Novel Epidemic
Clones of
Listeria
monocytogenes
,
United States,
2011
e f g f h i j i k f l i m n ok p q r s t g u q t v t m w t x t g y t g k t g ze j op x m { q t g| } ~ f g gm h i g o y }f p k t | m h f ok i v t q m h t t f x m f g| f k k ~ r g k v t m ol q f t } g f l t m o { q t k m g ol n g i k m ol q f gp t ok t gv j f k k m f g n t g g f k u m f k p e x t q t k k f t }We identifi ed a novel serotype 1/2a outbreak strain and
2 novel epidemic clones of
while
investigating a foodborne outbreak of listeriosis associated
with consumption of cantaloupe during 2011 in the United
States. Comparative analyses of strains worldwide are
es-sential to identifi cation of novel outbreak strains and
epi-demic clones.
¡ ¢ £ £ ¤ ¥ ¦ § ¨© ª «§ ¬ § ¦ © © ¬ ® ¯ ° «© ±¦ ª ¦ ² « ³ ¬ ¬ ¤ ´ ³ ¤ µ ¬ § © «¶ ® © ¨ ¬ « · ¬ § © ¨ «§ «© § «§ · ¬ § § « ¸ ® © ¬ « ¹ · ¬ ¬ © º ±» ²¼ ½ ¥ © º ¬ ¸ «§ © ¬ § µ · ¬ ¹ © «¾ ® « © ¿ º § ® À¶ ® ¹ · © ¥ © § «§ ± ¯ Á ´  ² © ¶ § ¬ ® § © à § £ Ä¡ ¬ ¬ ® £ Ä¡ ¤ ¥ ¬ « ¹ § ® © ¬ §§ © · «¬ ® µ «¥ ¬ ¹ © º ¬ ¸ § ±» ÅÆ ²¼ ª º « ¹ ³ º ¹ º § ¡ ¢ £ ¡ ¤ ¬ ¶ ¨¥ © º ¬ ¸ À ¬ § § © · «¬ ® § º à § © §« ¨© £ · ¬ § µ ¬ § ® · ® ¤ ¬ ® ¦ ª ¦ © ® ¬ ¶ ¬ © ¬ © ¨ £ ¿ Ç · ¬ § § ¨ © ¡ È É §¬ § ¤ · ¬ º § « ¹ Ê Ê ® ¬ ¥ § ¬ ® £ «§ · ¬ «¬ ¹ ±µ µ µ ¼· ® · ¼¹ © ° Ä «§ «¬ Ä© º ¬ ¸ § Ä· ¬ ¬ © º § ÀË § À¨¬ § Ä« ® Ì ¼¥ ² ¼ ½ ¥ Á © © ® ¬ ® ª º ¹ ³ ® « «§ ¬ «© ± Á ª ³ ² « § · ® ¥ « ° © ° ® ¨¬ Í © º ¬ ¸ § ¬ « § ¬ · ¥ « ¹ Ê © ¨ ¥ ¯ Á ´  © ¶ § ¨ © · « «· ¬ § ¬ § µ «§ © ¬ ® ¨ © µ ¬ § ¥ ® · ¬ ¬ © º § ¬ ® ° ¬ «© º § ° « © ¬ § º ¨¬ · § µ «¥ « ¥ ¨¬ · ««Ã ±µ µ µ ¼¨® ¬ ¼¹ © ° Ä Á © © ® Ä Á © © ® ¬ ¨ à Ħ Î Ï Â Ð µ © ¸ Ä º · ¡ Ç ¡ Ê Ç ¡ ¼¥ Ñ © ²¼  «® «· · © § ±Â ¦ § ² © ¨ Ò ÓÔÕÖ × ÓØ Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô ¬ ® ¶ ® ¬ § «§© ¬ § © ¨ ¬ §º ¬ à · © © ¬ · §© ¥ ¬ ¬ ¹ «· ¬ à ¬ ® ¬ ® « ° © ° ® « ® «¨¨ © ¬ à ¬ ® ¹ © ¹ ¬ ¥ «· ¬ à º ¬ ® © º ¬ ¸ § ±Æ ²¼ ¯ ° «© º § à ¤ º «° « º · © · º § § ß º · à « ¹ ±à á â ½ ² ¬ · · º ¬ à «® «¶ ® ¥ ã ¸ © µ  ¦ § © ¨ Ò ä Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô ¤  ¦ åæ á ±ç Åè ²¼ ³ § © ¤ Ü Ú Ù é © ¥ ¬ ¹ Ë º · «© ¨ ¬ ¹ ±ê Á ² § ß º · § µ ® © § ¬ ® © º «ß º ©  ¦ § ¬ « § © ¨ Ò ä Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô « « ® «° «® º ¬ ¨¬ · ««« § ¥ ¬ © · § § ® ¬ ® à À© À ¬ ¬ ¬ ® © º à © « º « ¬ § ¬ º ¨¬ · º « ¹ § « «¬ ¬ ® à À© À ¬ © ® º · § ±ë ²¼ ½ ¥ Ü Ú Ù é © ¥ ¬ ¹ ¬ à § ¬ ¬ «® ¬ ® ¬ ¬ «© «§ ¬ ® ¥ ¬ ¬ § Ò ä Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô © ¬ «® à ¬ ® ¬ © ¬ ® ¨© «© ¶ § « § · «¶ · ° « © ¬ «· ¥ § ±ë ²¼ Ð « ¨© © ® © © º ¬ ¸ À¬ § § © · «¬ ® «§ © ¬ § ¬ ® © · ¬ ¬ © º ¤ § « ¹ ¥ ¿ © º ¬ ¸ § ¬ « § « ««¬ à «® «¶ ® ¤ µ § · ® ¨© º «© · º § § ß º · à « ¹ ±à â ½ ² ±ì ²¤ à á â ½ ±ç ²¤ ¬ ® Ü Ú Ù é © ¥ ¬ ¹ ê Á § ß º · « ¹ ±ë ² © ® « «¨ ¥ à § ® ° «© º § à «® «¶ ® © º ¬ ¸ § ¬ « § © ¸ © µ Ä © °  ¦ § © ¨ Ò ä Ù Ú Û Ú Ü Ý ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô ±Æ æ è ²¼ å§ © ¬ § ¨ © · ¬ ¬ © º § ¬ § µ ¬ § © · © ¬ ® µ «¥ ¡ í É ª ¬ © ¨ ³ ¹ «· º º ±É ª ³ ² «§ © ¬ § © ¨ Ò ä Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô « ° ® ¨ © ¡ É · ¥ «· ¸ © · § § « ¹ ¬ § ± î Åï ²¼ ~ q t e x r p | ¦ ª ¦ · © ¶ ® «® «¶ · ¬ «© © ¨ Ò ä Ù Ú Û Ú ÜÝ ÕÚ Þ Ö Û Ö Ô º § « ¹ ¥ ³ · · º ¯ © â å ½ Â Ï å³ à Î Ð Î ¦ ð ½ Î ´  Р ¦ º º å® «¶ · ¬ «© ½ § ±´ À ¯ © ¤ ¬ ª « ¹ © ¤ ¦ ³ ¤ É ³ ² ¬ ® à Á ª ³ ¬ · · © ® « ¹ © ¥ Á ª ³ ñ ¬ · «© © ¹ «· ¬ ³ ¬ à «· ¬ à ¬ º ¬ ±µ µ µ ¼¨® ¬ ¼¹ © ° Ä Á © © ® Ä · « · Ï § ¬ · ¥ Ä â ¬ © ¬ © Ã à ¥ © ® § Ä ñ ¬ · « © © ¹ « · ¬ ³ ¬ à « · ¬ à ¬ º ¬ ñ ³ à Ä® ¨¬ º ¼¥ ²¼ å§ © ¬ § µ § © à ® à º § « ¹ · © · «¬ ¬ «§ ¬ ±ª ¸ ¬ «¸ ¤ ½ © ¸ à © ¤ ê ¬ ¬ ² ¬ ® ¬ ¬ à ¾ ® à ¯ Á ´  ±ò ² ± ½ ¬ Í Á «¹ º £ ²¼ ½ ¥ © « ½ · ¥ «· ¬ ³ ® «Ì ± µ µ µ · ¼· ® · ¼¹ © ° ÄÂ åª Ä ® ¨§ Ä £ ¡ À £ £ ó Ç À ½ · ¥ ¬ ¼ ® ¨² § ¥ © µ § ¥ ¬ «° ® «§ « º «© © ¨ ¥ ¿ ¯ Á ´  © ¶ § ¬ © ¹ · « «· ¬ ¤ ¨© © ® ¤ © ° « © ¬ § ¬ §¼ å§ © ¬ § µ ¹ © µ © ° «¹ ¥ « à «· § © à © ¥ µ «¥ à ¬ § Ì ¬ · ¬ Ê Ç ô ¦ ¤ ¬ ® ª Ð ³ µ ¬ § Ì ¬ · ® à º § « ¹ ¥ É ¬ ¦ ¬ à «· © «¬ ª Ð ³ å§ © ¬ «© õ « ±à © ñ «© â ¬ © ¬ © « § ¤ © ¬ ¬ ñ ¬ · ¥ ¤ ¦ ³ ¤ É ³ ² ¨© «§ © ¬ § ¨ © ¦ ª ¦ ¬ ® É ª ³ ¬ ® ¥ ö «¾ ¬ ® ´ © «· ª Ð ³ ¯ º «¶ · ¬ «© õ « ± ¯ © ¹ ¬ ¤ à ¬ ® «§ © ¤ ö å¤ É ³ ² ¨© «§© ¬ § ¨ © Á ª ³ ¼ ß º · à § ± ½ § ² «® «¶ ® à º § « ¹ à â ½ µ ¬ § § «¹ ® ¬ § ® §· « ® ±ì ² © ¥ ¬ § «§ © ¨ µ ¥ © ¹ © § ß º · ® ¬ ¬ ±¦ ¼ ½ ¬ ¤ ð ¼ ¦ ¥ ¤ º º ¼ ® ¬ ¬ ² ¬ ® · © ¬ ® µ «¥ ¥ © § º «· à ¬ ° ¬ «¬ ±µ µ µ ¼ ¬ § º ¼¨ Ä §² ¼ à á â ½ ® ¬ ¬ µ © ¬ « ® ¬ § ® § · « ® ±ç ² © Ì ¬ · ® ¨ © µ ¥ © ¹ © § ß º · § ±ð ¼ ¦ ¥ ¤ º º ¼ ® ¬ ¬ ²¼ ß º · § µ · © ¬ ® µ «¥ ¥ © § © ¥ à á â ½ ® ¬ ¬ ¬ § ¬ ° ¬ «¬ « ¥ ¬ © ¬ © à © ¨ ¼õ ¼ ±ç Åè ² ¬ ® ¬ ¬ à ¾ ® à º § « ¹ à  ´ ³ ã ¼¢ ±» ÷ ²¼ Ð µ ° « º · Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 19, No. 1, January 2013
147
Author affi liations: Università degli Studi di Torino, Turin, Italy (S.
Lomonaco); Accugenix, Newark, Delaware, USA (B. Verghese);
The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania,
USA (B. Verghese, S. Knabel); Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, Georgia, USA (P. Gerner-Smidt, C. Tarr, L.
Gladney, L. Joseph, L. Katz, M. Turnsek, M. Frace); Food and Drug
Administration, College Park, Maryland, USA (Y. Chen, E. Brown);
and US Department of Agriculture, Athens, Georgia, USA (R.
