Activitat "natural killer" a la leucèmia limfàtica crònica de línia B

Testo completo

(1)Activitat natural killer a la leucèmia limfàtica crònica de línia B Neus Villamor i Casas. ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tesisenxarxa.net) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tesisenred.net) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tesisenxarxa.net) service has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized neither its spreading and availability from a site foreign to the TDX service. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service is not authorized (framing). This rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

(2)

(3) dÍBCUBSÍÓ_. DISCUSSIÓ. 1. Tècnica de c i t o t o x i c i t a t n a t u r a l. La t è c n i c a p e r d e t e r m i n a r la c i t o t o x i c i t a t n a t u r a l q u e es capaç de d e s e n v o l u p a r una població e f e c t o r a d e t e r m i n a d a es medeix a l ' e n f r o n t a r a q u e s t a població amb u n a línia cel·lular q u e s e r v i r à de diana. La línia cel·lular d i a n a pot v a r i a r en s e n s i b i l i t a t f r o n t la lisi, d e f i n i n t - s e. línies. d i a n a N K - s e n s i b l e s i N K - r e s i s t e n t s . En la r e a l i t z a c i ó d ' a q u e s t e s t u d i s ' h a e m p r a t la línia cel·lular d i a n a K562, clàssicament d e f i n i d a com N K - s e n s i b l e (34-35,37,43,59-60,152,154,156,160-161 ,164,172,178-180,1B6,188,197,376).. La c i t o t o x i c i t a t de la mostra es v a l o r a pel g r a u d ' a l l i b e r a m e n t de l'isòtop r a d i o a c t i u q u e r e f l e c t e i x la m o r t a l i t a t de la l í n i a d i a n a . El càlcul de la lisi c o n s i d e r a l ' a l l i b e r a m e n t basal e s p o n t a n i , l ' a l l i b e r a m e n t màxim (mortalitat estudi.. del. 100% de la línia d i a n a ) i l ' a l l i b e r a m e n t de la m o s t r a a. L'acceptació. obtinguts. en. un. de l'assaig control. de c i t o t o x i c i t a t. d'ANK. coneguda. o. dependrà normal. dels. valors. del. valor. i. d ' a l l i b e r a m e n t e s p o n t a n i de l'isòtop r a d i o a c t i u . Al l l a r g d ' a q u e s t e s t u d i s e m p r e s ' h a comptat amb u n a mostra c o n t r o l p e r a c c e p t a r els r e s u l t a t s de l'assaig. A més, s ' h a v a l o r a t l ' a l l i b e r a m e n t e s p o n t a n i de l'isòtop d u r a n t el p e r i o d e d ' i n c u b a c i ó . La x i f r a m i t j à o b t i n g u d a és d e 12,68% q u e , del q u e es d e s p r e n de la l i t e r a t u r a , és v à l i d a (24,152,172,179-180,378,392). F i n a l m e n t , la. validesa. de. la. tècnica. s'ha. comprovat. amb. l'estabilitat. en. l'ANK. d ' i n d i v i d u s c o n t r o l al l l a r g del t e m p s tal i com e s t à d e s c r i t a la l i t e r a t u r a (4,204).. La metodologia u t i l i t z a d a e n la d e t e r m i n a c i ó e x p e r i m e n t a l d e l'ANK és. similar. per. tots. els. autors. (24,34-35,37,59,I52,i54,is« f ieo-IEI,i72,i7e-. 180,186,188,212.376,378). Nogensmenys, la m a n e r a d ' e x p r e s s a r e l s r e s u l t a t s c a n v i a en els d i v e r s o s t r e b a l l s . No existeix un v a l o r M t à n d a r d. -. en. 229. la. -.

(4) d i meus* ió_. d e t e r m i n a c i ó de l'ANK ni e x i s t e i x e n v a l o r s de r e f e r è n c i a u n i v e r s a l s .. Per. t a n t , els v a l o r s de c i t o t o x i c i t a t h a n de r e f e r i r - s e a u n s v a l o r s c o n t r o l del propi. laboratori. per. una. proporció. D:E. concreta,. fent-se. difícil. la. c o m p a r a c i ó e n t r e les x i f r e s d e c i t o t o x i c i t a t d e l s t r e b a l l s p u b l i c a t s <204>. Per. solventar. aquest. problema. s'han. proposat. diverses. formes. d ' e x p r e s s i ó d e l s r e s u l t a t s si bé cap ha a c o n s e g u i t la s e v a g e n e r a l i t z a c i ó ni p e r m e t e n la c o m p a r a c i ó e n t r e els r e s u l t a t s. (113,154,204-206).. En a q u e s t t r e b a l l els r e s u l t a t s s ' h a n e x p r e s s a t e n v a l o r s t e ò r i c s de citotoxicitat.. Els. valors. experimentals. s'han. ajustat. a. una. funció. m a t e m à t i c a t e ò r i c a I s ' h a n c a l c u l a t els v a l o r s e s p e r a t s d e c i t o t o x i c i t a t p e r mètodes. de. citotoxicitat. regressió. no. lineal.. permet:. 1). la. La. utilització. inferència. de. valors. d'unitats. de. teòrics. de. citotoxicitat. i n d e p e n d e n t s de la p r o p o r c i ó D:E u t i l i t z a d a ( u n i t a t s l í t i q u e s ) i 2 ) el c à l c u l de la c i t o t o x i c i t a t e s p e r a d a a p r o p o r c i o n s experimental. sol v e n t a n t. possibles. D:E no r e a l i t z a d e s a. errors. en. la. tècnica. cel·lularitat o a l t r e s problemes o b s e r v a t s en l'assaig). citotoxicitat. s'han. expressat. en. percentatge. de. nivell. (manca. de. Els r e s u l t a t s. lisi. (%). a. de. diverses. p r o p o r c i o n s D:E. No s ' h a n u t i l i t z a t les u n i t a t s l í t i q u e s p e r q u é m o s t r e n una. gran. variabilitat. en. el. valor. obtingut. per. percentatges. de. c i t o t o x i c i t a t s i m i l a r s s e g o n s els p u n t s d e la c o r b a q u e es d i s p o s i i d e la f o r m a de la mateixa. El model d ' a j u s t a m e n t e s c o l l i t s ' h a f e t e n base a: 1 ) les d a d e s de la l i t e r a t u r a (205-206,403), 2 ) la s e v a f a c i l i t a t d e c à l c u l i 3 ) la p o s s i b i l i t a t de v a l i d a r g r à f i c a m e n t i de f o r m a i m m e d i a t a d e l ' a j u s t a m e n t als v a l o r s e x p e r i m e n t a l s .. L ' a j u s t a m e n t t e ò r i c dels v a l o r s experimentals s ' h a c o n s i d e r a t bona. Aquest. tipus. d'anàlisi. no e s t à. descrit. a. la l i t e r a t u r a. i per. v a l i d e s a e n s basem e n e l s v a l o r s e s t a d í s t i c s d e c o r r e l a c i ó i. la. seva. residuals. d'ajustament obtinguts.. 2. E f e c t e d e l s l i m f ò c i t s B a l'ANK d e c o n t r o l s. -. 230. -.

(5) diacu*sió_. L'ANK es realitza generalment en SCM de SP, que en I n d i v i d u s sans 0 en la majoria de patologies no hemopoètiques conté de forma majoritària limfòcits T i NK. A la SP de LLC-B I altres SLPC els limfòcits T I NK són reemplaçats pels limfòcits B neoplàsies. Per t a n t , per valorar l'ANK dels pacients amb LLC-B interessa saber l'efecte que tenen els limfòcits B sobre l'ANK. Per conèixer l'efecte dels limfòcits B a l'ANK s'han f e t suspensions. de. CMN de controls. amb un. percentatge. creixent. de. limfòcits B p u r i f i c á i s . Sobre aquestes suspensions s'ha assajat l'ANK. Les modificacions. observades. s'han. ajustat. a una. reducció. de. la. citotoxicitat proporcional al percentatge de limfòcits B p u r i f i c a t s afegits a la mostra inicial. Aquest efecte " d i l u t o r " dels limfòcits B j a ha s i g u t descrit en pacients amb LLC-B per Alvarez-Mon e t al i Srskaar et al (35,163) j ha sigut s u g g e r i t per altres autors (209,373). Per t a n t , a la LLC-B la citotoxicitat pot estar alterada, parcialment o totalment, per la presència de la població leucémica no efectora que " d i l u e i x " la cel·lularitat capaç de provocar la lisi natural.. 3. A c t i v i t a t natural. Els pacients característiques. killer a la LLC-B. que composen aquesta tesi. clínico-analítiques. no difereixen. del que es habitual. en. a la. les. LLC-B. excepte per un lleuger predomini de pacients en estadi 0 de Rai en el moment. del. diagnòstic. (239,291,293-294). Quan s'analitza. la. literatura. s'observa un augment p r o g r e s s i u de la proporció de pacients en estadi 0,. possiblement. per. la. generalització. d'analítiques. rutinàries. i. el. diagnòstic de la malaltia en pacients asimptomàtics. La mediana d'edat, el predomini de sexe masculí, la p r o p o r c i ó de cadascun dels estadis clínics 1 el nombre de pacients amb c r i t e r i s de LLC-B quiescent, la d i s t r i b u c i ó segons el p a t r ó histológic de la BMO o el TDL, així com la resta de característiques. analítiques. es. similar. al. descrit. prèviament. (220,239,291,293-294,345).. -. 231.

