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DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
TESI DI LAUREA:
PROGETTAZIONE E SINTESI DI MOLECOLE MULTITARGET A
STRUTTURA CHINAZOLINICA PER IL TRATTAMENTO DEL
TUMORE DELLA PELLE NON MELANOMA
Relatori: Candidata: Prof.ssa Clementina Manera Giulia Soria Dott.ssa Maria Digiacomo
Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-08 Anno Accademico 2017/201
2 INDICE
1 INTRODUZIONE 4
1.1 STRUTTURA DELLA PELLE 5
1.2 FUNZIONI DELLA PELLE 9
2 CANCRO DELLA PELLE 10
2.1 MELANOMA 11
2.2 TUMORI DELLA PELLE NON MELANOMA 12
2.2.1 CARCINOMA DELLE CELLULE BASALI 13
2.2.2 CARCINOMA DELLE CELLULE SQUAMOSE 14
2.2.2.1 CHERATOSI ATTINICA 15 2.3 PATOGENESI DI NMSC 16 2.3.1 EGFR 19 2.3.2 CICLOOSSIGENASI-2 (COX-2) 21 2.3.3 HEDGEHOG 23 2.3.4 TP-53 24 2.3.5 RADIAZIONI UV 25 2.3.5.1 ROS E ANTIOSSIDANTI 26 3 STRATEGIE TERAPEUTICHE 29 3.1 CHIRURGIA 29 3.2 CURETTAGE E CAUTERIZZAZIONE 29 3.3 CRIOTERAPIA 29 3.4 TERAPIA FOTODINAMICA 30 3.5 RADIOTERAPIA 30 3.6 TRATTAMENTI TOPICI 31 3.6.1 IMIQUIMOD 31 3.6.2 5-FLUOROURACILE (5-FU) 32 3.6.3 INGENOLO MEBUTATO 33 3.6.4 DICLOFENAC 34
3.7 ALTRI TRATTAMENTI TERAPEUTICI 35
3.7.1 DFMO 35
3
3.7.3 VISMODEGIB 36
3.7.4 ITRACONAZOLO 37
3.7.5 ANTICORPI MONOCLONALI 38
3.7.6 GEFITINIB 39
4 INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE 41
4.1 PROGETTAZIONE E SINTESI DI MOLECOLE MULTITARGET 45
4.1.1 SCHEMA 1 49 4.1.2 SCHEMA 2 51 5 PARTE SPERIMENTALE 52 5.1 MATERIALI E METODI 53 5.2 SCHEMA 1 54 5.2.1 COMPOSTO 13 54 5.2.2 COMPOSTO 14 55 5.2.3 COMPOSTO 15 56 5.2.4 COMPOSTO 1 57 5.2.5 COMPOSTO 3 58 5.2.6 COMPOSTO 5 59 5.2.7 COMPOSTO 7 60 5.2.8 COMPOSTO 9 61 5.2.9 COMPOSTO 11 62 5.3 SCHEMA 2 63 5.3.1 COMPOSTO 16 63 5.3.2 COMPOSTO 17 64 5.3.3 COMPOSTO 2 65 5.3.4 COMPOSTO 4 66 5.3.5 COMPOSTO 6 67 5.3.6 COMPOSTO 8 68 5.3.7 COMPOSTO 10 69 5.3.8 COMPOSTO 12 70 BIBLIOGRAFIA 73
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INTRODUZIONE
GENERALE
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LA PELLE
1.1 STRUTTURA DELLA PELLE
La pelle è l’organo deputato a ricoprire l’intero organismo e ha il compito di proteggerlo dall’ambiente esterno e regolare inoltre la temperatura. Nell’adulto la pelle ha un peso medio di 7 Kg e una superficie di circa 1.8 mq.
Questo organo è costituito da uno strato superficiale di tipo epiteliale, l’epidermide, e un altro più interno di tipo connettivale, il derma. Sotto il derma si trova uno strato adiposo il cui spessore differisce in base alla parte del corpo in cui si trova (figura 1). Epidermide e derma sono separate da una sottile membrane chiamata membrana basale.
7 • Epidermide
L’epidermide è caratterizzata da un epitelio squamoso pluristratificato e cheratinizzato con spessore variabile da 70 a 120 µm, privo di vasi sanguigni e sistemi ghiandolari. Procedendo dallo strato più esterno a quello più profondo ritroviamo lo strato corneo, lucido, granuloso, spinoso e basale o germinativo (figura 2).
Figura 2: Struttura dell’epidermide
Lo strato più esterno, lo strato corneo, è formato da 15-20 strati di cellule morte chiamate corneociti, cellule piatte prive di nucleo e ricche di cheratina. Sottostante allo strato corneo è presente lo strato granuloso, dove i cheratinociti hanno già perso il nucleo e il citoplasma. Appare granulare in quanto queste cellule contengono
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granuli di cheratoialina che hanno la funzione di tenere legati i filamenti di cheratina. Nell’epidermide più spessa di mani e piedi, sotto lo strato corneo si può trovare lo strato lucido .
Procedendo verso gli strati più profondi, troviamo lo strato spinoso dove inizia la cheratinizzazione. Questo è lo strato più spesso, composto da cheratinociti poliedrici con grandi nuclei in quanto vi è un’attiva sintesi di proteine fibrillari. Il loro aspetto è dovuto ai numerosi microfilamenti che formano i desmosomi, resistenti connessioni tra cheratinociti adiacenti che gli conferiscono questo caratteristico aspetto spinoso. Nello strato spinoso ritroviamo anche le cellule di Langerhans che rivestono un importante ruolo a livello immunitario.
Lo strato basale o germinativo è costituito da cellule cubiche o cilindriche con un’alta capacità di replicarsi tramite mitosi. L’attività mitotica è in grado di rimpiazzare prontamente gli elementi cellulari persi con la normale desquamazione o in seguito a traumi. Attraverso il processo di cheratinizzazione, i cheratinociti basali, per mezzo di modificazioni biochimiche e strutturali come la perdita del nucleo ed altri organuli cellulari, diventano progressivamente corneociti. Nello strato basale oltre ai cheratinociti proliferativi ci sono altri tipi di cellule come melanociti, che producono melanina e cellule di Merkel, coinvolte nella sensibilità meccanica.
• Derma
Al contrario di quanto visto nell’epidermide, nel derma ritroviamo un numero minore di cellule, i fibroblasti, disperse in una matrice extracellulare composta da tessuto connettivo denso, contenente proteine fibrose come collagene (70%), elastina (4%) e mucopolisaccaridi (figura 3).
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Figura 2: Struttura del derma
Le fibre di collagene, reticolari e di elastina contenute nel derma, forniscono supporto, elasticità e resistenza meccanica alla pelle. Nel derma ci sono terminazioni nervose, afferenti ed efferenti, e una fitta rete capillare essenziale per il nutrimento non solo del derma ma anche dell’epidermide che al contrario non è vascolarizzata. Contiene inoltre meccanocettori che conferiscono sensibilità al tatto e termocettori per la sensibilità al calore. In più sono presenti follicoli piliferi, ghiandole sudoripare, ghiandole sebacee, ghiandole apocrine e vasi linfatici.
Il derma è diviso in due strati, uno più esterno vicino all’epidermide, chiamato regione papillare, e uno più profondo e spesso detto derma reticolare (figura 4).
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• Ipoderma
Al di sotto del derma vi è l’ipoderma, o strato adiposo sottocutaneo, con spessore variabile in relazione all’area corporea in cui si trova (figura 4). Gli adipociti sono gli elementi cellulari che lo caratterizzano e hanno il ruolo di immagazzinare i trigliceridi come approvvigionamento energetico per l’organismo. All’ipoderma spetta inoltre la termoregolazione corporea.
1.2 FUNZIONI DELLA PELLE
La funzione principale della pelle è quella di barriera protettiva, attribuita principalmente allo strato corneo. La pelle funge da barriera contro sostanze estranee ma anche contro microrganismi, radiazioni solari, calore e corrente elettrica.
Una seconda funzione è quella sensoria dato che in essa sono contenute terminazioni nervose capaci di raccogliere stimoli termici, tattili, pressori, vibrazionali, di sforzo e di stress.
Un’altra importante funzione è la termoregolazione, mediata dall’intervento di ghiandole sudoripare e vasi sanguigni, capaci di aumentare la loro perfusione superficiale nel caso sia necessaria una perdita di calore o in caso contrario di ridurla per evitare una perdita di calore non richiesta. La pelle controlla l’evaporazione costituendo una barriera relativamente asciutta e semi-impermeabile in grado di ridurre la perdita di fluidi corporei, di nutrienti essenziali e olii importanti per l’idratazione. Può anche assorbire alcune sostante, in piccole quantità, come ossigeno, azoto e diossido di carbonio che possono diffondere nell’epidermide, e anche alcuni farmaci.