Mein-ersmann, M. Berrang)
øù ú û ü ýþ ÿ ü û û ü ü û ø ü øû ü þ ÿ ýü øû ü þ ÿ ý þ ÿ ý þ ÿ ý þ ÿ ý þ ÿ ý þ ÿ ý ú ú û ! " ü û û ü û # $ û % û ü û ü % & û ý' ( ú û øù ú û ü ý( ÿ ü û û ü ü û & ù % ) ú ! " üû # $ û % û ü ø ø ü û * & û + ) ú û * $ ü û ú øü ý, -' ú ú û ! " ü û # $ û % û ü û û ü $ & ) øøû ø . û / 0 + ü øû 1 ý % % û ü ü ü ! 2 ! 2 ü øû ü ý % % û üü ü ! 2 3 ! 2 4 ü øû ü 1 1 4 1 4 ý( " . 5 ú 6 û & û û ø ø û & ù ü ü û ) øû ÿ ý7 ø û ü ) û þ ÿ ýþ ÿ ü ø û 8 & ü øû ü ø û ø & ü û ü øû ü 9 9 + ) ) ø ø % & ) û ø3 & û $ ø& û 0 : $ ý, -; ; ü øû ü 9 ýÿ & û " $ û / û % $ ü û þ ÿ ü øû ü û û ü ü % øû ø ) $ øú û $ ø& û 0 ü ø û ù ü $ & û % ü û û ú ø + * û 5 : ý5 : þ 4 5 : þ 4 ü øû ü + ) % ø $ ú û ü øû ü û ) ú 6 % ø +
DISPATCHES
148
Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 19, No. 1, January 2013
< = > ?@ A B C= D= EF@ DGH FGEH I J K LM NO PLQ R S T S U V NS W X T X M GH I ?= F@ H D@ Y D@ H @ ZFGZ [ \ ZI ] @ ?I ^F> D@ = _ H FD= GZ = Z` a Z@ b ?c ` @ JGZ@ ` @ Y G` @ d GE E ?I Z@ H e f B g h= Z ` f B g hhe i Z GF@ ` j F= F@ H ea k \ \ l mn o pq rs t u [ @ Z Ec v ^F> D@ = _ c @ = De ?I E= FGI Z e H I ^ DE@ wFc Y@ I J H I ^ DE@ x j @ DI Fc Y@ y z j < j < wB B x y g z j < g < wf B x i { { < | v } ~ { < { f Y DI JG?@ \ z a a B | B a k \ \ e i j e E= Z F= ?I ^ Y@ wB x \ a > w x wg hx z hj k k | u a k \ \ e i j e E= ZF= ?I ^ Y@ w x \ a > w x wg hx z hj k k | u a k \ \ e i j e E= ZF= ?I ^ Y @ wf x \ a > w x wg hx a i j | u a k k a e i j e E C GE _@ Z Y ?= ZF u w x \ a > w x wg hx i j | u a k k e i j e E C GE _@ Z Y ?= ZF w x \ a > w x wg hx \ \ \ k k \ k ~ y z \ e B = Z = ` = e Gd GF= FGI Z E D= > d @ = F wB x \ a > w x wg hx \ \ \ \ \ k k \ \ ~ y z \ e B = Z= ` = e Gd GF= FGI Z E D= > d @ = F w x \ a > w x wg hx \ \ \ \ { f Y DI JG?@ a z a a B | B a k \ \ e i j e E= Z F= ?I ^ Y@ wB x \ a = a wa x { f Y DI JG?@ z a a B | B a k \ \ e i j E= ZF= ?I ^ Y @ wB x \ a = \ w x wg hhx z hj k k | u a k \ \ i j e E= ZF= ?I ^ Y@ wf x \ a = \ w x wg hhx { f Y DI JG?