriori è risultata più piccola rispetto a T0 e T7pp, ricalcando quanto discusso sopra, ma non rispetto a TCPP. Tale risultato potrebbe essere spiegato dal numero non elevato di animali inclusi e renderebbe perciò auspicabile un aumento dei soggetti presi in esame.
Capitolo 7 - CONCLUSIONI
In conclusione, la valutazione ecografica delle dimensioni della CM durante la fase di asciutta in bovine sane è una tecnica facilmente fruibile in campo. Le informazioni derivanti da queste valutazioni potrebbero essere utilizzate per il monitoraggio del corretto andamento dell’asciutta.