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2 CANCRO DELLA PELLE
Il cancro della pelle è la più comune forma di cancro e a livello mondiale, rappresenta almeno il 40% dei casi di tutti i tumori. La maggior parte dei tumori della pelle consistono in una crescita cancerosa localmente distruttiva nella pelle che origina nelle cellule dell’epidermide, lo strato più esterno e superficiale.
Esistono essenzialmente tre tipi di tumori della pelle (figura 5):
• carcinoma delle cellule basali (il più comune con un’incidenza del 75%); • carcinoma delle cellule squamose (20% dei casi);
• melanoma.
I primi due originano dalle cellule epiteliali, mentre il melanoma origina dalle cellule deputate alla produzione di pigmenti (melanociti), è meno comune seppure più pericoloso dei precedenti. Questi tre principali tumori della pelle sono divenuti più frequenti negli ultimi 20-40 anni, soprattutto nelle aree dove la popolazione caucasica è più presente.(1)
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Altre rare forme di tumore della pelle includono linfomi, tumore delle cellule di Merkel e tumori di altri tessuti inclusi sarcomi o tumori che coinvolgono ghiandole sudoripare, capelli o bulbi piliferi.
2.1 MELANOMA
Il melanoma si genera nei melanociti, cellule in grado di produrre il pigmento melanina (figura 6). Può risultare più rischioso delle altre forme di cancro poichè può metastatizzare e diffondere rapidamente nelle altre aree corporee causando serie complicanze e portando perfino alla morte. I melanomi nascono perlopiù nella pelle ma in casi rari possono formarsi anche in bocca, intestino e occhi. Nelle donne le zone più colpite sono le gambe mentre negli uomini sono più comuni sulla schiena. Certe volte si sviluppano da un neo che varia in forma, dimensioni, colore, con margini irregolari e pruriginoso o da semplici lesioni della cute.
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Figura 5: Melanoma
Il melanoma rappresenta l’1% dei casi di tumori della pelle, tuttavia è la causa principali dei decessi dovuti a cancro della pelle. I casi di melanoma sono però aumentati negli ultimi 30 anni. Il rischio di sviluppare un melanoma aumenta con l’età, la media dell’età è maggiore di 60 anni ma recentemente sembra stia aumentando in individui sotto i 30 anni, infatti è uno dei tumori più diffusi nei giovani adulti (soprattutto giovani donne).(2) Il melanoma può essere efficacemente trattato se precocemente diagnosticato.
Non è chiara l’esatta causa che induce l’insorgenza del melanoma, ma certamente l’esposizione alle radiazioni ultraviolette (UV) sia solari che provenienti da lettini e lampade abbrozzanti aumenta il rischio di svilupparlo.
Altri fattori di rischio sono:
• un sistema immunitario indebolito; • predisposizione familiare;
• numero elevato di nevi o nevi irregolari ed inusuali;
• pelle chiara, in quanto una minor quantità di pigmenti come melanina implica una minor protezione nei confronti dei raggi UV e dei danni che essi causano. • vivere in vicinanza dell’equatore o in altitudine dove i raggi solari sono più
diretti.(1)
Nel 40-50 % dei casi di melanoma è stata riscontrata una mutazione genetica del gene BRAF e nel 15-20% dei casi di melanoma metastatico una mutazione del gene NRAS, geni che aumentano il rischio di formazione del melanoma.(3)
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Per confermare la diagnosi clinica è necessaria una biopsia che è seguita generalmente da un’ampia incisione della formazione o del tumore. La chirurgia rappresenta il principale e più ampiamente usato metodo per il trattamento dei melanomi.
2.2 TUMORI DELLA PELLE NON-MELANOMA
Con il termine tumore della pelle non-melanoma (NMSC) ci si riferisce essenzialmente al carcinoma delle cellule basali (BCC), al carcinoma delle cellule squamose (SCC) e alla relativa lesione, non invasiva, cheratosi attinica (AK).
Solo negli Stati Uniti la diagnosi e il trattamento dei tumori della pelle non-melanoma ha subito un incremento del 77% tra il 1994 e il 2014.(4) Di questi BCC è il più comune nell’uomo, con una stima di 4.3 milioni di casi diagnosticati negli USA ogni anno.(5) Il carcinoma delle cellule squamose costituisce il 20% di tutti i tumori della pelle contando più di 1 milione di nuovi casi ogni anno al mondo ma è il più diffuso in individui immunodepressi.(6) BCC è circa 4 o 5 volte più frequente di SCC.
Altri tipi di tumori che appartengono agli NMSC anche se meno comuni sono il carcinoma delle cellule di Merkel, il fibroxantoma atipico e il linfoma cutaneo.
2.2.1 CARCINOMA DELLE CELLULE BASALI (BCC)
Il carcinoma delle cellule basali o carcinoma basocellulare o basalioma (BCC) è caratterizzato da una crescita anormale e incontrollata o da lesioni che nascono dalle cellule basali, cellule staminali pluripotenti, nello strato più profondo dell’epidermide (figura 7).
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Figura 6: Carcinoma delle cellule basali
Nonostante si sviluppi più comunemente nel viso e sul naso, quindi prevalentemente sulla pelle esposta ai raggi solari, non è raro che possa apparire in altre parti del corpo, compreso il tronco, le gambe e le braccia. Quasi 2/3 di BCC nasce nelle aree più esposte al sole, l’altro 1/3 si forma in distretti anche non esposti dimostrando una certa suscettibilità genetica. Individui che utilizzano frequentemente dispositivi abbronzanti rischiano di sviluppare BCC più precocemente. Questo tipo di neoplasia si accresce lentamente e solo occasionalmente diffonde in altri distretti corporei. Talvolta BCC può diffondere in profondità, distruggendo il tessuto epiteliale e perfino quello osseo. Si presenta comunemente come un’ulcera che può anche sanguinare. Questi tipi di carcinomi nonostante siano localmente invasivi con la tendenza a scavare il tessuto, non metastatizzano o si diffondono in aree più distanti. Pazienti con BCC hanno un rischio più elevato di sviluppare altri basaliomi oppure altri tipi di tumori della pelle come melanomi maligni o carcinomi delle cellule squamose o altre neoplasie non cutanee.
I basaliomi possono essere divisi in tre gruppi principali in base al tipo di crescita.
• BCC superficiali, primariamente riferiti a basaliomi in-situ, sono caratterizzati da una proliferazione superficiale di cellule basali neoplastiche.
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• BCC infiltrativi, che comprendono a loro volta basaliomi morfeiformi e micronodulari, risultano più difficili da trattare con metodi conservativi data la loro tendenza a penetrare più in profondità nei tessuti cutanei.
• BCC nodulari, in cui la lesione si presenta come noduli ben visibili generalmente sferoidali che spesso vanno incontro ad ulcerazione ed emorragia. Si ritrova più spesso sulla testa.
2.2.2 CARCINOMA DELLE CELLULE SQUAMOSE
Il carcinoma delle cellule squamose (SCC) è una neoplasia che tende a svilupparsi sulla cute che è stata ripetutamente esposta al sole. Le aree più interessate sono quindi, ancora una volta, testa, collo e dorso delle mani. È però possibile sviluppare SCC in qualunque parte del corpo, inclusi l’interno della bocca, labbra e genitali. Questo tumore della pelle è più comune tra individui dalla pelle chiara che per anni si sono esposti alle radiazioni solari, ma individui di ogni fenotipo possono sviluppare SCC.
Figura 7: Carcinoma delle cellule squamose
Ha inizio nelle cellule squamose (figura 8), cellule sottili e piatte somiglianti a scaglie, che si trovano sulla superficie della cute, nel rivestimento degli organi interni, del tratto digerente e respiratorio. La maggior parte dei tumori di ano, cervice, testa, collo
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e vagina sono carcinomi delle cellule squamose, anche chiamati carcinomi epidermoidi.
Clinicamente SCC appare spesso come una chiazza persistente rossa, squamosa, che se stimolata può sanguinare. SCC può occasionalmente ripresentarsi, anche in seguito a trattamenti non efficienti, e diffondere in altri distretti corporei. È comunque raro che causi il decesso.
Nella maggior parte dei casi il suo decorso biologico è simile al basalioma con una piccola ma più significante probabilità di diffondere. Con una diagnosi e un trattamento tempestivo SCC è ritenuto altamente curabile.
2.2.2.1 CHERATOSI ATTINICA
La cheratosi attinica, AK, è una comune neoplasia intra-epidermica considerata la fase precancerosa di SCC.(7) É una lesione dell’epidermide che coinvolge i cheratinociti, cellule deputate alla produzione di cheratine all’interno dello strato spinoso. AK può presentarsi in seguito ad un danneggiamento della cute ad opera di radiazioni UV solari o derivanti da dispositivi abbronzanti. Molto spesso può accadere che si sviluppi più di una lesione di AK. È considerata una forma precancerosa in quanto se non trattata questa può evolvere in SCC, ciò si verifica in almeno il 20% delle lesioni non curate.(7)
Le lesioni appaiono come aree spesse, squamose o incrostate, spesso aride e ruvide, solitamente sono asintomatiche ma possono essere pruriginose, possono sanguinare e dare una sensazione di bruciore.