@ z a B | B a k \ \ e i j e E= Z F= ?I ^ Y@ wB x \ a = w x wg hhx \ \ z hj k k a | u a k \ \ e i j e E= ZF= ?I ^ Y@ w x \ a = w x wg hhx \ \ z hj k k | u a k \ \ e i j e E= ZF= ?I ^ Y @ wf x \ a = w x wg hhx \ \ a \ i j | u a k ka e i j e E C GE _@ Z Y ?= ZF u wf x \ a = w x wg hhx \ \ i j | u a k k e i j e E C GE _@ Z Y ?= ZF wf x \ a = w x wg hhx \ k \ k \ ~ y z a k k k B = Z = ` = e b C GY Y GZ[ E D@ = d wB x \ a = w x wg hhx \ \ k \a ~ y z a k k k B = Z= ` = eb C GY Y GZ[ E D@ = d w x \ a = w x wg hhx \ ¡ ¢ £ ¤¥ ¦§¨ © ª « ¬ ® ¢ ¯ ¢ ¢ ¯ ¢ ¨ ° ® ¯ ± ¯ ¬ ± ®² ³ ¯ ± ² ³ ¯ ± ¬ ®´ µ ¶ ´ µ ¬ ¶ ¢ ¯ ° ¨ · ± ¬ ¢ ® µ ¶ ³ ¸ ³ ¸ ¤¢ ¢ ¦ ¹ ¬ ¹ ¤ º ¦® µ » ¶³ ¸ » ¸ ¤ª ¢ ¦ ° ¹ ¬ ° ¤ ¦® ² ¨ ¨ ¸ ¼½ ¾ ¿ ¬ ®¯ À Á ´ ¨ ¸ £ ¼ ½¾ ¿ ¬ ®Â ¨ ¢ Ã Ä ¬ § Å Æ Ç È É ÊË Ì È ÍÎÉ Ï Ð Ñ Ð ÊÒÌ ÍÈ ÓÔ ÕÒÍÓ ÎÉ Ê ÕÈ Ö Ö ÎÑÑÈ ÍÕ ÑÍÐ Ë ÒÇ È × Ø Ù ÚÕ ÑÎÉÓ ÛÊ Ü Ö Ó ÒÈ Ð É ÒÇ È ÐÊ ÒÌ ÍÈ Ó Ô ¤£ £ £ § §¬ °Ý Ý ³ Ý¢ À à ª ´ £ ¡Ý Þ ß Þ à ßÞ § á ¦§ â ã × ä å Ü ÍÐ ÑÎÛÈ Õ Ì ¢ ¯ ¢ ¯ ± « ¡§ æ ³ ¸ ç è é ³ ¸ ß é ¬ ¤© ݱ ¦ êë ìí §
Figure 1. Four
î ï ðI / 4
î ñ òI
pulsed-fi eld gel electrophoresis (PFGE)
profi les (identifi ed at the time the
research was performed) displayed
by
ó ôï õö ÷ôò ø ù ú ù ð ûõù ü ö ú ö ïclinical
isolates (L2624, L2625, L2626, and
L2676) and isolates from food or
environmental samples (LIS0072,
LIS0075, LIS0077, LIS0078, and
LIS0087)
associated
with
the
2011 listeriosis outbreak traced to
cantaloupe. PFGE profi les 3 and 4
differ by ≈40-kb shift in 1 band in the
AscI pattern, likely related to the loss
or acquisition of the comK prophage,
because the size of this prophage
was ≈40 kb as calculated by using
the whole genome sequencing data
(not shown).
Novel Epidemic Clones in Listeriosis Outbreak
ý þÿ ý þ ÿ þ ÿ ÿ þ ! " ÿ # þ þ þ þ ÿ þ $ % & ' ( þ þ )) þ $ þ ) ) þ ÿ þ ý ÿ ÿ )ÿ ÿ ý þÿ ý * ÿ + , , - . / # 0 1 2 ý þÿ , )þÿ ÿ ý )) þ $ ÿ ý ÿ $ ÿ þý 34 5 6 )þÿ 7 ÿ þ þÿ $ ý , . ÿ 8 9# / - : 0 8 9# / - # 0 8 9 - ÿ , 8 8 , 9 ÿ þÿ ÿ þ ;< = > þ , + , , - ÿ , 0 )þ ? ? $ ý * þ @ + )) þ )þÿ # 8 - ÿ ÿ )þÿ , 8 8 , ÿ þ A ÿ ý ÿ ÿ ) % & ' ( ý þÿ ý ÿ þB 0 ÿ , 8 8 , 9 ÿ ÿ þ 1 B B 0 ÿ + , , - ÿ ÿ þ ý þ ÿ B 2 ÿ ÿ þ ÿ B ÿ þ þ * ÿ + , , + * 8 8 / / 1 2 ý þÿ 7 0 / + , / 0 + * 8 8 / , 0 + * 8 8 : / 1 2 ý þÿ # 0 - )þÿ ÿ ý ý þ . . - ÿ 8 98 : 7 8 98 : , ÿ þÿ ÿ þ þ ÿ ý ý þ þ , 8 8 8 ;< = ÿ 8 9 8 0 C + 8 8 # / 0 , 0 # : > þ , D 3E FG H 3I ÿ )þÿ ÿ ý ý $ , $ þ 1 2 ý þÿ 0 þÿ $ ý 0 J K I * 1 2 ý þ 0 . > þ * ÿ + , , + * 8 8 / / ÿ ÿ ý ÿ ÿ ) % & ' ( ý þÿ ý 0 ÿ ÿ ý þ ÿ þ ÿ ý ý þ ? ÿ + , / 0 + * 8 8 / , 0 + * 8 8 : / þ ÿ ÿ ! " ÿ , ÿ ÿ )þÿ ý ý þ ÿ ÿ þ þ ÿ ) . - ÿ þ 7 L ÿ B þ0 ý þ ÿ ÿ ý þ ý ý þ 0 ý ÿ $ ÿ ) M B þ ÿ ÿ % & ' ( ý þÿ ý < N 0 ý $ ý þ O . þ ÿ )ÿ ÿ ÿ B þ M ý þÿ P þ )ÿ þ 0 $ ÿ = ;N 0 ÿ ÿ þ ý þ ÿ B 2 2 . ** Q R S T UV W XR S W ! ) ) þ ÿ 0 ý þ þ$ 2 . * 2 . ** 0 B ÿ ÿ ÿ Y ÿ þ þ ÿ þ ÿ ý ý þÿ ) $ 0 ý ÿ $ M ý ý þ ÿ ÿ þ þÿ $ ý # D Z ' & 4 & %[ F& \ G 4 G E þ 0 ÿ ) þ ÿ $ ý , þ 0 þ ý ÿ þ $ þ B B þ $ þ M 9 þÿ $ ý ÿ ÿ ý þ ÿ ) þÿ $ ý , < " ÿ ÿ ÿ ÿ ý ) $ 0Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 19, No. 1, January 2013
149
Figure 2. Unrooted neighbor-joining tree
computed in MEGA 5.0 (
] ^) for multivirulence
locus sequence typing) data based on
sequencing of 6 virulence genes,
_ `ab c de fg c de fh,
i j f c k f _ l cand
fdm n(3) obtained
for the 93
o dm pq ` d j r s e s k t p s u q e q misolates
compared in this study. Nine
cantaloupe-associated outbreak isolates were from the
Centers for Disease Control and Prevention
(CDC) (GenBank accession nos. JQ407055–
JQ407078) and Food and Drug Administration
(FDA) (JX141237–JX141275), 23 isolates
from Knabel et al., 2012 (
v), 29 isolates from
Chen et al., 2007 (
w), 29 from Berrang et al.,
2005 and 2010 (
xcy) (JQ946653–JQ946836),
and 3 other isolates for which sequence data
were available in GenBank. Squares indicate
reference strains representing the 5 currently
known
o z r s e s k t p s u q e q mepidemic clones.
Underlined text indicates CDC and FDA
isolates associated with the isolates from the
2011 cantaloupe-associated outbreak. Circles
indicate strains classifi ed as epidemic clone
(EC)VI. Triangles indicate strains classifi ed
as ECVII. Diamond indicates the novel