(6) discussió.. L'estudi de l'ANK en pacients amb LLC-B s'ha realitzat en poques ocasions. i. incloent. un. nombre. de. casos. escàs. (entre. 6. i. 28). (35,ii3,i25,i63,209-2i0,329,3?3-375,377-378). De fet, la sèrie aquí descrita és la més nombrosa de l'estudiada f i n s l'actualitat. Les publicacions prèvies no inclouent. en. la. majoria. de. les. ocasions. la. descripció. de. les. característiques clínico-analítiques dels malalts i per tant no es poden comparar aquestes amb la dels malalts del present estudi. L'ANK dels pacients amb LLC-B és i n f e r i o r a la dels i n d i v i d u s control. Aquest fet està en concordància amb el descrit. prèviament. (35,113,163,210,329,373-375,377-378,383). Alguns autors descriuen una major alteració de la citotoxicitat quan més avançada està la malaltia (113,329) mentre que altres no troben diferències segons l'estadi o la realització de tractament (378). Aquestes sèries inclouen 15 o menys malalts. Alvarez de Mon et al (35), en 27 pacients, no troben correlació entre l'estadi clínic de Rai i la citotoxicitat en els malalts no tractats excepte la normalització de l'activitat NK després de l'administració de tractament alquilant i de l'obtenció de l'estadi 0 de Rai. Malauradament, no es compara l'ANK amb la x i f r a limfocitària dels pacients (tractats o no t r a c t a t s ) a pesar de descriure l'efecte dilucional de la població leucémica. Aquest fet impedeix contrastar els resultats del present estudi amb les dades publicades prèviament. Nogensmenys, en l'estudi. de Alvarez-Mon. et al (35) no. existeix correlació entre l'ANK i els estadis de Rai, a l'igual que succeix en la nostra sèrie. Els autors no analitzen la citotoxicitat en relació amb els estadis de Binet que sí que mostren significació en els malalts inclosos en aquest estudi. Per motius obvis, no es poden comparar els resultats que analitzen la relació entre les diverses característiques clíniques (patró de BMO, TDL, etc) amb dades referides a la literatura. En els malalts inclosos en aquest estudi l'ANK no ha mostrat relació amb cap característica clínica rellevant (edat, sexe, nombre de territoris afectats, patró histològic d'afectació medul·lar, temps de duplicació).. -. 232 -.

(7) discussió.. El grup de pacients amb LLC-B quiescent no es comporten de forma diferent, pel que respecta a la citotoxicitat, que la resta de pacients amb LLC-B. El diferent comportament biològic d'aquest s u b g r u p de malalts no pot ser a t r i b u i t a un major efecte immunocontrolador de la població NK sobre la leucèmia. De forma similar altres paràmetres amb implicacions pronòstiques com la velocitat de duplicació de la xifra limfocitària o el patró i n f i l t r a t i u a moll d'ós no tenen relació amb l'ANK. De tota manera i com s'exposarà més tard, la relació observada entre la baixa ANK i els estadis avançats de la malaltia (estadi C de Binet o III+IV de Rai) és secundària a la major limfocitosi que presenten els pacients amb malaltia avançada. De la mateixa manera l'hepatomegàlia influeix de manera negativa a la citotoxicitat perque s'observa en el grup que té xifres de limfòcits més elevades. S'ha observat. una correlació inversa lineal entre el. recompte. limfocitari i l'ANK dels pacients (ex: proporció 1:400 r=-0,363, p=0,002). Si bé s'ha suggerit per diversos autors l'efecte " d i l u t o r " dels limfòcits B en l'ANK. (35,163,209,373) no s'ha publicat cap treball on es relacioni la x i f r a. de limfòcits o el percentatge de limfòcits B de la mostra efectora amb la citotoxicitat desenvolupada pels malalts. Per altra banda, en diversos treballs publicats es descriuen pacients amb ANK normal (fins el 17% dels malalts) si bé no es fa una descripció de les característiques clínicoanalítiques d'aquests malalts (210,373,375,378). El 19% dels pacients inclosos en aquest estudi tenen una ANK normal. Predominen els estadis poc avançats (70% d'estadis 0) sense asolir significació estadística. En els pacients inclosos. en. aquest estudi la divisió dels mateixos segons una. x i f r a determinada de limfòcits permet diferenciar g r u p s amb citotoxicitat significativament diferent. De forma paral·lela, s'observa relació e n t r e la citotoxicitat i la x i f r a de leucòcits o limfòcits CD19+ que es deguda a l'íntima relació entre els valors d'aquests paràmetres i la x i f r a de. -. 233. -.

(8) discussió.. limfòcits totals. La relació entre la xifra de limfòcits i la citotoxicitat recolça l'efecte " d i l u t o r " de la població leucémica a la LLC-B. Per conèixer si la baixa citotoxicitat que expressen els pacients és únicament deguda a un efecte " d i l u t o r " o si existeix algun t r a n s t o r n intrínsec de la CNK a la LLC-B s'han de realitzar. estudis de citotoxicitat amb poblacions. efectores. purificades. La metodologia més utilitzada a la l i t e r a t u r a per p u r i f i c a r poblacions efectores és el rosseteig amb hematíes de moltó. Aquest sistema presenta dos inconvenients: 1) la fracció E~ també desenvolupa ANK (àdhuc en proporció igual que la E + ) (125,210), i 2) en general, aquest procediment de separació limfocitari inclou incubacions més o menys prolongades o repetitives a una temperatura de 4°C. El metabolisme cel·lular disminueix amb el f r e d i la citotoxicitat no és una excepció a aquesta regla (4,204). Per tant, en els treballs on es refereix una baixa ANK en poblacions purificades per rosseteig s'ha de valorar el possible l'efecte de la temperatura en els resultats finals. Possiblement, la millor manera de p u r i f i c a r poblacions efectores i valorar la citotoxicitat en pacients amb LLC-B sigui la separació per selecció de les poblacions amb antigens NK-específics que permeten les noves tecnologies (citometria de flux o AcMo lligats a partícules magnètiques).. Una altra dada que recolza l'efecte dilutor és l'increment en la citotoxicitat que s'observa a l'augmentar les proporcions D:E. Aquest efecte també ha sigut r e f e r i t per altres autors (209). La reducció en l'ANK en la LLC-B s'ha hipotetitzat que pot ser secundària a un efecte de cèl·lula diana permanent per part del limfòcit leucèmic. Aquest fet no ha pogut ser demostrat i existeixen dades que no donen suport aquest efecte (210,374,379,385). Per altra banda, el f e t que un grup de pacients amb presència de limfòcits leucèmies tinguin una ANK normal contradiu aquesta hipòtesi.. -. 234. -.

(9) <3 i acusa i ó. La x i f r a de LGG no s'ha correlacionat de manera directa amb ia citotoxicitat desenvolupada pels malalts. La manca de relació entre els LGG i la citotoxicitat també s'ha descrit en controls sans <4>. Malgrat això, el. grup. de. pacients amb. una xifra. de. LGG superior. a 0,5x10 9 /L. desenvolupen una citotoxicitat superior que la resta de malalts. Ja que no s'observen diferències respecte les característiques clíniques ni el nombre de limfòcits entre els dos grups de pacients la major citotoxicitat s'ha de relacionar amb el major nombre de LGG. La resta de paràmetres analítics no ha mostrat relació amb l'ANK (ex: nivells d'hemoglobina o plaquetes). La presència d'hipo-IgA s'ha relacionat amb activitat NK baixa. Si bé les CNK regulen el funcionalisme dels limfòcits B i s'han descrit poblacions limfocitàries NK supressores dels limfòcits B en pacients amb LLC-B que presenten hipogammaglobulinèmia (94,383), la relació detectada en els nostres pacients es deguda a que el grup amb nivells baixos d'IgA tenen uns recomptes limfocitaris més elevats.. La relació que existeix entre les poblacions limfocitàries i l'activitat NK sustenta l'efecte " d i l u t o r " de la població limfoide B leucémica sobre l'ANK.. A la sèrie. global. es. poden. definir. grups. de. citotoxicitat. diferenciada d i v i d i n t els pacients per la x i f r a mitja de cadascuna de les poblacions limfocitàries T i NK considerades de forma percentual. El g r u p amb major percentatge de limfòcits T i NK desenvolupa més activitat lítica,. i per. certs antigens de superficie. (CD2, CD16 i CD11b). la. citotoxicitat no difereix dels valors de normalitat. En els pacients no tractats, que tenen unes característiques similars a les de la sèrie global, s'observa una relació directa entre l'ANK i el percentatge de limfòcits CD16+ i CD11b\ Apostolopoulos et al (329) també refereixen aquest mateix efecte CD16 ANK en una serie de 15 malalts no tractats. Aquesta relació directa entre els valors percentuals de poblacions limfoldts amb antigens. 235. -.

(10) d i »cuma i ó. NK i l'ANK reflecteix l'efecte dilutor de la població leucémica en l'activitat lítica. La manca de correlació lineal entre l'ANK i el percentatge de les poblacions T i NK en la sèrie global pot ser deguda a que la sèrie global inclou malalts tractats amb diversos fàrmacs. Si bé els pacients tractats tenen unes xifres similars a la dels malalts no tractats per cadascuna de les poblacions limfocitàries l'ANK de la sèrie global pot estar afectada per l'efecte citopàtic que provoca la quimioteràpia. Finalment, els pacients amb LLC-B tenen uns percentatges de limfòcits T i NK molt Inferiors a la població control. Malgrat el gran increment en la població B de la mostra testada l'activitat lítica natural que desenvolupen no ós indétectable. La deplecció de limfòcits B de la mostra a testar provoca un augment en ANK (163) j el grup de pacients inclosos en aquest estudi que tenen una major proproció de limfòcits NK tenen una ANK normal. Considerat tot en conjunt, l'ANK dels pacients amb LLC-B està interferida per la dilució de la població efectora pels limfòcits leucèmics. 4. Poblacions limfocitàries Els pacients amb LLC-B tenen una alteració en la distribució de les diverses poblacions limfoides. La malaltia comporta l'increment de població limfoide B en un estadi immadur. L'increment en la població limfoide B motiva la disminució percentual de limfòcits T i NK. Nogensmenys, quan s'analitzen els valors absoluts de les poblacions no leucémiques s'observa un increment de les mateixes respecte dels valors en obtinguts en individus control. L'increment en el valor absolut s'observa en totes les poblacions estudiades (CD2, CD4, CD8, CD16, CD57, CD11b) excepte en la xifra de limfòcits CD56* en el que el nombre de pacients i controls analitzat és molt petit. L'increment absolut de les poblacions limfocitàries T i NK que s'observa en aquest estudi concorda amb les dades referides prèviament (131,220,273,275,329,380-383), L'increment dels valors absoluts ée més acusat. 236. -.