Le cheratosi sono classificate in base al loro aspetto clinico (figura 9): • Grado I, facilmente visibile, lievemente palpabile,
• Grado II, facilmente visibile e palpabile,
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Figura 8: Evoluzione della cheratosi attinica
2.3 PATOGENESI DI NMSC
La maggior parte dei tumori della pelle nasce da mutazioni del DNA, indotte da radiazioni UV, che interessano le cellule dell’epidermide (figura 10). Nella fase precoce queste mutazioni possono essere controllate e riparate dal sistema immunitario, che tuttavia, se risulta compromesso non può impedire lo sviluppo di masse di cellule maligne capaci di generare una crescita tumorale incontrollata.(8)
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Le cellule tumorali possono distuggere la membrana basale e formare foglietti o masse compatte che invadono i tessuti connettivi adiacenti (derma). Nei carcinomi ben differenziati le cellule tumorali sono atipiche/pleomorfiche, ma somiglianti ai normali cheratinociti (cellule larghe, poligonali, con un abbondante citoplasma eosinofilico e nucleo centrale), e la loro disposizione tende ad essere simile a quella delle normali cellule dell’epidermide: cellule immature/basali alla periferia che diventano più mature al centro della massa tumorale. Le cellule tumorali si trasformano in squame cheratinizzate e vanno a formare noduli rotondeggianti con rivestimenti concentrici e laminari chiamati "nidi cellulari" o "perle epiteliali/cheratiniche". Lo stroma circostante è ridotto e contiene infiltrato infiammatorio (linfociti). Gli SCC scarsamente differenziati contengono più cellule pleomorfiche e hanno scarsa cheratinizzazione.
La causa ambientale primaria di tumore della pelle è l’esposizione frequente ai raggi solari. Le radiazioni UV accelerano l’invecchiamento della pelle e la promozione di tumori della pelle, come basalioma, spinalioma e melanoma maligno.
Una storia regressa di ripetute scottature solari aumenta di molto il rischio di sviluppare sia BCC che SCC, generalmente scottature avute in giovane età sono associate alla comparsa SCC, mentre scottature avute a qualsiasi età sono associate alla comparsa di BCC. L’abbronzatura indoor può invece determinare SCC ma non BCC.
La formazione del basalioma è probabile che risulti da una complessa interazione tra predisposizione genetica e fattori esterni, soprattutto esposizione a radiazioni ultraviolette.(9)
Esistono, comunque, altri fattori di rischio che giocano un importante ruolo (figura 11):
• fumo di tabacco;
• infezioni da papilloma virus (rischio aumentato di carcinoma delle cellule squamose);
• alcune patologie genetiche come la sindrome dei nevi melanocitici congeniti; • presenza di ferite non cicatrizzate (una di queste, ulcera di Marjolin, può
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• radiazioni ionizzanti come raggi X, agenti cancerogeni ambientali; • invecchiamento;
• il fenotipo di tipo 1 con capelli rossi o biondi, occhi verdi o blu, pelle chiara e presenza di lentiggini;
• una storia familiare di tumori della pelle;
• consumo eccessivo di alcol, che può essere correlato ad un aumento del rischio di scottature;
• uso di trattamenti immunosoppressori.
Figura 10: Fattori di rischio per NMSC
La pelle è un tessuto dinamico e in quanto tale è capace di un rinnovo cellulare continuo e costante, di crescita e differenziazione. Tutte queste fasi sono attentamente regolate da diverse vie di segnalazione implicate nell’omeostasi della cute e nella sua corretta funzionalità. Un disequilibrio di queste vie (figura 12) può condurre alla propagazione del tumore.
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Figura 11: Vie di segnalazione coinvolte nella patogenesi di NMSC
2.3.1 EGFR
Un importante pathway implicato nella tumorigenesi è la via di segnalazione indotta dall’attivazione del recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR), che è stato dimostrato giochi un ruolo fondamentale nella crescita e sopravvivenza cellulare di molte neoplasie.(10) EGFR fa parte di una famiglia di recettori protein chinasici transmembrana conosciuti come famiglia di recettori ErbB o HER: EGFR (HER1 or ErbB1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), e Erb4 (HER4).
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Figura 12: Attivazione di EGFR
L’EGFR è una glicoproteina transmembrana che consiste in un sito di legame extracellulare, un dominio idrofobico transmembrana, e un dominio intracellulare con attività tirosin-chinasica. L’EGFR è attivato quando un suo specifico ligando, come il fattore di crescita epiteliale (EGF), il fattore alfa di trasformazione cellulare (TGF-α), anfiregulina, betacellulina, eparina legante EGF e epiregulina, si lega al suo dominio extracellulare. Questo legame induce una variazione conformazionale che espone un braccio di dimerizzazione, portando alla dimerizzazione del recettore con un altro EGFR (omo-dimerizzazione) o un altro membro della famiglia di EGFR (eterodimerizzazione) (figura 13). Dopo la dimerizzazione del recettore, l’attivazione della proteina tirosin-chinasi intrinseca innesca l’autofosforilazione della tirosina, dando inizio ad una cascata di segnalazione mitogena intracellulare e altre attività cellulari (figura 13).
L’attivazione di EGFR determina la trascrizione del segnale attraverso diverse vie che coinvolgono le cascate di RAS-RAF-MAPK, PI3K, SRC chinasi, STAT. In questo modo sono regolati una moltitudine di processi biologici inclusi apoptosi, differenziazione, proliferazione, motilità, invasione cellulare, adesione, riparo del DNA, e sopravvivenza.(11)
Nell’adulto EGFR è normalmente espresso nella cute, in primo luogo nei cheratinociti proliferativi indifferenziati delle cellule dello strato basale epidermico, nei sebociti e nel rivestimento esterno dei follicoli piliferi, nelle cellule muscolari lisce dei muscoli di erezione dei peli e nelle arterie del derma.(10)
L’espressione dei membri della famiglia di ErbB in NMSC è stata perlopiù studiata dal punto di vista immuno-istochimico. È stato rilevato un legame specifico di EGFR
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in approssimativamente il 50% dei casi di BCC e il 100% dei casi di SCC cutaneo.(12) Un altro studio condotto da Liu e colleghi ha dimostrato una reattività positiva con un anticorpo EGFR in ogni BCC testato e una debole colorazione di ErBb2 in solo un terzo dei BCC. Lo stesso studio ha riportato reattività di EGFR e ErbB2 rispettivamente nel 92.3% e nell’84.6% dei casi di SCC cutaneo.(10)
2.3.2 CICLOOSSIGENASI-2 (COX-2)
La cicloossigenasi (COX) è un enzima che catalizza la sintesi di prostaglandine, prostacicline, leucotrieni e trombossani a partire dall'acido arachidonico. Questi prodotti mediano e sostengono i processi infiammatori tissutali, quali la vasodilatazione, l'aumento di temperatura corporea e la sensazione dolorifica. Esistono due isoforme di COX (COX1 e COX2) le quali condividono più del 60% di sequenza omologa con attività catalitica simile ed entrambe sono state clonate e sequenziate.
Il ruolo proinfiammatorio è associato alla COX-2, mentre la COX-1 regola alcune funzioni fisiologiche come l'aggregazione piastrinica e la protezione della mucosa gastrica dall'ambiente acido dello stomaco.
L'attività della COX-2 è associata anche alla cancerogenesi di diversi tumori, tra cui il NMSC. Esiste un’ampia documentazione, derivante da esperimenti su modelli animali e studi epidemiologici, che dimostra come le cicloossigenasi siano intimamente coinvolte nella promozione e nella progressione degli stadi di NMSC e quindi possono divenire ottimi target per la prevenzione di NMSC.(13)
Le radiazioni UV sono un noto stimolo per l’espressione di COX-2 nell’epidermide (Fig. 14).(14)
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Figura 13: Via di segnalazione delle COX
L’espressione di COX-2 indotta da UV fa aumentare le quantità di prostaglandina E2 (PGE2), uno dei maggiori prodotti della cicloossigenasi implicata nello sviluppo di NMSC. PGE2 si lega a quattro recettori accoppiati a proteina G, EP1–EP4, sulla superficie delle cellule, inclusi i cheratinociti (figura 14).(14)Ciascun recettore attiva distinte vie di segnalazione sebbene esistano punti in comune tra questi pathway. EP1, EP2, e EP4 sono state collegate alla carcinogenesi cutanea indotta da UV in modelli animali.(14) PGE2 è stato dimostrato che stimoli la proliferazione delle cellule tumorali, inibisca l’apoptsi, stimoli una risposta infiammatoria, promuova un’immunosoppressione e faciliti l’invasione tumorale (figura 14).