outbreak strain.
{| } ~ { | } } } } {} } } } { } } ~ } ~ {| } } } | } } } { } {} } {| } {} { ~ {| } } { { } {| ~ {| } } { } { } } } ~ { } { {| ~ {| } | } } { } {| } { } ¡ ¢ {} } { } | } } } {} {| { ~ } } | } } £{ £} { { { ¤ ¥¦ ¡ { } } | } } } { } {} } | } {| } { { } { } } } ~ {| } } { ~ ~ § ¨ © ª « ª ¬ ®ª ¯ ° « ° ± ² | } } } } ~ § ¨ © ª « ª ¬ ®ª ¯ ° « ° ± { } {| } ³ { { {} { } £ {} { } } { } | } {| } } ~ { } {| ~~} } { } } ~ } } } { ´ { µ ¶ ¢ ² } } {| } } {} { ~ } · { } { } ~ § ¨ © ª « ª ¬ ®ª ¯ ° « ° ± ¸ { { { ~ {} ~ } { } ¹ º ¡ } { {} {| { { } {} { } { { { { } {} ~ } {| } » ¼ ½ ¾ ¿ À ÁÂ Ã Ä Å Â ¾ ÆÇ È É ÊË Ì Í Î Ï É Ð É Ñ ÑÌ È É ÒÍ Ð É ÓÔ Õ Ö É ×ÒØØÌ Ù ×ØÉ Í ÚÏ ÌØ Û Ü Ø ØÉ Í Õ Ì Í Ý Þ ß ÓÒ Ï ß à É áß Ó ÊÉ Ñ Ë Í ÒÑÌ × Ì ØØÒØÊÌ Í Ñ É Ì Í Ý â Ì ã ÒÝ Ö É ×Î Ì Ì Í Ý ä Ë ÓÒØÊÒÍ É å É æ Ø áß Ó Ñ ß ß ÓÝ ÒÍ Ì ÊÒÍ Ô ç è é ê ÌÍ Ì ×æ ØÒØ Ì Í Ý ØÊÓÌ ÒÍ ØË Òë Û É Í ÊìÈ É Ì×Øß ÊË Ì Í Î ÊË É Û É Û Ð É ÓØ ß á ÊË É ë ×ÌÊáß ÓÛ áß Ó é É Í ß Êæ ë ÒÍ Ô ß á ç Ì ÊË ß Ô É Í Ø Ì Í Ý ç Ü Ð ×ÒÑ í É Ì ×ÊË ÌÊ ÊË É îÍ ØÊÒÊÜ Ê ç ÌØ ÊÉ Ü Ó áß Ó Ñ ß Ý ÒÍ Ô Ö Þ ï ð Ì ××É ×ÉØ Ì Í Ý ë Óß ñ ×É Ø òÌ ã Ì Ò×Ì Ð ×É Ì Ê à à à ìë ÌØ ÊÉ Ü ÓìáÓóÛ ×ØÊô Ì Í Ý ÊË É ç É Í Í Øæ ×ã Ì Í ÒÌ ïÊÌ ÊÉ õ Í Òã ÉÓØÒÊæ é É Í ß Û ÒÑ Ø ä ß ÓÉ è Ì Ñ Ò×ÒÊæ ØÊÌ áá áß Ó ØÉö Ü É Í Ñ ÒÍ Ô ã ÒÓÜ ×É Í ÑÉ Ô É Í É Ì Í Ý ÷ øù ú ë Óß ë Ë Ì Ô É ûÜ Í Ñ ÊÒß Í áÓÌÔ Û É Í Ê Ì Û ë ×ÒÑ ß Í Ø ì ï ìÞ ìÑ ß Í Ý Ü Ñ ÊÉ Ý ÊË ÒØ ÓÉ ØÉ Ì ÓÑ Ë à Ë Ò×É ØË É à Ì Ø Ì ã ÒØÒÊÒÍ Ô ØÑ ÒÉ Í ÊÒØÊ Ì Ê ç É Í Í Øæ ×ã Ì Í ÒÌ ï ÊÌ ÊÉ õ Í Òã É ÓØÒÊæ Ý Ü ÓÒÍ Ô ï É ë ÊÉ Û Ð É Ó ü ý Ù Ñ Êß Ð É Ó þü Õ ÿ þ þ ìð Ë ÒØ Ø ÊÜ Ý æ à Ì Ø ë Ì ÓÊÒÌ ××æ áÜ Í Ý É Ý Ð æ Ì õ ï â ï ë É Ñ ÒÌ × é ÓÌÍ Ê ß Í Ö Ò×Î ï Ì áÉ Êæ ì â Ó Þ ß Û ß Í Ì Ñ ß ÒØ Ì Í Ì ØØÒØÊÌ Í Ê ë Óß áÉ ØØ ß Ó ß á è ß ß Ý ï Ì áÉ Êæ ÒÍ ÊË É â É ë Ì ÓÊÛ É Í Ê ß á Í ÒÛ Ì × ç Ì ÊË ß ×ß Ô æ Õ õ Í Òã É ÓØÒÊ Ý É Ô ×Ò ï ÊÜ Ý Ò Ý Ò ð ß ÓÒÍ ß Õ îÊÌ ×æ ì í É Ó Û Ì ÒÍ ÓÉ ØÉ Ì ÓÑ Ë ÒÍ ÊÉ ÓÉ Ø Ê ÒØ ÊË É Ý É ã É ×ß ë Û É Í Ê Ì Í Ý Ì ë ë ×ÒÑ Ì ÊÒß Í ß á Û ß ×É Ñ Ü ×Ì Ó Û É ÊË ß Ý Ø áß Ó ØÜ Ð Êæ ë ÒÍ Ô ù ø ø ÷ ø ì    ¾ ¼ Â Ç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