(11) discussió.. com més a v a n ç a t és l ' e s t a d i de la m a l a l t i a a s s o l i n t s i g n i f i c a c i ó e s t a d í s t i c a el n o m b r e de limfòcits CD2, CD4 i CD56. La r e s t a d e p o b l a c i o n s. també. s'incrementen sense assolir significació potser i n f l u i t p e r l ' e s c à s nombre de p a c i e n t s e n e s t a d i s a v a n ç a t s . D i v e r s o s t r e b a l s p u b l i c a t s. refereixen. r e s u l t a t s on els p a c i e n t s e n e s t a d i s a v a n ç a t s t e n e n un m a j o r. increment. de les p o b l a c i o n s l i m f o i d e s (131,273,275).. Les. poblacions. limfocitàries. principals característiques clínic.. La q u i e s c è n c i a. de. percentuals o absoluts,. no. han. mostrat. relació. amb. c l í n i q u e s e x c e p t e la m e n c i o n a d a amb la m a l a l t i a. no es. r e l a c i o n a amb u n s. l i m f o c i t a r i s T i NK d i f e r e n t s .. les l'stdi. valors,. Els p a c i e n t s. en. e s t a d i A amb L L C - B q u i s c e n t t e n e n u n a x i f r a d e l i m f ò c i t s CD19 + m e n y s e l e v a d a q u e a q u e l l s malalts e n e s t a d i A amb L L C - B no q u i e s c e n t q u e es c o r r e l a c i o n a amb u n e s x i f r e s de limfòcits t o t a l s. inferior. (20,3±10,7. vs. 61,52+72,4;. un menor nombre. de. limfòcits. p=0,054). B. indeterminat". en. Kimby. malalts. que. es. et amb. al. (382) d e s c r i u e n "limfocitosi. clínicament. se'ls. monoclonal pot. de. considerar. significat com. LLC-B. q u i e s c e n t s . De f e t la d i f e r è n c i a en la x i f r a de l i m f ò c i t s e n t r e els m a l a l t s amb e s t a d i A s e g o n s la q u i e s c è n c i a de la m a l a l t i a no ha de s o r p r e n d r e j a q u e u n d e l s c r i t e r i s d e d e f i n i c i ó és la limfocitosi i n f e r i o r a 3 0 x 1 0 9 / L .. Generalment malalts. amb. es. LLC-B. descriu. l'alteració. del. quocient. (131,220,273,275,329,380-382).. C D 4 / C D 8 dels p a c i e n t s. q u e composen. El. CD4/CD8. valor. del. la s è r i e no d i f e r e i x. en. els. quocient. dels. valors. c o n t r o l . Q u a n s ' a n a l i t z a la l i t e r a t u r a es f a e v i d e n t q u e l ' a l t e r a c i ó és més a c u s a d a com més a v a n ç a d a e s t à la m a l a l t i a. (131,273,275,329,382) amb. uns. v a l o r s n o r m a l s e n els e s t a d i s m e n y s a v a n ç a t s o e n p a c i e n t s amb c r i t e r i s de L L C - B q u i e s c e n t (329,382). L ' e l e v a t n o m b r e de p a c i e n t s e n e s t a d i s poc a v a n ç a t s i de m a l a l t s amb L L C - B q u i e s c e n t pot c o n t r i b u i r a la n o r m a l i t a t del q u o c i e n t C D 4 / C D 8 o b s e r v a t e n la p r e s e n t s è r i e .. S ' o b s e r v a u n a c o r r e l a c i ó i n v e r s a l i n e a l e n t r e e l s p e r c e n t a t g e s de les. -. 237 -.

(12) discussió.. poblacions limfocitàries T i NK amb la x i f r a de limfòcits i leucòcits. AI considerar. les poblacions en valor absolut s'observa una correlació. directa lineal entre la x i f r a de limfòcits i leucòcits i les poblacions T, NK, CD16+CD8+,. CD16+CD57+. CD11b+CD2+.. i. prèviament. (273,329).. En. diferències. significatives. Aquest. concordància en. les. amb. poblacions. fet. ha. sigut. l'exposat,. referit. s'objectiven. limfocitàries. quan. es. s'agrupen els pacients segons una x i f r a de limfòcits determinada.. Els pacients amb una x i f r a de LGG s u p e r i o r a 0,5X10VL tenen un major nombre de limfòcits CD16+, CD57+ i CD11b+, sense que aquest fet es pugui a t r i b u i r a una limfocitosi més elevada.. La x i f r a de gammaglobulines, d ' I g G i d ' I g A han mostrat relació inversa amb el quocient CD16/CD8 i CD16/CD11b. A la l i t e r a t u r a només està descrita la relació e n t r e la xifa de gammaglobulines i el valor dels quocient CD4/CD8 (329).. Els malalts amb un TDL més llarg tenen una x i f r a més elevada de limfòcits CD4+ i un valor pacients amb. un. TDL. del quocient CD4/CD8 més elevat que els. més c u r t ,. si. bé no s'assoleixen. diferències. significatives. No existeix cap estudi previ analitzant les subpoblacions limfocitàries i el TDL, però l'evidència que els pacients amb "limfocitosi B monoclonal de s i g n i f i c a t desconegut" descrit per Kimby et al (329) tenen un quocient normal està d'acord amb els resultats o b t i n g u t s .. Els pacients amb un p a t r ó i n f í l t r a t i u a la BMO de t i p u s d i f ú s tenen una x i f r a s u p e r i o r de limfòcits CD4+ que la resta de malalts. No existeixen treballs. que. subpoblacions.. correlacionin De. totes. el. tipus. maneres,. de. els. patró patrons. histològic histològics. amb. les. difusos. s'acostumen a veure en pacients en estadis avançats i més leucositòsics, en els que la x i f r a de CD4+ pot estar més augmentada. Nogensmenys, en els pacients d'aquesta série amb un p a t r ó d i f ú s no es pot demostrar una. 238. -.

(13) ai »cuati ó_. major xifra de limfòcits (59,4+46,4 vs 41,5±49,7) si bé només quatre pacients tenen un patró difús i determinació de CD4. A la LLC-B s'han descrit diverses alteracions en l'expressió dels antigens NK com per exemple l'increment de la població CD8+, CD57+, l'aparició de poblacions anòmales (CD4+CD11b+) i alteracions en la relació de ('antigen CD57 i CD16 <131,380-383). L'augment mig de la població CD57+ és més acusat (6 vegades el valor normal) que l'increment de la població CD16+ (4 vegades la normalitat) amb un increment percentual de la població CD16+CD57+ respecte dels controls. Els pacients de la sèrie mostren una major nombre de limfòcits que coexpressen CD16 i CD2 o CD8 que els individus control. La coexpressió d'antígens per part. dels. limfòcits CD16 no s'ha analitzat en les publicacions prèvies, però està d i n t r e de la línea de major coexpressió d'antigens NK en la població T en pacients amb LLC-B oao-asn.. Finalment, la realització de tractament comporta una alteració de les poblacions limfocitàries. No existeixen diferències entre el nombre de limfòcits entre els malalts tractats i no tractats però si en el quocient CD2/CD19. En ambdós g r u p s de pacients aquest quocient és i n f e r i o r al valor control però és significativament inferior en el g r u p no tractat. Si bé aquest fet no s'ha analitzat a la literatura no ha de s o r p r e n d r e j a que ia disminució limfocitària provocada pel tractament ha d ' i n c i d i r més sobre la població leucémica.. 5. Citotoxicitat en períodes d'incubació perllongats La determinació de l'activitat lítica donarà uns resultats diferents si el periode d'incubació entre D:E es perllonga j a que es permet el reciclatge cel·lular de la CNK per lisar noves cèl·lules diana (202). Malgrat que. amb. els. assaigs. de. 18-20. hores. s'obté. menor. variabilitat. interindividual en els resultats i una menor oscil·lació intraindividual que. -. 239. -.