Tutte queste attività funzionali di PGE2 sono responsabili dello sviluppo di SCC cutanei indotti da UV.
Questi risultati suggeriscono che inibitori di COX-2 potrebbero avere potenti effetti anticarcinogenici su tumori della pelle indotti da UVB.(15)
25 2.3.3 HEDGEHOG
Figura 14: Pathway di Hedgehog
Il pathway Hedgehog (Hh) è un processo chiave nello sviluppo embrionale e la differenziazione cellulare, coinvolto nell’organizzazione di cervello e midollo spinale, è anche essenziale per la disposizione tridimensionale degli organi interni e degli arti e nel controllo della lunghezza del corpo.(16)
Pertanto la via di segnalazione Hh è particolarmente attiva nell'embriogenesi, mentre risulta poco attiva e poco presente nell'adulto. Un’attivazione di questa via in età adulta è attribuibile alla fisiopatologia di molte forme di tumore e quindi può costituire, un target per un trattamento mirato di alcuni tumori.
La famiglia di ligandi proteici di Hh è composta da tre membri principali: Sonic Hedgehog (SHH), Desert Hedgehog e Indian Hedgehog che hanno la capacità di legare il recettore PTCH (figura 15). Il ligando SHH è quello più noto. Il legame del ligando SHH con il recettore PTCH porta alla perdita dell’inibizione della proteina G detta Smoothened (SMO), che va ad attivare segnali di trasmissione del segnale
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intracellulare mediante il fattore di trascrizione dell’oncogene associato al Glioma (GLI) (figura 15). Tale proteina, attraverso la trasmigrazione nucleare, andrà ad attivare molti geni bersaglio coinvolti nella proliferazione, sopravvivenza e differenziazione cellulari.(17)
È stato dimostrato che in più del 90% dei BCC si ha un'attivazione anomala della via Hh.(18)
La maggior parte dei tumori BCC presenta mutazioni inattivanti nel PTCH (circa 90%) che perde la sua capacità di inibire la proteina SMO. In circa il 10% dei casi di BCC si hanno mutazioni attivanti in SMO che, indipendentemente dall’azione inibitoria della proteina PTCH, trasduce il segnale intracellulare.(18)
Quindi considerando il fatto che l’anomala attivazione del pathway Hh è determinante nello sviluppo del BCC, in quanto induce la proliferazione incontrollata delle cellule basali della cute, l’inibizione di questo pathway potrebbe essere utile per il trattamento di BCC.
2.3.4 TP-53
Figura 15: Regolazione di P53
TP53, è un gene che codifica per la proteina P53 che regola il ciclo cellulare e quindi ha come funzione la soppressione del tumore. P53 è stato descritto come “guardiano
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del genoma” riferendosi al suo ruolo nella conservazione della stabilità mediante blocco di mutazioni genomiche.(19)
Nelle cellule normali la proteina p53 è presente in basse concentrazioni. Il danno al DNA e altri segnali di stress possono indurre l’aumento di questa proteina, che possiede tre funzioni principali: arresto della crescita, riparo del DNA e apoptosi (morte cellulare). L’arresto della proliferazione ferma la progressione del ciclo cellulare evitando così la replicazione di DNA danneggiato. Durante il blocco della proliferazione, p53 può attivare la trascrizione di proteine coinvolte nella riparazione del DNA. L’apoptosi è l’ultima mossa per evitare la proliferazione di cellule contententi DNA anomalo.
La concentrazione cellulare di p53 deve essere quindi rigorosamente regolata. Mentre da un lato può sopprimere la proliferazione tumorale, alti livelli di p53 possono accelerare il processo di invecchiamento mediante un’apoptosi eccessiva. Il principale agente regolatore di p53 è Mdm2, il quale può innescare la degradazione di p53 (figura 16).(20)
Approssimativamente il 90% di SCC e il 50% di BCC presentano una mutazione di p53,(21) che possono rendere le cellule resistenti all’apoptosi portando ad una espansione clonale di cheratinociti precancerosi.
2.3.5 RADIAZIONI UV
L’esposizione alle radiazioni UV è ritenuta un cancerogeno completo poichè interessa ogni stadio della carcinogenesi. Infatti esso conduce a un danno cellulare a causa di una riduzione di cellule che mediano la risposta immunitaria, della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’alterazione del DNA.(22) L’evento inziale dopo esposizione a UV è l’apoptosi dei cheratinociti mediata dal pathway di p53/p21/bax/bcl-2, seguito da una fase iperproliferativa che conduce ad un’iperplasia epidermica.(23)
L’esposizione cronica a radiazioni solari non ionizzanti, soprattutto UVA e UVB, è il principale fattore di rischio nella patogenesi di NMSC. Gli UVB causano direttamente un danno a DNA e RNA inducendo legami covalenti tra pirimidine adiacenti che portano alla formazione di fotoprodotti mutageni come dimeri di ciclopirimidine (TT)
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e fotoprodotti (6-4) pirimidina-pirimidina. Inoltre le radiazioni UV causano anche danni indiretti mediante la produzione di radicali liberi e un’immunosoppressione indotta.(24)
Gli UVA sono meno mutageni degli UVB, e causano un danno non diretto al DNA tramite un meccanismo foto-ossidativo mediato da stress che risulta nella produzione di ROS e intermedi azotati reattivi che interagiscono con lipidi, proteine e DNA per generare intermedi che si legano al DNA formando addotti.(25)
Per di più, è stato dimostrato, che sia UVB che UVA aumentano i livelli di ossido nitrico (NO) cutaneo stimolando la NO sintetasi. Come diretta conseguenza alte concentrazioni di NO e di ROS portano alla produzione di perossinitriti risultanti dalla combinazione di NO e ROS. I perossinitriti sono estremamente tossici per il DNA. Sono indispensabili complessi sistemi di riparazione del DNA per limitare gli effetti negativi di questi prodotti premutageni. Un’esposizione intermittente è più frequentemente associata alla comparsa di BCC mentre l’esposizione costante e continua è legata a SCC.(26)
L’esposizione a UV influenza l’espressione di p53 che risulta alterata sia nella AK che nel carcinoma delle cellule squamose e per questo può essere confermata l’ipotesi che l’AK sia un precursore invasivo di SCC.(27)
2.3.5.1 ROS E ANTIOSSIDANTI
Le cellule cancerose sono caratterizzate da un’aumentata produzione di ROS e da alterate condizioni redox rispetto alle cellule normali. I radicali liberi possono essere definiti come molecole o frammenti molecolari contenenti uno o più elettroni spaiati. La presena di elettroni spaiati su un radicale libero solitamente conferisce un considerevole grado di reattività. I radicali derivati dall’ossigeno rappresentano la classe più importante di tali specie generate nei sistemi viventi. I ROS principali sono l’anione superossido (O2-), il perossido d’idrogeno (H2O2) e il radicale idrossido (OH·).
In condizioni fisiologiche, i ROS sono continuamente generati ed eliminati, attraverso i sistemi deputati al loro smaltimento, al fine di mantenere l'omeostasi cellulare. Le cellule mirano a mantenere un equilibrio redox ideale per supportare i processi cellulari come differenziazione e proliferazione e consentire l'adattamento allo stress
29
metabolico e immunitario. Cambiamenti nel bilancio redox, che possono avere cause endogene o esogene, determinano un aumento dei livelli di ROS, o della velocità di produzione di queste, con conseguente danneggiamento delle cellule per stress ossidativo e per una non corretta segnalazione cellulare. Oppure si può avere una diminuzione di ROS, portando a un'interruzione della segnalazione cellulare e quindi all’interruzione dell’omeostasi cellulare. Squilibri redox, stress ossidativo, e conseguenti livelli irregolari di antiossidanti, sono i segni distintivi di molti tumori.(28) La cute risponde spontaneamente agli aumentati livelli di ROS, indotti da UVR o agenti chimici, tramite enzimi di detossificazione come superossido dismutasi, catalasi, tioredoxina reduttasi, e molecole di basso peso molecolare antiossidanti come glutatione, α-tocoferolo e acido ascorbico.(29)
Tuttavia questa risposta può non essere sufficiente a prevenire il danno ossidativo alle cellule cutanee a seguito di una eccessiva o ripetuta esposizione ad agenti cancerogeni. Quindi i ROS possono ossidare lipidi, proteine e DNA portando alla formazione di prodotti ossidati come lipidi idroperossidi e 8-osso-guanosina.(30) Se queste alterazioni si verificano nei geni coinvolti nei normali meccanismi omeostatici che controllano la proliferazione e la morte cellulare o nel ciclo cellulare, si assisterà a significative anomalie che condurranno al primo stadio del cancro.(31)
ROS indotte da stress ossidativo possono in ultimo portare a morte cellulare tramite apoptosi o necrosi. In particolare, le ROS accumulate giocano un ruolo chiave nell’invecchiamento intrinseco e nel foto-invecchiamento di pelle umana in vivo, ed è quindi suggerito che siano responsabili di vari tipi di cancro della pelle e altri disturbi infiammatori cutanei.