(14) discussió.. e n a s s a i g s més c u r t s la g r a n m a j o r i a d e l s a u t o r s t r e b a l l e n e n a s s a i g s de 4 hores.. P e r v a l o r a r la c a p a c i t a t de r e c i c l a t g e d e la CNK d e l s p a c i e n t s amb L L C - B s ' h a n f e t a s s a i g s de c i t o t o x i c i t a t amb p e r i o d e s d ' i n c u b a c i ó de 2 0 h o r e s . La d i n à m i c a de la CNK s ' h a c o m p a r a t amb la d ' i n d i v i d u s c o n t r o l s i amb la de m a l a l t s amb u n d e f e c t e f u n c i o n a l , a d q u i r i t i c i t o p à t i c , d e la CNK ( h e m o f í l i e s H I V. Les. positius).. característiques. dels. malalts. estudiats. inclosos. d ' i n c u b a c i ó p e r l l o n g a d a no d i f e r e i x e n en les c a r a c t e r í s t i q u e s. en. l'estudi. principals. ( e d a t , sexe, e s t a d i s c l í n i c s , l i m f ò c i t s ) de la s è r i e g l o b a l .. La c i t o t o x i c i t a t e x e r c i d a p e l s p a c i e n t s en el clàssic a s s a i g d e 4 h o r e s d ' i n c u b a c i ó é s i n f e r i o r al v a l o r d'ANK d e l s c o n t r o l s , com e s t à d e s c r i t a la literatura. i com succeeix. en. la s è r i e. global.. Algun. dels t r e b a l l s. que. a n a l i t z a l'ANK en p a c i e n t s amb L L C - B ha u t i l i t z a t un a s s a i g de 16 o 18 h o r e s d ' i n c u b a c i ó (125,210,329,376). La c i t o t o x i c i t a t é s i n f e r i o r q u e la del g r u p c o n t r o l . No s ' h a n f e t c o m p a r a c i o n s e n t r e la c i t o t o x i c i t a t o b t i n g u d a a 4 h o r e s o en i n c u b a c i o n s més p e r l l o n g a d e s .. El c o m p o r t a m e n t d e l'ANK e n els p a c i e n t s amb L L C - B és s i m i l a r a l'observat. en. individus. control.. La p e r l l o n g a c i ó. de. la I n c u b a c i ó. amb. l ' i n c r e m e n t de t e m p s p e r l i s a r les cèl·lules d i a n a c o n d u e i x a u n i n c r e m e n t s i g n i f i c a t i u de la c i t o t o x i c i t a t , com s ' h a d e s c r i t en i n d i v i d u s s a n s En el. present. estudi,. controls. i p a c i e n t s amb. LLC-B. (202).. incrementen. la. c i t o t o x i c i t a t a les 20 h o r e s d ' i n c u b a c i ó , com és n o r m a l . De t o t a m a n e r a , l ' i n c r e m e n t de c i t o t o x i c i t a t q u e p r e s e n t e n els m a l a l t s no n o r m a l i t z a l'ANK comparant. amb e l s v a l o r s c o n t r o l s a 2 0 h o r e s , f e t. referit. prèviament. 21. < °). En c a n v i , e l s n i v e l l s de c i t o t o x i c i t a t a c o n s e g u i t s a les 2 0. hores. d ' i n c u b a c i ó són e q u i p a r a b l e s als v a l o r s c o n t r o l d e c i t o t o x i c i t a t a 4 h o r e s d'incubació.. Per tant,. es p o d r i a e q u i p a r a r. el t i p u s d e r e s p o s t a. 240. dels. -.

(15) discussió.. pacients amb LLC-B amb el t i p u s C de citotoxicitat d é c r i t per Zaretskaya et al (202). L'increment en la citotoxicitat en incubacions perllongades. que. s'observa en els pacients amb LLC-B suggereix que no existeix de, forma predominant, un defecte citofuncional a la CNK dels malalts. Aquest f e t es veu substentat encara més quan es compara el comportament litio dels pacients amb LLC-B amb les modificacions de la citotoxicitat motivades per. la. perllongació. funcionalment. de. alterades.. l'estudi El. en. darrer. malalts. grup. hemofílies. de pacients. amb. no es. CNK capaç. d'incrementar la citotoxicitat baixa a pesar de disposar de més temps per lisar les cèl·lules diana.. Encara que els resultats de l'estudi de citotoxicitat no descarten de forma i n d i s c u t i b l e un defecte funcional de la CNK dels pacients amb LLC-B únicament és podria a t r i b u i r una cinètica de lisi més lenta. En canvi, si es considera l'efecte " d i l u t o r " dels limfòcits B leucèmies en l'ANK el p a t r ó de comportament de la citotoxicitat és l'esperat. Es a d i r , existeixen. menys. cèl·lules. efectores. disponibles,. funcionalment. són. normals o escassament patològiques i t r i g u e n més temps a lisar el mateix nombre de cèl·lules diana que els i n d i v i d u s control que poseeixen més cèl·lules efectores per la mateixa proporció D:E.. En els assaigs de 20 hores també s'ha o b s e r v a t la correlació i n v e r s a lineal e n t r e l'ANK i la x i f r a de limfòcits. A més, s'ha o b j e c t i v a t. una. correlació directa lineal e n t r e l'ANK i el percentatge de limfòcits CD16+ i CD11b+ (limfòcits prèvies. NK). Aquestes. dades concorden. (329) i són c o n g r u e n t s amb l'efecte. amb. "dilutor". descripcions dels. limfòcits. leucèmics com la principal causa que disminueix l'ANK a la LLC-B.. 6. Progressió de la LLC-B.. -. 241. -.

(16) __ d i acuse i ó. A. Supervivència En els pacients amb LLC-B s'han d e f i n i t diverses característiques clíniques i analítiques que tenen influència en la s u p e r v i v è n c i a dels malalts. Entre elles, els estadis clínics, el patró histològic d ' i n f i l t r a c i ó a la BMO o el TDL han mostrat t e n i r gran influència en l'evolució dels malalts (291-293,302,307-308,315). En aquest estudi s'analitzen q u i n s f a c t o r s influeixen en la s u p e r v i v è n c i a dels pacients incloent-hi paràmetres amb influència pronòstica j a coneguts i els paràmetres determinats en aquest estudi (ANK i poblacions limfocitàries).. Dels seixanta-set pacients inclosos en l'estudi q u a t r e han mort en el moment de tancar la recollida de dades. Les causes que han c o n d u i t a la mort són les d e s c r i t r e s a la l i t e r a t u r a i estan en relació amb la malaltia (infeccions. i. transformació a limfoma d'alt g r a u ). En l'anàlisi. <220).. univariada, considerant el moment de la inclusió a l'estudi, influència en la s u p e r v i v è n c i a. dels malalts la x i f r a. mostren. de plaquetes. i. prolimfòcits inicial, els estadis de Rai i Binet, ies x i f r e s inicials d ' I g G i d'IgA i l'ANK teòrica. La importància pronòstica de la x i f r a de plaquetes és. un. fet. conegut. i. per. aquest. motiu. s'ha. inclòs. en. les. dues. classificacions clíniques per estadis (291-293). La major presència de cèl·lules no típiques de LLC-B (centròcits, prolimfòcits, etc.) també s'ha associat a una menor s u p e r v i v è n v i a dels malalts (304-305). Els nivells d'immunoglobulines també s'ha associat amb la s u p e r v i v è n v i a dels malalts ( 331 >. La relació que existeix e n t r e l'ANK i la s u p e r v i v è n c i a dels pacients amb LLC-B no s'ha analitzat en cap t r e b a l l p r e v i per la manca de t r e b a l l s clínics. sobre. l'ANK. a. la. LLC-B.. No obstant,. l'ANK. és. un. factor. d'importància en la s u p e r v i v è n c i a i en la s u p e r v i v è n c i a l l i u r e de malaltia de diversos t i p u s de tumors sòlids (4).. Si l'estudi u n i v a r i a t de la s u p e r v i v è n c i a es realitza dee del moment del. diagnòstic. les. variables. que. mostren. influència. ®ón. -. la. xifra. 242. -.

(17) discussió. d'hemoglobina. i. de. plaquetes. inicials. i. l'ANK.. Les. dues. primeres. característiques han demostrat la seva importància i s'han Inclòs e n t r e els c r i t e r i s per estadis clínics <291-293). L'anàlisi multivariada dels factors independents amb influència en la sobrevida dels pacients des del moment de la inclusió a l'estudi obté com a variables independents la x i f r a de plaquetes i d'hemoglobina inicial i l'ANK a proproció D:E 1:100. Ja s'ha d i s c u t i t el s i g n i f i c a t de cadascuna d'aquetes variables en el paràgraf anterior. En l'anàlisi. multivariada. analitzant les variables des del moment del diagnòstic de la malaltia les que mostren influència en el pronòstic són les mateixes que el l'anàlisi anterior.. B. Progressió de la limfocitosi La limfocitosi elevada és un factor de mal pronòstic a la LLC-B i és un paràmetre d'evolució de la malaltia 009,315-316). Dels c i n q u a n t a - t r e s pacients en risc de desenvolupar una limfocitosi p r o g r e s s i v a q u a t r e han presentat. el fenomen evolutiu. durant. el periode de seguiment.. paràmetres que han i n f l u i t en el desenvolupament. de la. Els. limfocitosi. progressiva, t a n t el l'anàlisi univariada com multi, han s i g u t la major limfocitosi en el moment de l'estudi i l'edat més avançada dels pacients. No existeixen factors de risc per desenvolupar limfocitosi. progressiva. quan es considera des del moment del diagnòstic. Aquest f e t no ha de s o r p r e n d r e j a que els malalts que tenien risc en el moment del diagnòstic han desenvolupat la limfocitosi abans de la seva Inclusió a l'estudi.. C. Progressió d'estadi clínic La història natural de la majoria de pacients amb LLC-B és la progressió de la malaltia augmentat la i n f i l t r a c i ó leucémica i p r o g r e s s a n t d'estadi.. De la sèrie. global. de. pacients, t r e n t a - s i s. río han. rebut. 243.

(18) discussió.. t r a c t a m e n t . En a q u e s t g r u p s ' h a a n a l i t z a t la p r o g r e s s i ó d e la malaltia a e s t a d i s clínics s u p e r i o r s . Q u a t r e malalts (11,1%) han p r o g r e s s a t d ' e s t a d i . Les v a r i a b l e s q u e han mostrat. pes p r o n ò s t i c. per la p r o g r e s s i ó de la. malaltia ha s i g u t la x i f r a de p l a q u e t e s .. 7. ANK en el t r a n s c u r s de la malaltia. Els t r e b a l l s p u b l i c a t s s o b r e l'ANK en la L L C - B coincideixen en la menor a c t i v i t a t lítica dels malalts. A l v a r e z de Mon et al (35) d e s c r i u e n la normalització després. de. de. l'ANK. realitzar. en. pacients. tractament. que. assoleixen. alquilant.. l'estadi. L'evolució. de. 0. de. Rai. l'activitat. citotòxica segons els c a n v i s c l í n i c o - a n a l í t i c s p r o d u i t s no s ' h a d e s c r i t en cap. altre. article. repetidament. l'ANK. mèdic. del. En. mateix. el. present. pacient. treball. i s'ha. s'ha. anotat. determinat. les. variacions. p r o d u ï d e s e n t r e elles. L'anàlisi de les modificacions s ' h a f e t d i s t r i b u i n t els p a c i e n t s en t r e s g r u p s . El p r i m e r e s t à composat p e r p a c i e n t s q u e no han. rebut. tractament. permet valorar segon. al. llarg. de les d i f e r e n t s. proves.. Aquest. grup. l'evolució n a t u r a l de l'ANK en p a c i e n t s amb L L C - B .. g r u p està composat per. pacients que reben. diversos tipus. El de. q u i m i o t e r à p i a a l q u i l a n t . S ' a n a l i t z e n les modificacions de l ' a c t i v i t a t l í t i c a i els p a r à m e t r e s a n a l í t i c s en relació amb les modificacions p r o v o c a d e s pel t r a c t a m e n t c i t o r r e d u c t o r . El t e r c e r g r u p e s t à composat p e r p a c i e n t s q u e r e b e n t r a c t a m e n t amb a - i n t e r f e r ó . L ' i n t e r f e r ó és eficaç en e s t a d i s poc a v a n ç a t s de la malaltia i és un p o t e n t p o t e n c i a d o r de l'ANK < i i , i 3 ) . En a q u e s t t e r c e r g r u p es v a l o r e n les modificacions en la c i t o t o x i c i t a t i les poblacions limfocitàries p r o m o g u d e s p e r l ' a g e n t. immunomodulador.. A. Evolució de l'ANK en p a c i e n t s no t r a c t a t s. L'estadi clínic dels v u i t malalts no t r a c t a t s és de f o r m a p r e d o m i n a n t AO o A I . Cap dels p a c i e n t s v a p r o g r e s s a r a e s t a d i s c l í n i c s m é s a v a n ç a n t s . El. predomini. de. pacients. en. estadis. poc a v a n ç a t s e n t e. el. grup. de. -. 244. -.

(19) ÓÍ*CUB8ÍÓ_. p a c i e n t s sense t r a c t a m e n t és lògic. Com s ' h a d e s c r i t en l ' a p a r t a t. de. t r a c t a m e n t de la L L C - B es p r e f e r i b l e r e s e r v a r el t r a c t a m e n t p e r p a c i e n t s amb s i g n e s. de mal p r o n ò s t i c .. El comportament. de. l'ANK no ha. sigut. homogeni. T r e s malalts mantenen e s t a b l e s les x i f r e s d e c i t o t o x i c i t a t .. Un. pacient mostra un descens en l ' a c t i v i t a t lítica sense una cuasa a p a r e n t que ho j u s t i f i q u i . Q u a t r e p a c i e n t s i n c r e m e n t e n la c i t o t o x i c i t a t , en dos de forma. molt. evident.. En. un. d'aquest. malalts. l'increment. es. produeix. d e s p r é s de r e c u p e r a r - s e d ' u n episodi infecciós g r e u . Les CNK j u g u e n un p a p e r i m p o r t a n t en la l l u i t a p r i m à r i a c o n t r a la infecció. La s e v a a c t i v i t a t antibacteriana. pot p r o v o c a r. una disminució de la c i t o t o x i c i t a t. (4). P e r. t a n t l ' i n c r e m e n t en l'ANK d ' a q u e s t pacient pot r e f l e c t i r l'evolució normal de l'ANK en el t r a s n c u r s d ' u n a infecció. La r e s t a de p a c i e n t s no t é u n a causa clínica que j u s t i f i q u i l ' i n c r e m e n t de l ' a c t i v i t a t lítica.. Les poblacions limfocitàries dels p a c i e n t s q u e no r e b e n t r a c t a m e n t es mantenen estables en t o t s e x c e p t e en un. A q u e s t d a r r e r malalt t é un increment. percentual. i absolut de la població limfoide T i NK. Es u n. p a c i e n t en estadi A q u e d e s e n v o l u p a u n a c i t o t o x i c i t a t normal, amb u n s v a l o r s de limfòcits NK normals. Per t a n t , en a q u e s t malalt c o n c r e t no es pot d i r que existeixi un d e f e c t e i n t r í n s e c de la CNK com han s u g g e r i t a l t r e s a u t o r s (210,329,373,375,377).. B. Evolució de l'ANK en malalts sota t r a c t a m e n t a l q u i l a n t. Els v u i t malalts q u e r e a l i t z e n t r a c t a m e n t t e n e n un estadi c l í n i c més a v a n ç a t q u e el g r u p no t r a c t a t j a q u e únicament el 37,5% d ' e l l s e s t à e n estadi 0. La m a j o r i a de p a c i e n t s r e b i e n CLB sol o en combinació amb PDN. D u r a n t el p e r i o d e de t r a c t a m e n t t o t s els p a c i e n t s e x c e p t e un es. van. m a n t e n i r en l'estadi clínic m e n t r e q u e u n v a p r o g r e s s a r d e A I a B I I .. La x i f r a de limfòcits no es modifica de f o r m a s i g n i f i c a t i v a en el p e r i o d e de c o n t r o l de la c i t o t o x i c i t a t . En a q u e s t g r u p l ' e v o l u c i ó de la. -. 245. -.

(20) discussió. citotoxicitat també és heterogeni. Dos pacients mantenen estable la seva baixa citotoxicitat. Aquest pacients presenten una xifra de limfòcits superior a 50x10 9 /L amb una escassa proproció de limfòcits efectors. Un segon grup, composat per tres pacients, incrementa l'activitat lítica. En dos d'ells l'increment és coincident amb una reducció de la limfocitosi i el en tercer amb un increment de la població NK. L'íntima relació que existeix entre la limfocitosi i l'ANK i entre el percentual de les poblacions NK i l'ANK permet suposar una situació teòrica on la disminució de la limfocitosi o l'increment percentual de les poblacions NK es reflecteixi en un increment de l'ANK. El comportament d'aquests t r e s pacients concorda de forma plena amb la hipòtesi de l'efecte dilucional. Es més, la reducció de la citotoxicitat coincidint amb un increment en la x i f r a de limfòcits que s'hauria d'observar de forma teòrica també s'ha pogut demostrar en un pacient en determinacions posteriors.. Finalment,. tres. dels. malalts. tractats. amb. agents. alquilants. disminueixen la seva citotoxicitat. En dos d'ells no s'assisteix de forma immediata i paral·lela a l'increment de la citotoxicitat amb la disminució de la x i f r a de limfòcits. En aquells pacients en els que s'ha pogut practicar més determinacions posteriors s'ha assistit a un increment en l'ANK. Per tant, es pausible que inicialment existeix un efecte citotòxic que afecta als limfòcits leucèmics disminuint la x i f r a de limfòcits i, alhora, un efecte citotòxic sobre els limfòcits efectors que disminueix la seva capacitat lítica. Clàssicament s'ha dit que els alquilants són inhibidors de la citotoxicitat (4). A més, el comportament de la citotoxicitat en el g r u p de pacients tractats amb i n t e r f e r ó substenta la citotoxicitat del CLB sobre les CNK, com s'exposarà més tard. El comportament de l'ANK en relació amb les xifres de limfòcits i poblacions. limfocitàries. és l'esperat. segons. la hipòtesi. de. l'efecte. dilucional.. 246.

(21) discussió.. C. Evolució de l'ANK en pacients tractats amb a 2 b - i n t e r f e r ó Nou malalts en estadi A van ser inclosos en un protocol terapèutic que, en una primera fase, inclou la citorreducció per mitja de CLB i, en una segona fase, l'administració d ' i n t e r f e r ó per valorar l'efecte a n t i tumoral afegit d'aquesta substància. Cap pacient va progressar a un estadi superior de Binet. En la fase de citoreducció mitjançant l'administració de CLB s'obté una reducció de la x i f r a de limfòcits en tots els malalts. L'ANK no s'incrementa de forma global. El 75% pacients amb una ANK basal més baixa incrementen la citotoxicitat fins nivells propers a la normalitat. El 50% dels pacients amb citotoxicitat basai normal la mantenen mentres que el 50% restant presenten una disminució de l'ANK a pesar de la disminució de la xifra de leucòcits. Per tant, en aquells pacients amb una activitat NK menor el tractament pot incrementar-la mentres que en pacients amb citotoxicitat normal la introducció del tractament alquilant pot r e d u i r - l a possiblement per afectar també a les cèl·lules no leucémiques. Aquest efecte citorreductor no selectiu s'observa pel decrement en totes les poblacions limfocitàries B, T i NK després de rebre CLB.. En la fase de tractament amb a-IFN s'observa una gran increment en la citotoxicitat desenvolupada pels malalts. El 85,7% dels mateixos té una citotoxicitat d i n t r e les límits de la normalitat. Algun dels pacients desenvolupa una activitat lítica molt intensa (71,5% a una proporció D:E 1:200). A l'inici de l'estudi únicament el 44% poseia una activitat lítica d i n t r e dels límits de la normalitat. Aquest increment en la citotoxicitat no s'acompanya d'una reducció en la x i f r a de limfòcits. En canvi, l'administració d'a-IFN s'acompanya de redistribució de les poblacions T i NK, que retornen als nivells basais, i d'una disminució de la població leucémica que no assoleix significació estadística.. -. 247. -.

(22) discussió.. L ' i n t e r f e r ó és u n p o t e n t e s t i m u l a n t de l'ANK <11,i3). L ' I n c r e m e n t d e la c i t o t o x i c i t a t j a s ' h a v i a r e f e r i t en assaig in vitro amb. LLC-B.. recuperació. No o b s t a n t ,. no t o t s els a u t o r s c o i n c i d i e n t en el g r a u. de c i t o t o x i c i t a t .. d'aquesta manera postulen defectuosa. r e a l i t z a t s en malalts. Per. un. grup. la r e c u p e r a c i ó és p a r c i a l. q u e la CNK de la L L C - B és. (210,329,373,375,377) m e n t r e. que. de. altres. grups. i. intrínsecament observen. una. r e c u p e r a c i ó total de la c i t o t o x i c i t a t d e s p r é s de la i n c u b a c i ó amb I F N i el d e f e c t e de la CNK no e s t à t a n t c l a r ( 2 1 0 , 3 7 3 ) . L ' a p l i c a c i ó d ' I F N a la L L C B és de r e c e n t i n t r o d u c c i ó i s ' h a limitat a p r o t o c o l s q u e inclouen. pocs. p a c i e n t s . No s ' h a a n a l i z a t l ' e f e c t e de la t e r a p è u t i c a s o b r e l'ANK. La b o n a r e s p o s t a q u e m o s t r a la p a r t f u n c i o n a l de la CNK en el p a c i e n t s en e s t a d i s poc a v a n ç a t s d e L L C - B i n d i q u e n q u e els mecanismes d ' e s t i m u l a c i ó i d e lisi són normals en a q u e s t e s s i t u a c i o n s i q u e l ' e f e c t e " d i l u t o r " dels l i m f ò c i t s B sigui la c a u s a més i m p o r t a n t en la baixa a c t i v i t a t l í t i c a d ' a q u e s t malalts.. Certs l'increment. autors en. han. l'activitat. relacionat lítica. la. resposta. mentres. que. al. altres. tractament autors. no. amb troben. c o r r e l a c i ó e n t r e els dos p a r a m é t r é s (162,179,1S3-185). De f e t , els p a c i e n t s t r a c t a t s v a n r e s p o n d r e o no a l ' a - I F N i n d e p e n d e n t m e n t de l ' i n c r e m e n t en l'ANK.. Possiblement,. l'efecte terapèutic. de l ' I F N. no e s t i g u i. mediat. de. f o r m a d i r e c t a p e r la c a p a c i t a t en i n c r e m e n t a r l ' a c t i v i t a t NK.. En r e s u m , els p a c i e n t s amb L L C - B t e n e n u n a c i t o t o x i c i t a t b a i x a e n c o m p a r a c i ó amb els c o n t r o l s .. La c i t o t o x i c i t a t q u e d e s e n v o l u p e n. una. limfocitosi. relació. inversa. amb. la. i. una. relació. directa. mostra amb. el. p e r c e n t a t g e d e l i m f ò c i t s T i NK. En a q u e l l s casos e n e l s q u e es d i s p o s a d e d e t e r m i n a c i o n s s e q ü e n c i a l s els c a n v i s en la c i t o t o x i c i t a t s e g u e i x e n el s e n t i t c o n c o r d a n t amb e l s p a r à m e t r e s d e s c r i t s , es a d i r q u e. l'activitat. l í t i c a s ' i n c r e m e n t a q u a n d i s m i n u e i x e n e l s limfòcits t o t a l s o q u a n a u g m e n t a el p e r c e n t a t g e de l i m f ò c i t s T I NK. La r e s p o s t a e n la c i t o t o x i c i t a t d e s p r é s d ' i n c u b a c i o n s p e r l l o n g a d e s no ós d i f e r e n t de la n o r m a l , o b t e n i n t - s e x i f r e s d e c i t o t o x i c i t a t s i m i l a r s a la d e l s c o n t r o l s en p e r i o d e s. d'incubació n o r m a l .. -. 248. -.

(23) discussió.. L'IFN incrementa l'ANK in vivo, normalitzant-la. Es possible que els agents alquilants provoquin una disminució de la citotoxicitat per el mateix efecte citoreductor que tenen. Finalment, en estadis precoços de la malaltia la baixa citotoxicitat esta mediada per l'efecte diluclonal dels limfòcits B mentres que en estadis avançats i molt leucocitòsics s'ha de descartar l'alteració intrínseca de la CNK per purificació de les mateixes amb, de forma ideal, un mètode específic per elles (AcMo), ràpid i que no precisi de pasos tècnics realitzats a 4"C.. -. 249. -.

(24) eonelusions. CONCLUSIONS. Dels resultats o b t i n g u t s es desprenen les següents conclusions: 1. Tècnica de citotoxicitat 1.. En. l'estandarització. de. la. tècnica. s'ha. observat. una. bona. reproductibilutat i linearitat. 2.. El càlcul dels valors teòrics de citotoxicitat després de l'ajustament dels valors experimentals a una corba teòrica de tipus von Krogh ha mostrat un bon ajustament, tant en individus control com en pacients amb LLC-B.. 2. Efecte dels limfòcits B a l'ANK de controls 3.. L'increment de la proporció de limfòcits B a la CMN d ' i n d i v i d u s control produeix una reducció en la mateixa que segueix un patró de regressió lineal.. 3. Activitat natural killer a la LLC-B 4.. L'ANK a la LLC-B està disminuïda respecte dels valors control.. 5.. Un. 19,4%. dels. pacients. característiques. d'aquest. desenvolupa grup. una. ANK. normal.. de pacients són: predomini. Les de. l'estadi 0 de Rai (69,9%) i major proporció a SP de limfòcits CD2+, CD4+, CD16+, CD57+, CD11b+ i CD56+.. - 250 -.

(25) conc 1 usions.. 6.. L'ANK mostra una relació lineal inversa amb el recompte de leucòcits i limfòcits dels pacients. Aquesta relació es manifesta en: 1.. increment. de la citotoxicitat. a mesura que augmenta. la. proporció D:E. 2.. la menor citotoxicitat dels pacients en estadis avançats, en els que presenten hepatomegàlia o hipolg A i que corresponen a malalts amb major limfocitosi.. 3.. la relació observada entre l'ANK i el percentatge de limfòcits CD2+, CD4+, CD16+, CD57+, CD11b+ i CD56+, t e n i n t en compte que el percentatge de limfòcits està en relació amb la limfocitosi.. 4.. en els malalts que no han rebut tractament on l'ANK té relació lineal directa amb el percentatge de limfòcits CD16+ i CD11b+.. 7.. Els pacients amb uns percentatges més alts de les poblacions CD2+, CD16+ i CD57* poseeixen una activitat lítica normal.. 8.. L'ANK té relació amb la major presència de LGG.. 9.. El comportament de l'ANK en la LLC-B quan es realitzen incubacions perllongades és normal, si bé no ateny els valors de normalitat.. 10. Els estudis seqüencials mostren, en general, coincidència entre: 1.. l'increment de l'ANK i la disminució de la x i f r a de limfòcits, i a la inversa.. 2.. l'increment de l'ANK i l'increment percentual de les poblacions limfocitàries T i NK.. - 251 -.

(26) conc. lu»ione_. 11. El tractament subcutani amb a-IFN és capaç de normalitzar l'ANK sense incrementar el nombre de limfòcits T I NK. 4. Poblacions limfocitàries 12.. Els pacients amb LLC-B tenen un menor percentatge de limfòcits T i NK i un major percentage de limfòcits CD19+ que el grup control, mostren uns valors absoluts per cadascuna de les. poblacions. analitzades superiors a les del grup control i tenen un quocient CD2/CD19 està molt disminuït. 13.. Les poblacions limfocitàries estan relacionades amb la x i f r a de limfòcits. Aquest fet ha i n f l u i t en els valors absoluts més elevats de limfòcits CD2+, CD4+ i CD19+ que s'observa en els estadis avançats de la malaltia (III=IV o C), en la relació lineal directa entre el valor absolut de limfòcits T i NK i la x i f r a de limfòcits i en la relació lineal inversa entre els percentatges de les diverses poblacions i la x i f r a de limfòcits.. 14. El patró de t i p ú s difús s'associa a uns valors superiors de limfòcits CD4\ 5. - Supervivència i progressió de la malaltia 15.. Les variables que tenen influència sobre la sobrevida, des del moment d'inclusió a l'estudi, en l'anàlisi univariada són la x i f r a de prolimfòcits I de plaquetes inicials, l'estadi de Rai i de Binet, l'ANK, els nivells d ' I g G i I g A inicials. Les variables que han mostrat valor predictiu en l'anàlisi multivariada han sigut la x i f r a de plaquetes i d'hemoglobina inicial i l'ANK a la proporció 1:100. En el g r u p amb. - 252 -.

(27) conc. Tu»iona. LLC-B no quiescent s'han aïllat les mateixes variables amb influència sobre la supervivència. 16.. Les variables amb influència sobre l'aparició d'uns. recomptes. 9. limfocitaris superiors a 50x10 /L des del moment de la inclusió en l'estudi han sigut, tant a l'anàlisi univariada com multi, la x i f r a de limfòcits i l'edat dels pacients. 17.. La xifra de plaquetes. ha mostrat. influència. pronòstica en. la. progressió de la malaltia.. - 253 -.