30
Figura 16: Bilancio naturale dei livelli di ROS intracellulari.
La ricerca si è focalizzata quindi anche sui trattamenti antiossidanti, per attenuare i livelli di ROS, come strategie terapeutiche contro la tumorigenesi. I trattamenti antiossidanti comprendono l'integrazione di scavenger naturali di ROS, trattamento con antiossidanti esogeni e altre strategie che mirano a diminuire lo stress ossidativo come l’interruzione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali che producono ROS.(32)
31
3 STRATEGIE TERAPEUTICHE
Le terapie convenzionali consistono in interventi chirurgici o nell'utilizzo di agenti fisici.
3.1 CHIRURGIA
La chirurgia è il metodo più utilizzato ed efficace per il trattamento del tumore della pelle. Con un intervento chirurgico vengono trattati anche casi più complessi.
La chirurgia Mohs, un’asportazione microscopicamente controllata, è solitamente impiegata da parte di un dermatologo per trattare ampi tumori della pelle che hanno penetrato in profondità la cute o tendono a ricomparire. Questa metodologia può essere utilizzata anche in certe aree difficili da trattare come le zone limitrofe a occhi, naso, labbra e orecchie.
La chirurgia Mohs è in grado di ridurre la quantità di cute sana asportata e di accettarsi che tutta la massa tumorale sia correttamente asportata.
3.2 CURETTAGE E CAUTERIZZAZIONE
Il curettage e la cauterizzazione sono usati per trattare alcuni basaliomi e spinaliomi in situ e vengono solitamente effettuati da dermatologi.
Il tumore verrà scavato per mezzo di un piccolo e affilato strumento chiamato curette. Sarà poi applicato del calore (cauterizzazione) per fermare il sanguinamento e distruggere il rimanente tessuto tumorale. La ferita dovrebbe guarire in poche settimane lasciando una piccola tonda e piatta cicatrice.
3.3 CRIOTERAPIA
La crioterapia, o criochirurgia, è una tecnica di congelamento usata per rimuovere macchie solari e alcuni basaliomi superficiali.
32
Il medico, solitamente un dermatologo, vaporizza azoto liquido sulla macchia solare o sul tumore epiteliale e sulle aree circostanti. Questo trattamento causa una sensazione di bruciore che perdura per qualche minuto. L’azoto liquido congela e uccide le cellule epiteliali anomale e crea una ferita, che per alcuni giorni apparirà come un’ulcera rossastra che può anche trasudare o coprirsi di vesciche.
3.4 TERAPIA FOTODINAMICA
La terapia fotodinamica si riferisce all’attivazione di un fotosensibilizzante, applicato topicamente o distribuito sistematicamente, nel tessuto neoplastico o displastico mediante una luce di appropriata lunghezza d’onda e in presenza di ossigeno. Questa procedura conduce alla produzione di ROS, soprattutto O·, capaci di modificare le funzioni cellulari o di innescare la morte cellulare mediante apoptosi o necrosi, promuovendo così la distruzione del tumore.
La terapia fotodinamica (PDT) si avvale di una crema e di una sorgente di luce appropriate per il trattamento di macchie solari, BCC superficiali e spinaliomi in situ (morbo di Bowen).
Tra gli effetti collaterali si annoverano rossore e rigonfiamento che però solitamente migliorano dopo pochi giorni. Alcuni pazienti riportano una sensazione di bruciore particolarmente frequente nei trattamenti sul volto.
3.5 RADIOTERAPIA
La radioterapia utilizza radiazioni come raggi X o fasci di elettroni per danneggiare ed uccidere le cellule cancerose. È usato per BCC o SCC in aree che sono difficili da trattare chirurgicamente, come il viso, e per tumori che si sono diffusi o che si sono ripresentati. Questo metodo è stato suggerito come trattamento di elezione per NMSC ad alto rischio in pazienti che sono impossibilitati a tollerare un intervento chirurgico. La radioterapia può essere usata come palliativo per migliorare lo stile di vita di pazienti con una malattia ad uno stadio avanzato o incurabile.
33 3.6 TRATTAMENTI TOPICI
Alcune macchie cutanee e forme tumorali possono essere trattati con creme o gel applicabili direttamente sulla cute. Questi sono chiamati trattamenti topici, possono contenere come principio attivo farmaci immunoterapici o chemioterapici.
3.6.1 IMIQUIMOD
L’imiquimod è un modificatore sintetico della risposta immunitaria appartenente alla famiglia dell'imidazochinolone. Agisce stimolando il recettore 7 toll-like, che è espresso su cellule dendritiche e monociti, portando ad un aumento della produzione di citochine e chemochine che a loro volta promuovono sia i linfociti T-helper-1 innati che una risposta immunitaria cellulo-mediata adattativa. Questo è un tipo di farmaco immunoterapico che induce il sistema immunitario dell’organismo a distruggere le cellule tumorali.
L’applicazione topica di imiquimod al 5% è un'opzione terapeutica non invasiva emergente per il BCC superficiali e nodulari. Anche macchie solari e SCC in situ (malattia di Bowen) possono essere trattati con questa preparazione. L'applicazione di imiquimod avviene direttamente sull'area colpita una volta al giorno alla sera, di solito cinque giorni a settimana per sei settimane.
L'imiquimod può causare la formazione di croste, che possono essere fastidiose. La pelle trattata può divenire rossa e infiammata e può essere sensibile al tatto. Alcuni individui hanno riscontrato una seria reazione allergica a imiquimod con dolore o prurito nella zona interessata, febbre, mal di testa ed eruzione cutanea, ma questo si verifica raramente.(33)
34 3.6.2 5-FLUOROURACILE (5-FU)
Il 5-fluorouracile (5-FU) è un antimetabolita antineoplastico che blocca la sintesi di DNA e RNA inibendo l'enzima timidilato sintetasi. In questo modo si impedisce a purine e pirimidine di essere incorporate nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare. È stato approvato come trattamento topico per AK e malattia di Bowen dalla fine degli anni '60, ma è raramente usato per trattare il BCC. Può essere usato, sotto forma di crema, per trattare BCC superficiali, macchie solari e, talvolta, SCC in situ (malattia di Bowen). Funziona meglio su viso e cuoio capelluto. Durante il suo utilizzo, è normale essere più sensibili al sole per cui occorre evitare di esporsi. La cute trattata può divenire arrossata, coprirsi di vesciche, squamarsi e rompersi. Questi effetti si risolvono solitamente entro poche settimane dopo il termine del trattamento.
Spesso viene utilizzata la capecitabina, che è un precursore selettivo del 5-fluororacile all'interno delle cellule tumorali, fornendo il vantaggio di andare selettivamente sul sito del tumore con conseguente esposizione prolungata delle cellule tumorali al 5-fluorouracile.
I dati riportati a proposito dell’infiammazione dovuta a AK durante il trattamento con capecitabina suggeriscono che questo farmaco potrebbe avere un ruolo nel trattamento di AK e di altri NMSC.(34)
35 3.6.3 INGENOLO MEBUTATO
L’ingenolo mebutato (IM) è un estratto della pianta Euphorbia peplus, noto anche come asclepiade, che è stato utilizzato per diversi anni come rimedio domestico per alcuni stati della pelle come AK e tumore epiteliale.(35)
Ha un duplice meccanismo d'azione, causando dapprima la chemoablazione e poi la rottura della membrana plasmatica con conseguente perdita del potenziale di membrana mitocondriale e gonfiore mitocondriale, mira in modo specifico ai cheratinociti displastici portando alla morte cellulare rapida indotta da necrosi primaria. IM induce anche una rapida guarigione e il ripristino della normale morfologia clinica e istologica. Questa necrosi permette all'IM di rimanere attivo anche in presenza di cellule tumorali resistenti all'apoptosi. In secondo luogo IM induce infiltrazione di neutrofili, produzione di anticorpi specifici del tumore e citochine proinfiammatorie, portando ad una citotossicità cellulare anticorpo-dipendente che elimina le cellule residue.(35)
L’IM è un nuovo tipo di chemioterapia topica per le macchie solari, viene somministrato come gel, per l'applicazione su cute colpita una volta al giorno per due o tre giorni.
Gli effetti collaterali possono includere arrossamento della pelle, desquamazione, lieve gonfiore, formazione di croste o vesciche. Questi effetti indesiderati dovrebbero scomparire entro un paio di settimane dal termine del trattamento.(1)
36 3.6.4 DICLOFENAC
Il diclofenac è un farmaco antinfiammatorio non steroideo (NSAID) che inibisce COX-1 e COX-2. La formulazione in gel di diclofenac al 3% e acido ialuronico al 2.5% (SolarazeTM), è un agente approvato dalla FDA, disponibile in commercio per il
trattamento di AK per uso topico. Il meccanismo d'azione è il blocco della COX-2, così da ridurre l'angiogenesi e la proliferazione cellulare.
Recentemente, il diclofenac per uso topico ha mostrato di sovraregolare l’apoptosi. Questo meccanismo sembra essere caratteristico del diclofenac in presenza di acido ialuronico, e l'effetto terapeutico risultante sembrerebbe essere correlato alla sensibilizzazione di cheratinociti neoplastici per l'apoptosi.(36)
SolarazeTM è usato due volte al giorno per un massimo di 90 giorni. È stato dimostrato
che quattro settimane dopo 60 giorni di trattamento, il 100% delle cheratosi attiniche è stato eliminato nel 33% dei pazienti e, dopo 90 giorni di trattamento, la clearance del 100% era del 50% Diclofenac e acido ialuronico ad uso topico hanno dimostrato di essere sicuri ed efficaci per il trattamento di AK sulla mucosa del labbro, con un minimo di irritazione. Nella maggior parte dei casi, si osserva una lieve formazione di croste, mentre le cheratosi attiniche si stanno risolvendo. Gli eventi avversi con diclofenac ad uso topico includono reazioni al sito di applicazione, prurito, eritema, pelle secca, esfoliazione, edema localizzato, parestesia e meno frequentemente, fotosensibilità.
37 3.7 ALTRI TRATTAMENTI TERAPEUTICI
3.7.1 DFMO
La difluorometilornitina (DFMO) inibisce irreversibilmente l'ornitina decarbossilasi (ODC), l'enzima limitante la velocità nella sintesi delle poliammine. Le poliammine causano la proliferazione cellulare attraverso la regolazione dell'espressione genica e livelli elevati di ODC e poliammine sono associati al cancro epiteliale.(37) In modelli murini di tumore epiteliale è stato visto che ODC è fortemente indotta dalle radiazioni ultraviolette e da cancerogeni chimici.(38)
Studi preclinici hanno dimostrato che l'inibizione dell'ornitina decarbossilasi (ODC) da parte dell’α-difluorometilornitina (DFMO) e le conseguenti diminuzioni delle concentrazioni tissutali di poliammine (putrescina e spermidina) prevenga gli sviluppi neoplastici in molti tipi di tessuto.(39) Sebbene la DFMO non abbia mostrato efficacia nella terapia oncologica, è stato dimostrato che è in grado di ridurre le lesioni premaligne di pelle e colon.(40)
In uno studio di fase 3 sulla prevenzione del tumore della pelle è stata dimostrata l’efficacia di una somministrazione giornaliera di DFMO nel prevenire la comparsa di un nuovo NMSC.(39) Un dosaggio giornaliero di 500 mg/m2 di DFMO per un massimo di 5 anni in soggetti con precedente storia di cancro della pelle, sembrerebbe ridurre significativamente l’incidenza di nuovi BCC. Inoltre questi studi hanno rivelato che è sicuro e tollerabile.(39)
Alberts et al. hanno dimostrato che un trattamento di sei mesi con una preparazione di DFMO per uso topico in soggetti con AK da moderata a grave ha determinato una riduzione statisticamente significativa del 23,5% nel numero di lesioni precancerose rispetto al placebo.(41)In questo studio è stata identificata anche una riduzione delle concentrazioni cutanee di spermidina, una poliammina.
38 3.7.2 CICLOPAMINA
La prima terapia ben studiata che aveva come target il pathway Hh è stata quella con la ciclopamina, un alcaloide endogeno steroideo derivato dai gigli di mais.(42) La ciclopamina inibisce competitivamente Smo legandosi direttamente al dominio transmembrana di questa proteina. Questo induce deformità nell'embriogenesi e porta all'inibizione della crescita nelle cellule maligne.(42) In un lavoro del 2004 è stato valutato l'uso topico di questo inibitore in un piccolo numero di pazienti con BCC. Ognuno di questi pazienti ha sperimentato un miglioramento clinico con la regressione istologica del tumore attribuita all'induzione dell'apoptosi.(43)
Di conseguenza, sono stati sviluppati derivati sintetici della ciclopamina per ottimizzare gli effetti inibitori sul pathway di Hh, principalmente per mezzo dipiccole molecole antagoniste di Smo.(44)
39
Recentemente è stato immesso in commercio il vismodegib, che è un inibitore della proteina SMO. Questo farmaco è indicato nelle forme avanzate di BCC, anche metastatico, nonché nella prevenzione.(44)
Il vismodegib viene somministrato quotidianamente per via orale. Gli effetti collaterali includono spasmi muscolari, affaticamento, disturbi gastrointestinali. Nonostante questo farmaco risulti efficace, le cellule tumorali possono sviluppare resistenza attraverso mutazioni della proteina SMO.
Negli studi clinici di Fase I, vismodegib è stato relativamente ben tollerato, e ha evidenziato l'inibizione del pathway Hh, compresa la soppressione di Gli.(45)
3.7.4 ITRACONAZOLO
Il farmaco antimicotico sistemico itraconazolo, un derivato azolico approvato dalla FDA che inibisce la biosintesi dell'ergosterolo e del colesterolo, è stato identificato come antagonista del segnale Hh.
È stato dimostrato che l’itraconazolo è un agonista inverso di Smo, che porta all'inibizione della via di segnalazione Hh, in un sito diverso da quello della ciclopamina e dei suoi derivati, e quindi alla regressione del tumore in modelli in vitro e modelli murini di BCC.(44) Oltre alla via di Hh, l’itraconazolo inibisce l'angiogenesi bloccando il fattore di crescita dell'endotelio vascolare e il fattore di crescita dei fibroblasti.(46)
40 3.7.5 ANTICORPI MONOCLONALI
Figura 17: Meccanismo di inibizione degli anticorpi monoclonali (mAbs)
Gli anticorpi moniclonali (mAbs) anti-EGFR si legano al dominio extracellulare di EGFR nel suo stato inattivo, impedendo l'interazione dell'EGFR con i propri ligandi, dunque il recettore non può dimerizzare e il segnale non viene trasmesso.(47) Cetuximab, precedentemente noto come C225 (Erbitux, Im-Clone Systems) è uno dei mAbs anti-EGFR più studiati. L’FDA lo ha approvato per il trattamento dell'SCC della testa e del collo (locale e metastatico) e del colon-retto.
Il cetuximab è un anticorpo monoclonale chimerico IgG. Si lega all'EGFR con un'affinità maggiore rispetto ai ligandi naturali TGF-α e EGF.(48) Il legame con l'EGFR inibisce la progressione del ciclo cellulare nella fase G0/G1, aumenta l'espressione del regolatore del ciclo cellulare p27KIP1, e induce apoptosi aumentando l'espressione di proteine pro-apoptotiche (ad esempio, BAX e caspasi-3, caspasi-8, caspasi-9)(49) o mediante l'inattivazione di proteine anti-apoptotiche come Bcl-2.(50)
41 3.7.6 GEFITINIB
Gefitinib, precedentemente noto come ZD-1839 (Iressa), ha dimostrato di inibire l'attivazione intracellulare e la fosforilazione dell'EGFR in un modo simile a quello dei mAbs nell'EGFR, portando all'arresto del ciclo cellulare o all'apoptosi. Gefitinib è un inibitore delle tirosin chinasi (TKI) selettivo verso EGFR (ErbB1) con un'affinità 200 volte maggiore per ErbB1 e ErbB2.
Il suo ruolo esatto nell'attività antitumorale non è chiaro, ma si ipotizza che abbia un ruolo significativo nell'arresto del ciclo cellulare G1.(51) Gefitinib inibisce efficacemente l'attivazione di EGFR e MAPK e l'attività di Pak 1 in cellule tumorali a crescita esponenziale in modo dose-dipendente. È stato anche dimostrato che Gefitinib blocca il rimodellamento del citoscheletro indotto dall'EGF, la crescita cellulare e l'invasività in vitro delle cellule tumorali e induce un fenotipo a cellule squamose ben differenziato.(52)
42
INTRODUZIONE
ALLA PARTE
43
Il tumore della pelle non-melanoma (NMSC) è il più diffuso cancro della pelle e, a differenza del melanoma che coinvolge i melanociti, ha origine nei cheratinociti. Con il termine NMSC ci si riferisce soprattutto al carcinoma delle cellule basali (BCC) e al carcinoma delle cellule squamose (SCC). Circa il 75%-80% dei casi totali di cancro della pelle è rappresentato da BCC.(53)
BCC ha origine nelle cellule basali, tende ad accrescersi molto lentamente ed ha scarsa tendenza a metastatizzare. Quando non viene trattato può però diventare deturpante ed evolvere in forme maligne.
SCC, che rappresenta circa il 20% dei casi di tumori della pelle (54), si sviluppa nelle cellule squamose, lo strato più esterno dell’epidermide. Rispetto al BCC, è caratterizzato da un più rapido accrescimento, da una maggior tendenza a diffondere nei tessuti circostanti e a metastatizzare.(27)(55)La cheratosi attinica, o solare (AK) è stata designata come lesione precancerosa di questa forma tumorale in quanto vi è il rischio che questa evolva nella forma più invasiva, SCC, in circa il 20% dei casi.