(28) fiibl. iografia.. BIBLIOGRAFIA. 1. Takasugi M, Mickey RM, Terasaky PI. R e a c t i v i t y o f lymphocytes from norma"! donors on c u l t u r e d tumor c e l l s . Cancer Res 1973; 33: 2898-2902. 2. Ritz J, Schmidt RE, Michon J, Hercend T, Scholssman SF. C h a r a c t e r i z a t i o n of f u n c t i o n a l surface s t r u c t u r e s on human n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Adv Immunol 1988; 42: 181-211. 3. Ritz J. The r o l e of natural k i l l e r c e l l s i n immune s u r v e i l l a n c e . N Eng J Med 1989; 320: 1748-1749. 4. Whiteside TL, Herberman RB. The r o l e of n a t u r a l k i l l e r c e l l s human disease. Clin Immunol Immunopathol 1989; 53: 1-23.. in. 5. Royer HD, Reinherz EL. T lymphocytes: ontogeny, f u n c t i o n , and relevance t o c l i n i c a l d i s o r d e r s . N Eng J Med 1987; 317: 1136-1142. 6. Nossal GJV. The basic components of the immune system. Med 1987; 316: 1320-1325.. N Eng J. 7. Roder JC, H a l i c t i s T, Klein M, Korec S, J e t t JR, Ortaldo JR, Herberman RB. A new immunodeficiency d i s o r d e r i n humans i n v o l v i n g NK c e l l s . Nature (Lond.) 1980; 284: 553-558. 8. Biron CA, Pedersen KF, Welsh RM. Aberrant T c e l l s i n beige mutant mice. J Immunol 1987; 138: 2050-2056. 9. Ortaldc JR. Cytokine production by CD3- large granular lymphocytes. En: CW Reynolds & RH W i l t r o u t , eds - Functions of the natural immune system, Plenum Press, NY, 1988. 10. Reynolds CW, Sharrow SO, Ortaldo JR, Herberman RB. Natural k i l l e r a c t i v i t y i n the r a t . - I I . Analysis of surface antigens on LGL by f l o w cytometry. J Immunol 1982; 127: 2204-2211. 11. Tursz T. Les lymphocytes tueurs n a t u r e l s . 219-223.. Presse Med 1985;. 12. Herberman RB. Natural killer cell mediated tumors. Academic Press. New York. 1980.. immunity. 13. Ortaldo JR, Herberman RB. Heterogeneity of n a t u r a l k i l l e r. 14:. against cells.. - 1 -.

(29) fiibl. iografia.. Ann Rev Immunol 1984; 2: 359-394. 14. Pel i c i PG, Allavena P, Subar M et a l . T c e l l receptor ( a , ß , t ) gene rearrangements and expression in normal and leukemic large granular lymphocytes/natural k i l l e r c e l l s . Blood 1987; 70: 1500-1508. 15. Ortaldo JR, Mathieson BJ, W i l t r o u t RH. C h a r a c t e r i z a t i o n and f u n c t i o n s of n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Ann Inst Pasteur Immunol 1989; 140: 444-450. 16. Herberman RB. NK cells and other Academic Press. New York. 1982.. natural. effector. cells.. 17. Schmidt RE, Hercend T, Schlossman SF, R i t z J. Functional surface s t r u c t u r e s on human n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Klin Wochenschr 1985; 63: 1189-1200. 18. Perussia B, T r i n c h i e r i G. NK c e l l s : a d i s c r e t e leukocyte subset of s t i l l undefined o r i g i n mediating b i o l o g i c a l l y relevant f u n c t i o n s upon s p e c i f i c s t i m u l a t i o n . Ann Int Pasteur Immunol 1989; 140: 438-443. 19. Davignon D, Martz E, Reynolds T, Kurzinger K, Sringer T. Monoclonal antibody t o a novel lymphocyte f u n c t i o n - a s s o c i a t e d antigen (LFA-1): mechanism of blockade of T lymphocyte-mediated k i l l i n g and e f f e c t s on other T and B lymphocyte f u n c t i o n s . J Immunol 1981; 127: 590-595. 20. Schmidt RE, B a r t l e y GT, Lee SS e t a l . Expression o f the NTKa clonotype i n a s e r i e s of human n a t u r a l k i l l e r clones w i t h i d e n t i c a l c y t o t o x i c s p e c i f i c i t y . J Exp Med 1986; 163: 821-825. 21. Ohno T, Kanoh T, A r i t a Y e t a l . Fulminant c l o n a l expansion of large granular lymphocytes. C h a r a t e r i z a t i o n of t h e i r morphology, phenotype, genotype, and f u n c t i o n . Cancer 1988; 62: 1918-1927. 22. P h i l l i p s JH, Lanier LL. A model f o r the d i f f e r e n t i a t i o n of human n a t u r a l k i l l e r c e l l s . J Exp Med 1985; 161: 1464-1482. 23. Hackett J , Bosma GC, Bosma MJ, Bennett M, Kumar V. Transplantable p r o g e n i t o r s of n a t u r a l k i l l e r c e l l s are d i s t i n c t from those of T and B lymphocytes. Proc Natl Acad Sei USA 1986; 83: 3427-3431. 24. Rooney CM, Wimperis JZ, Brenner MK, Patterson J , Hoffbrand AV, Prentice HG. Natural k i l l e r c e l l a c t i v i t y f o l l o w i n g T - c e l l depleted a l l o g e n e i c bone marrow t r a n s p l a n t a t i o n . Br J Haematol 1986; 62: 413-420.. -. 2. -.

(30) bib 7 iograf. ia.. 25. Peter HH. The o r i g i n of human NK c e l l s . An ontogenic model derived from studies i n p a t i e n t s w i t h immunodeficiencies. Blut 1983; 46: 239-248. 26. Biron CA, Byron KS, S u l l i v a n JL. Severe herpesvirus i n f e c t i o n s i n an adolescent w i t h o u t natural k i l l e r c e l l s . N Eng J Med 1989; 320: 1731-1735. 27. Roman-Roman S, Baixeras A, Genevée C, Hercend T, T r i e b e ! F. The T - c e l l receptor V5 genes predominantly used by human p e r i p h e r a l 1/5+ T lymphocytes are not rearranged i n CD3- n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Human Immunol 1989; 26: 75-83. 28. Young HA, Ortaldo JR, Herberman RB, Reynolds CW. Analysis o f Tc e l l - r e c e p t o r i n h i g h l y p u r i f i e d r a t and human large granular lymphocytes (LGL): lack of f u n c t i o n a l 1.3 Kb ß-chain mRNA. J Immunol 1986; 136: 2701-2708. 29. Loughran TP, Starkebaum G, A p r i l e JA. Rearrangement and expression o f T - c e l l receptor genes i n large granular lymphocyte leukemia. Blood 1988; 71: 822-824. 30. Reynolds CW, Ortaldo JR. Natural k i l l e r a c t i v i t y : the d e f i n i t i o n of a f u n c t i o n r a t h e r than a c e l l type. Immunology Today 1987; 8: 172-174. 31. Ortaldo JR, Longo DL. Human n a t u r a l lymphocyte e f f e c t o r c e l l s : d e f i n i t i o n , a n a l y s i s of a c t i v i t y , and c l i n i c a l e f f e c t i v e n e s s . J Natl Cancer Inst 1988; 80: 999-1010. 32. Garni-Wagner BA, W i t t e P, T u t t MM et a l . I s there a common NK/T c e l l p r o g e n i t o r in the thymus?. En Ades EW, Lopez C - Natural killer cells and host defense. S. Karger AG. B a s i l e a . 1989: 2832. 33. Iwatani Y, Amino N, Kabutomori 0 e t a l . E f f e c t s o f d i f f e r e n t sample preparations on enumeration of large granular lymphocytes (LGLs), and demonstration of a sex d i f f e r e n c e of LGLs. Am J Clin Pathol 1988; 90: 674-678. 34. Fontana L, De Rossi G, De Sanctis G e t a l . Decreased NK a c t i v i t y i n h a i r y c e l l leukemia (HCL): An a n a l y s i s at the c e l l u l a r l e v e l . Blut 1986; 53: 107-113. 35. Alvarez-Mon M, Casas J , Laguna R, Jordà J , Duréntez A. C l i n i c a l s i g n i f i c a t i o n of n a t u r a l k i l l e r a c t i v i t y 1n B - c e l l chronic lymphocytic leukemia. Eur J Haematol 1987; 38: 268-273.. - 3 -.

(31) .bibliografia.. 36. Bender BS, Chrest FJ, Adler WH. Phenotypic expression of n a t u r a l k i l l e r c e l l associated membrane antigens and c y t o l y t i c f u n c t i o n of peripheral blood c e l l s from d i f f e r e n t aged humans. J Clin Lab Immunol 1986; 21: 31-36. 37. Gastl G, Schalmzl F, Huhn D, et a l . Large granular lymphocytes: morphological and f u n c t i o n a l p r o p i e r t i e s . I . Results i n normals. Blut 1983; 46: 297-310. 38. P o l l i N, Matutes E, Robinson D, Catovsky D. Morphological heterogeneity of Leu7, Leu11 and 0KM1 p o s i t i v e lymphocyte subsets: an u l t r a s t r u c t u r a l study w i t h the immunogold method. Clin Exp Immunol 1987; 68: 331-339. 39. West WH, Cannon GB, Kay D, Bonnard GD, Herberman RB. Natural c y t o t o x i c r e a c t i v i t y o f human lymphocytes against a myeloid c e l l l i n e : c h a r a c t e r i z a t i o n of e f f e c t o r c e l l s . J Immunol 1977; 118: 355-361.. 40. Horwitz DA, Bakke AC. An Fc r e c e p t o r - b e a r i n g , t h r i d p o p u l a t i o n of human mononuclear c e l l s w i t h c y t o t o x i c and r e g u l a t o r y f u n c t i o n . Immnunol Today 1984; 5: 148-153. 41. Masuci G, Masuci MG, Bejarano MT, K l e i n E. Comparison of h i g h l y NK a c t i v e human lymphocyte subsets separated by various procedures i n v o l v i n g E, EA r o s e t t i n g , d e n s i t y gradients and adherence t o immune complexes. J Immunol Methods 1983; 63: 57-67. 42. Sánchez Madrid F, Cebrián M, Landázuri MO e t a l . Report of the IV I n t e r n a t i o n a l Workshop on Leukocyte d i f f e r e n t i a t i o n antigens (Vienna, 1989). Inmunología 1898; 8: 35-46. 43. Hercend T, G r i f f i n JD, Bensussan A e t a l . Generation o f monoclonal a n t i b o d i e s t o a human n a t u r a l k i l l e r clone. J Clin Invest 1985; 75: 932-943. 44. Perussia B, S t a r r S, Abraham S, Fanning V, T r i n c h i e r i G. Human n a t u r a l k i l l e r c e l l s analyzed by B73.1, a monoclonal antibody blocking Fc receptor f u c n t i o n s . I . C h a r a c t e r i z a t i o n of the lymphocyte subset r e a c t i v e w i t h B73.1. J Immunol 1983; 2133-2141. 45. Bray RA, Gottschalk LR, Landay AL, Gebel HM. D i f f e r e n t i a l surface marker expression i n p a t i e n t s w i t h CD 16+ lymphoproliferative d i s o r d e r s : i n v i v o model f o r NK d i f f e r e n t a t l o r i . Human Immunol 1987; 19: 105-115.. - 4 -.