Il fattore di rischio principale per lo sviluppo di NMSC è l’esposizione prolungata ai raggi UV, sia solari che derivanti da dispositivi abbronzanti. Si ritiene che le radiazioni UV siano agenti mutageni in grado di indurre danno cellulare responsabile poi della trasformazione dei cheratinociti.(27) Le radiazioni UV vanno, infatti, ad alterare meccanismi importanti come l’apoptosi, la proliferazione, il metabolismo, l’infiammazione e il meccanismo di riparo dei danni al DNA del tessuto epiteliale.(22)
Inoltre, sia gli UVA che gli UVB sono potenti soppressori del sistema immunitario, contribuendo quindi a stimolare la carcinogenesi cutanea. I raggi UVB causano un danno diretto al DNA instaurando un legame covalente tra pirimidine adiacenti e creando così dei prodotti mutageni come dimeri di ciclopirimidine (TT) e addotti (6,4) pirimidina-pirimidina. I raggi UVA invece inducono uno stress di tipo ossidativo mediante la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) capaci di interagire con lipidi, proteine e DNA formando così intermedi che possono andare a costituire addotti premutageni.(58) Perciò l’utilizzo di molecole ad azione antiossidante potrebbe risultare utile per contrastare lo stress ossidativo riducendo i livelli di radicali liberi e di ROS, in maniera da prevenire così la progressione del tumore e la foto-carcinogenesi. Alcuni di essi, come gli acidi idrossicinnamici (acido caffeico, ferulico o cumarico), vengono già inclusi nella preparazione di creme protettive solari. Questi
44
acidi manifestano un alto potere antiossidante in quanto modulano efficacemente il ciclo cellulare e i suoi check point andando spesso anche ad arrestare la crescita cellulare nelle fasi G0–G1.(59)
Uno dei meccanismi di tumorigenesi coinvolge le vie di trasduzione del segnale del recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR), che svolge un ruolo importante nella crescita e nella sopravvivenza di molti tumori e anche dei tumori della pelle attraverso l'attivazione di geni di trascrizione responsabili degli effetti biologici di EGFR (Figura 19).(60) In particolare, è stato riportato che, in coltura di cheratinociti e nella pelle, l'irradiazione UV attiva l'EGFR, portando alla proliferazione dei cheratinociti, alla soppressione dell'apoptosi e all'iperplasia epidermica.(61) Inoltre, studi condotti su modelli animali di carcinogenesi cutanea hanno dimostrato che l'EGFR e un suo ligando, il fattore di crescita trasformante α (TGFα), sono coinvolti nella proliferazione dei cheratinociti e nella crescita del cancro della pelle, attraverso la stimolazione di Akt, e delle proteine trasduttrici del segnale e attivatori della trascrizione (STATs).(60-62) In circa il 35%-100% degli SCC è stata rilevata una sovraespressione di EGFR e TGFα, associata ad un alto rischio di progressione del cancro (Figura 19). Sono stati studiati quindi inibitori di EGFR per il trattamento del cancro. In particolare gli anticorpi monoclonali (mAbs) e gli inibitori competitivi del dominio tirosin-chinasico intracellulare del recettore (TKI), hanno dimostrato attività clinica.(10)
Tuttavia, ci sono studi limitati relativi al trattamento di SCC con gli inibitori di EGFR. Recentemente è stato condotto uno studio clinico di fase II con l'inibitore della tirosin chinasi di EGFR, gefitinib (figura 20), in pazienti con SCC recidivante e/o metastatico incurabile, dimostrando una modesta attività di questo inibitore e sottolineando quindi un ruolo terapeutico importante degli inibitori delle tirosin-chinasi EGFR in NMSC.(52)
È riportato in letteratura che la stimolazione di EGFR determina anche un’aumentata espressione del gene della ciclossigenasi-2 (COX-2), che è responsabile della produzione di prostaglandina E2 (PGE2). Questa va a fosforilare rapidamente EGFR, e innescare la via di segnalazione MAPK.(63) Quindi, una sovraespressione di COX-2 dovuta alla stimolazione di EGFR può stabilire un circolo vizioso (figura 19) che porta all’aumento della proliferazione cellulare e ad una differenziazione cellulare incompleta.
45
Figura 19: Pathway di stimolazione di EGFR.
In un'alta percentuale di tumori cutanei indotti da UV, come NMSC, è stata riscontrata una sovraespressione dell’enzima cicloossigenasi-2 (COX-2). L’epidermide esprime costitutivamente COX-1 nei cheratinociti e determina un aumento dei livelli di PGE2 durante le fasi precoci di infiammazione acuta nonostante i suoi tassi di espressione non varino nel tempo. Al contrario COX-2 è fortemente indotta da un gran numero di stimoli diversi, inclusi ormoni, fattori di crescita, citochine, chemochine, fattori di stress ambientali come carcinogeni fisici o chimici ed endotossine, ad esempio durante un processo infiammatorio o di riparazione tissutale. Nell’iperplasia epidermica, stimolata da UVB, COX-2 piuttosto che COX-1 supporta la proliferazione e la sopravvivenza dei cheratinociti, eventi indirettamente stimolati dalla produzione di prostaglandine, in particolare PGE2. Ai farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), inibitori delle COX, è stato, quindi, associato un ruolo potenziale nella chemioprevenzione di varie neoplasie tra cui BCC e SCC. Esistono infatti molti studi che testimoniano l’efficacia antineoplastica del trattamento con FANS poiché l’inibizione di COX-2 determina una minore produzione di PGECOX-2 traducendosi in un effetto antiproliferativo.
46
4.1 PROGETTAZIONE E SINTESI DI MOLECOLE MULTITARGET
L’azione combinata di inibitori di EGFR e di COX-2, come riportato in letteratura, si è dimostrata efficace nel trattamento di SCC della testa e del collo.(64) In uno studio condotto da Jalili e collaboratori, è stato descritto il trattamento di SCC in un anziano paziente con una combinazione di cetuximab (anticorpo monoclonale contro EGFR) e celecoxib (inibitore COX-2 selettivo). Questo tipo di trattamento si è dimostrato efficace, ben tollerato e ha mostrato scarsi effetti collaterali a livello cutaneo.(64)
Tuttavia, come ampiamente documentato, la combinazione di farmaci può presentare degli svantaggi dovuti alla somministrazione contemporanea di diversi farmaci con diversi profili di biodisponibilità, farmacocinetica e metabolismo. Al contrario l’approccio multi-target, che consiste nella progettazione di una singola molecola in grado di agire simultaneamente su diversi bersagli molecolari coinvolti nella stessa patologia, sembra possedere un maggiore potenziale terapeutico. Per ottenere molecole multitarget è possibile coniugare due o più molecole ad azione diversa, o unire diversi nuclei farmacoforici che interagiscano con target diversi. Questi diversi nuclei vengono uniti tra loro o attraverso un linker, o mediante legame covalente oppure attraverso una parziale sovrapposizione. Questa strategia offre molti vantaggi quali: una migliorata attività dovuta ad un effetto sinergico delle varie molecole e quindi una maggiore efficacia, minore tossicità, minori effetti avversi e minore probabilità di sviluppare resistenza.
Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi di laurea è stata progettata la sintesi di molecole ibride 1-12 che potenzialmente potrebbero inibire EGFR e contemporaneamente avere attività antiinfiammatoria o antiossidante.
Il nucleo chinazolinico, presente nelle molecole ibride progettate e opportunamente sostituito, è stato scelto in quanto caratteristico di composti già dimostrati attivi nell’inibire EGFR. In particolare i derivati chinazolinici A e B, sintetizzati da Tsou et al. sono risultati efficaci inibitori della crescita tumorale in modelli di carcinoma epidermoide umano (A431),(65) e il Gefitinib, noto inibitore di EGFR, è utilizzato in terapia per il carcinoma polmonare e in fase sperimentale per altri tipi di tumore come quello cutaneo.
47
Figura 20: Strutture di inibitori di EGFR.
Entrambi i nuclei chinazolinici opportunamente sostituiti sono stati coniugati attraverso legame ammidico con molecole ad attività antiinfiammatoria, come i FANS diclofenac e ketoprofene, ottenendo i composti 1-4 (figura 21).
I composti 5-12 derivano, invece, dalla coniugazione degli stessi nuclei chinazolinici con molecole naturali ad azione antiossidante e antiproliferativa come l’acido gallico, caffeico, cumarico e ferulico.
48
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La sintesi dei derivati 1,3,5,7,9,11 è illustrata nello schema 1.