(32) fiibl. 46. Hiserodt JC, Herberman RB. Natural K i l l e r c e l l s immunity: 1987. Year Immunology 1989; 4: 201-207.. iografia.. and. 47. Schattner A, Dugan DB. Natural k i l l e r c e l l s - toward a p p l i c a t i o n . Am J Hematol 1985; 18: 435-443.. tumor. clinical. 48. Perussia B, T r i n c h i e r i G, Jackson A, Warner NL, Faust J, Rumpold H, et a l . The Fe receptor f o r IgG on human n a t u r a l k i l l e r c e l l s : phenotypic, f u n c t i o n a l , and comparative studies w i t h monoclonal a n t i b o d i e s . J Immunol 1984; 133: 180-189. 49. Y t h i e r A, Hercend T. Subsets of human p e r i p h e r a l blood natural kille.'- c e l l s . Progress in immunology V I . Academic Press I n c . 1986. Toronto. 50. Lanier LL, Kipps TJ, P h i l l i p s JH. Functional p r o p e r t i e s of a unique subset of c y t o t o x i c CD3+ T lymphocytes t h a t express Fc receptors f o r IgG (CD16/Leu-11 a n t i g e n ) . J Exp Med 1985; 162: 2089-2106. 51. Schmidt RE, Murray C, Daley JF, Schlossman SF, R i t z J. A subset of natural k i l l e r c e l l s i n p e r i p h e r a l blood d i s p l a y s a mature T c e l l phenotype. J Exp Med 1986; 164: 351-356. 52. Ortaldc JR, Sharrow SO, Timonen T, Herberman RB. Determination of surface antigens on h i g h l y p u r i f i e d human NK c e l l s by flow cytometry w i t h monoclonal a n t i b o d i e s . J Immunol 1981; 127: 2401-24C9. 53. Nishikawa k, Saito S, Mori i T e t a l . D i f f e r e n t i a l expression of the i n t e r l e u k i n 2 receptor ß (p75) chain on human p e r i p h e r a l blood natural k i l l e r subsets. International Immunol 1990; 2: 481-486. 54. Moretta A, Tambussi G, B o t t i n o C et a l . A novel surface antigen expressed by a subset of human CD3-CD16+ n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Role i n c e l l a c t i v a t i o n and r e g u l a t i o n of c y t o l y t i c f u n c t i o n . J Exp Med 1990; 171: 695-714. 55. Abo T, M i l l e r CA, Gartland L, Balch CM. D i f f e r e n t i a t i o n stages of human n a t u r a l k i l l e r c e l l s i n lymphoid t i s s u e s from f e t a l t o a d u l t l i f e . J Exp Med 1983; 157: 273-284. 56. Janossy G, Coustain-Smith E, Campana D. The r e l i a b i l i t y of cytoplasmic CD3 and CD22 antigen expression in the immunodiagnosis of acute leukemia: a study of 500 cases. Leukemia 1989; 3: 170-181.. - 5 -.

(33) bib 7 iograf. 57. Sheridan W, Winton EF, Chan WC et a l . Leukemia o f non-T n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Blood 1988; 72: 1701-1707.. ia.. lineage. 58. G r i f f i n JD, Hercend T, Beveridge R, Schlossman SF. C h a r a c t e r i z a t i o n of an antigen expressed by human n a t u r a l k i l l e r c e l l s . J Immunol 1983; 130: 2947-2951. 59. Scala G, Allavena P, Ortaldo JR, Heberman RB, Oppenheim JJ. Subsets of human large granular lymphocytes (LGL) e x h i b i t accessory c e l l f u n c t i o n s . J Immunol 1985; 134: 3049-3055. 60. Procopic ADG, Allavena P, Ortaldo JR. Noncytotoxic f u n c t i o n s of n a t u r a l k i l l e r (NK) c e l l s : large granular lymphocytes (LGL) produce a B c e l l growth f a c t o r (BCGF). J Immunol 1985; 135: 3264-3271. 61. P i s t o l a V, Cozzclino F, Torcía M, C a s t i g l i E, F e r r a r i n i M. Production of B c e 1 ! growth f a c t o r by a Leu-7+, 0KM1+ non-T e e l 1 w i t h the f e a t u r e s of l a r g e granular lymphocytes (LGL). J Immunol 1985; 134: 3179-3184. 62. Michael A, Hackett JJ, Bennett M, Kumar V, Yuan D. Regulation cf B lymphocytes by n a t u r a l k i l l e r c e l l s . Role of I F N - t . J Immunol 1989; 142 : 1095-11 CI. 63. Kannaourakis G, Johnson GR, Begley CG, Werkmeisterr JA, Burns GF. Enhancement of in v i t r o beta-thalasserr.ic and normal hematcpoiesis by a noncytotoxic monoclonal antibody 9.1C3: evidence f o r negative r e g u l a t i o n c f hematcpoiesis by monocytes and natura! k i l l e r c e l l s . Blood 1988; 72: 1124-1133. 64. Savs-) CA, Lctzová E. Natural k i l l e r c e l l - m e d i a t e d i n h i b i t i o n of growth of myeloid and lymphoid clonogenic leukemias. Exp Hematcl 1989; 17: 183-187. 65. Cuturi MC, Anegon I , Sherman F et a l . Production of hematopoietic c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r s by human n a t u r a l k i l l e r c e l l s . J Exp Med 1989; 169: 569-583. 66. Hansson M, Petersson M, Koo CG, Wigzell H, K i e s s l i n g R. Natural k i l l e r c e l l s as r e g u l a t o r s of hematopoiesis. En Ades EW, Lopez C - Natural killer cells and host defense. S. Karger AG. Basilea. 1989: 50-54. 67. Mangan KF. Immunologic c o n t r o l of hemopoiesis: i m p l i c a t i o n s f o r quality of the graft after allogeneic bone marrow t r a n s p l a n t a t i o n . Transplant Procee 1987; 19: 23-28.. -. 6. -.

(34) bib 7 iograf. ia.. 68. Matera L, Avanzi G, Cesano A, Bellone G, Malavasi F, Pegoraro L. C h a r a c t e r i z a t i o n of hemopoietic r e g u l a t o r y f a c t o r s released by unstimulated LGL. En Ades EW, Lopez C - Natural killer cells and host defense. S. Karger AG. Basilea. 1989: 92-98. 69. Pross HF, Baines MG. Low natural k i l l e r (NK) c e l l a c t i v i t y in the peripheral blood o f m e t a s t a s i s - f r e e cancer p a t i e n t s i s associated wUh reduced metastasis-free survival time. En "19th Internationa. Leukocyte Conference. A l b e r t a . Canada," 1983 (Abstract). 70. Schantz SP, Goepfert H. M u l t i m o d a l i t y therapy and d i s t a n t metastasis: The impact of n a t u r a l k i l l e r c e l l a c t i v i t y . Arch Otolaryngol Head Neck Surg 19S7; 113: 1207-1213. 71. Katz P, M i t c h e l l SR, Cupps TR, Evans M, Whalen G. Supressicn of B c e l l responses by natural k i l l e r c e l l s i s mediated through d i r e c t e f f e c t s on T c e l l s . Cell Immunol 1989; 119: 130-42. 72. Pohajdak B, Gomez J, Orr FW, K h a l i ! N, Talgoy M, Greenberg AH. Chemctaxls of large granular lymphocytes. J Immunol 1986; 136: 278-284. 72. Natuk RJ, Welsh RM. Accumulation and Chemotaxis of n a t u r a l k i l l e r / l a r g e granular lymphocytes at s i t e s of v i r u s r e p l i c a t i o n . J Immunol 1987; 138: 877-883. 74. Micheal A, Hackett J, Kumar V, Yuan D. I n t e r a c t i o n o f B lymphocytes and NK c e l l s . En Ades EW, Lopez C - Natural killer cells and host defense. S. Karger AG. Basilea. 1989: 75-79. 75. Escudier E, Fleury J, Cordonnier C, Vernant JP, Bernaudin JF. Large granular lymphocytes i n bronchoalveolar lavage f l u i d s from immunocompromised p a t i e n t s w i t h cytomegalovirus pneumonitis. AJCP 1986; 86: 641-645. 76. P i l a r o AM, Sayers TJ. Chemotaxis of r a t p e r i p h e r a l blood large granular lymphocytes t o a c t i v a t o r s o f p r o t e i n kinase C. En Natural killer cells and host defense, EW Ades & C Lopez (eds). S. Karger AG. Basilea. 1989, pag 84-87. 77. Leibson PJ, Hunter-Laszlo M, Douvas GS, Hayward AR. Impaired neonatal n a t u r a l k i l l e r - c e l l a c t i v i t y t o herpes simplex v i r u s : decreased i n h i b i t i o n o f v i r a l r e p l i c a t i o n and a l t e r e d response t o lymphokines. J Clin Immunol 1986; 6: 216-224. 78. Formenti SC, Turner RR, de M a r t i n i RM e t a l . Immunophenotypic a n a l y i s o f p e r i p h e r a l blood leukocytes at d i f f e r e n t stages of HIV. - 7 -.