Al prodotto di partenza 2-amino-5-nitrobenzonitrile commerciale è stato aggiunto dimetil formammide dimetil acetale e la reazione è stata mantenuta a riflusso a 105 °C per circa 2 h per ottenere il composto 13 che è stato poi utilizzato senza purificazione. A questo punto con l’aggiunta di 3-bromoanilina in AcOH glaciale a 120 °C per 1 h il composto 13 è stato ciclizzato ottenendo 14, anch’esso utilizzato per la reazione successiva senza purificazione. Quest’ultimo è stato sottoposto a riduzione del gruppo nitro in presenza di ferro in EtOH e AcOH per 3 h a circa 80 °C per dare la N-(3-bromofenil)chinazolin-4,6-diammina, (composto 15). L’ammina così ottenuta è stata quindi condensata con gli opportuni acidi (diclofenac, ketoprofene, acido gallico, caffeico, ferulico e cumarico) in presenza dell’agente condensante DCC (N,N’-dicicloesilcarbodimide), in THF a 67 °C per 24 h per dare i prodotti finali 1,3,5,7,9,11. Questi sono stati purificati mediante flash cromatografia usando come eluente una miscela di CHCl3/MeOH in diverse proporzioni ad eccezione di 11 per il quale
è stato invece utilizzato come eluente una miscela di AcOEt/Esano 7:3. Inoltre per i prodotti 1, 3 e 9 è stata necessaria una ulteriore purificazione: i derivati 1 e 9 sono stati triturati con MeOH mentre il derivato 3 è stato precipitato da Et2O/Esano.
50 Schema 1. CN O2N NH2 N H3C O O CH3 CH3 H3C CN N N CH3 H3C O2N NH2 Br N N HN H2N Br I II III Cl Cl NHO OH Cl Cl NH O H N N N HN Br O CH3 O OH O CH3 O H N N N HN Br HO HO OH O OH 5 O2N N N HN Br IV IV IV 1 3 13 14 15 N N HN H N Br O OH HO HO HO R O OH N N HN H N Br O HO R IV R= OH Acido caffeico R= H Acido cumarico R=OCH3 Acido ferulico
7,9,11
7 9 11
Reattivi e condizioni di reazione: (I) 105 °C, 1.5 h. (II) AcOH, 120 °C, 1 h. (III) EtOH, AcOH, Fe, 80 °C, 3 h. (IV) DCC, THF, 67 °C, 24h.
51
La sintesi dei derivati 2,4,6,8,10,12 è illustrata nello schema 2.
Il composto 13, ottenuto in maniera analoga a quanto descritto nello schema 1 per reazione del 2-amino-5-nitrobenzonitrile commerciale con dimetil formammide dimetil acetale, in questo caso è stato sottoposto a reazione di ciclizzazione in presenza di 3-cloro-4-fluoroanilina in AcOH glacialea 120 °C per 1 h ottenendo la chinazolina 16. La successiva riduzione del gruppo nitro, in presenza di ferro in EtOH e AcOH per 3 h a circa 80 °C, ha fornito la N-(3-cloro-4-fluorofenil)chinazolin-4,6-diammina, (composto 17) utilizzata per gli attacchi finali anch’essa senza necessità di purificazione. I prodotti finali 2,4,6,8,10,12 sono stati ottenuti per reazione di condensazione tra l’ammina 17 e gli opportuni acidi (diclofenac, ketoprofene, acido gallico, caffeico, ferulico e cumarico) nelle stesse condizioni riportate nello schema 1 (DCC, in THF a 67 °C per 24 h). Questi composti sono stati purificati mediante flash cromatografia usando come eluente una miscela di CHCl3/MeOH in diverse
proporzioni, ad eccezione del derivato 12 per il quale è stato invece utilizzato come eluente AcOEt. Inoltre, i prodotti 2, 10 e 12 sono stati ulteriormente purificati mediante triturazione con MeOH, mentre i prodotti 6 e 4 sono stati triturati rispettivamente con AcOEt e con Et2O.
52 Schema 2.
Reattivi e condizioni di reazione: (I) 105 °C, 1.5 h. (II) AcOH, 120 °C, 1 h. (III) EtOH, AcOH, Fe, 80 °C, 3 h. (IV) DCC, THF, 67 °C, 24h.
53
PARTE
54
5.1 MATERIALI E METODI
I reagenti ed i solventi utilizzati sono stati acquistati alla Sigma-Aldrich o alla Alpha Aesar senza ulteriori purificazioni.
La struttura dei composti è stata verificata tramite l’utilizzo di spettrometria 1H-NMR e
13C-NMR. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare sono stati effettuati con uno spettrometro Bruker Avance III™ 400 che opera a 400 MHz (per il protone) e 100 MHz (per il carbonio) e riferiti al segnale residuo del solvente. Il chemical shift (δ) è riportato in parti per milione (ppm), mentre le costanti di accoppiamento (J) sono espresse in Hertz (Hz).
Le reazioni sono state monitorate con TLC, in gel di silice 60 F254 (Merck KGaA) contenenti indicatori fluorescenti. Le diverse macchie sono state osservate mediante l’utilizzo di una lampada UV a 254 nm.
Le purificazioni sono state eseguite mediante flash cromatografia, sfruttando una colonna cromatografica in vetro e gel di silice 60 Å (0,040-0,063 mm; Merck KGaA) o mediante cristallizzazione in solventi adeguati.
Le evaporazioni dei solventi sono state eseguite sottovuoto mediante l’utilizzo di un evaporatore rotante.
Le reazioni organiche sono state essiccate utilizzando agenti essiccanti come MgSO4
oppure Na2SO4 (Sigma-Aldrich).
I punti di fusione sono stati misurati tramite uno strumento Kofler hot-stage e non sono corretti.
55
5.2 SCHEMA 1
5.2.1 COMPOSTO 13
N-(2-ciano-4-nitrofenil)-N,N-dimetilimidoformamide
Una miscella di 5-nitroantranilonitrile commerciale (2.00 g, 12.26 mmoli) e di dimetilformamide dimetil acetale commerciale (4.04 mL, 30.49 mmoli) è stata posta in agitazione a riflusso a 105 °C per 1.5 h. La miscella risultante è stata poi raffreddata a temperatura ambiente e il solido è stato filtrato, lavato più volte con Et2O e asciugato. È
stato ottenuto così un solido giallo cristallino, corrispondente al prodotto 13, che non ha avuto bisogno di purificazione.
Resa 96%
1H NMR (DMSO) δ: 3.08 (s, 3H, CH3); 3.16 (s, 3H, CH3); 7.38 (d, 1H, J = 9.2 Hz, Ar);
56
5.2.2 COMPOSTO 14
6-Nitro-4-(3-bromofenilamino)chinazolina
Una miscela del composto 13 (1.29 g, 5.90 mmoli) e di 3-bromoanilina commerciale (0.71 mL, 6.49 mmoli) in AcOH glaciale (5.4 mL) è stata posta a riflusso a 120 °C sotto agitazione magnetica per 1 h. Il solido risultante è stato poi filtrato, lavato più volte con Et2O ed
asciugato, fornendo un solido giallo cristallino che non ha avuto bisogno di purificazione. Resa 93%
1H NMR (DMSO) δ: 7.36-7.42 (m, 2H, Ar); 7.90-7.97 (m, 1H, Ar); 7.96 (d, 1H, J = 9.2 Hz Hz,
Ar); 8.20 (s, 1H, Ar); 8.58 (dd, 1H, J = 2.4, 9.2 Hz, Ar); 8.79 (s, 1H, Ar); 9.67 (d, 1H, J = 1.6 Hz, Ar); 10.50 (b rs, 1H, NH) ppm.
57
5.2.3 COMPOSTO 15
N4-(3-bromofenil)chinazolin-4,6-diamina
Ad una miscela del composto 14 (1.90 g, 5.51 mmoli) in EtOH (1.94 mL) e AcOH (0.48 mL) è stato aggiunto Fe commerciale (1.50 g, 26.96 mmoli) e la reazione è stata portata a riflusso a 80 °C. Dopo l’inizio del riflusso sono stati ulteriormente aggiunti EtOH (0.52 mL) e AcOH (0.12 mL) e il riflusso è stato fatto continuare per 3 h. Quindi la reazione è stata raffreddata a temperatura ambiente e diluita con H2O. Il solido così ottenuto è stato filtrato e
ulteriormente lavato con H2O. Successivamente il solido è stato ripreso con EtOH (0.38 mL),
THF (1.88 mL) e AcOEt (5.26 mL) e la parte insolubile è stata allontanata. La soluzione filtrata è stata poi lavata con una soluzione satura di NaHCO3 e di NaCl, essiccata con
Na2SO4 ed evaporata. È stato ottenuto così un solido verde-giallo corrispondente al prodotto
desiderato 15 che non ha richiesto purificazione. Resa 69%
1H NMR (DMSO) δ: 5.64 (b rs, 2H, NH
2); 7.21-7.33 (m, 4H, Ar); 7.54 (d, 1H, J = 8.8 Hz, Ar);
