Riassunto
1 Riassunto
Fusarium è un fungo diffuso in tutto il mondo che infetta le principali colture cerealicole, quali mais e grano.
Il genere Fusarium attualmente conta più di 30 specie, ma la tassonomia e la sistematica sulle relative specie sono state oggetto di numerosi cambiamenti negli ultimi dieci anni ed ancora oggi rimangono una materia controversa. Nuove forme di F. graminearum sono state scoperte recentemente, ma la loro classificazione come nuova specie o popolazione è ancora incerta. F. langsethiae è una specie nuova, inizialmente chiamata “powdery poae”. L’attuale nome scientifico gli è stato conferito in base al fatto che nessun’altra specie di Fusarium avesse le sue stesse caratteristiche morfologiche e lo stesso profilo micotossigeno. F. verticilloides è il nuovo nome scientifico in sostituzione di F. moniliforme, specie sulla quale la tassonomia è stata molto incerta nell’ultimo ventennio. Infine, nuove specie criptiche e nuove popolazioni sono state identificate e classificate all’interno di F. subglutinans.
Nel corso degli anni sono state sviluppate varie tecniche per l’identificazione di Fusarium spp., a partire da quelle di morfologia classica sino ai più attuali metodi molecolari. Alcuni dei più recenti studi filogenetici su Fusarium sono stati condotti utilizzando il gene codificante per elongation factor-1 alpha (EF-1α), che è risultato una fonte di informazione filogenetica migliore dei marcatori ITS, degli isozimi o del gene della β-tubulina.
Riassunto Le diverse specie di Fusarium presentano una grande variabilità e talvolta incongruenze a livello di dimensione del genoma. Le differenze riscontrate, generate da riarrangiamenti genici, sono relative al numero ed alla dimensione dei cromosomi.
Molte specie di Fusarium sono patogeni diffusi a livello mondiale che infettano un vasto numero di colture, in qualsiasi parte della pianta e a qualsiasi stadio del suo ciclo vitale. Tali patogeni possono causare root, stem ed ear rot, provocando una perdita di raccolto del 10-40%. Mais e grano rappresentano gli inoculi primari di Fusarium spp.; in particolare il mais può essere infettato anche quando usato come insilato. Le più rilevanti fitopatie causate da Fusarium spp. sono: Fusarium head blight (FHB), Fusarium ear rot, Fusarium seedling blight e Fusarium stalk rot. Lo sviluppo di tali malattie dipende da vari fattori, quali il clima, il genotipo del fungo e della pianta ospite, le pratiche colturali, la presenza di insetti e funghi competitori e/o antagonisti. E’ stato, inoltre, osservato che una pianta infettata da Fusarium è più suscettibile all’attacco di altri patogeni, in particolare gli insetti.
Alcune specie di Fusarium fitopatogene sono anche produttrici di micotossine, quali i tricoteceni, le fumonisine e lo zearalenone. Tali metaboliti sono tossici sia per l’uomo che per gli animali; possono essere sintetizzati in qualsiasi fase della filiera agro-alimentare e si ritrovano dal campo alla tavola. I prodotti destinati all’alimentazione umana ed i mangimi a rischio di contaminazione sono molti e di vario genere. Attualmente la contaminazione micotossica del raccolto mondiale è di circa il 25%, ma alcune tossine prodotte da Fusarium
Riassunto su mais. Purtroppo poche sono le informazioni sulla relazione tra sintesi delle micotossine, aggressività del patogeno e severità della malattia.
L’importanza che ricoprono a livello internazionale le fitopatie di Fusarium e la contaminazione da micotossine implica la necessità di ottenere una maggiore conoscenza delle singole specie di Fusarium, sia per quanto riguarda i meccanismi di patogenicità e tossicità, sia per la distribuzione geografica. Fondamentale è, inoltre, lo sviluppo di tecniche molecolari che consentano la corretta identificazione e quantificazione di tali specie in tempi brevi ed a costi contenuti. Una migliore comunicazione tra scienziati, agricoltori ed industrie porterà, quindi, ad una gestione migliore della diffusione di Fusarium.
Due recenti metodi molecolari utilizzati per l’identificazione e la caratterizzazione di specie diverse di Fusarium sono la real-time PCR ed il microarray. La real-time PCR, chiamata anche real-time PCR quantitativa (QPCR), è una tecnica basata sulla reazione a catena della polimerasi, che consente l’amplificazione e la quantificazione di un DNA target. La sua principale caratteristica è rilevare in “real-time” il DNA, cioè la quantità di DNA generata ad ogni ciclo di amplificazione. Come la PCR, la QPCR supera i limiti dei metodi di micologia classica per quanto riguarda l’identificazione delle specie fungine, ma si differenzia dalla PCR per la sua maggiore sensibilità ed accuratezza nel quantificare il DNA. La tecnica consente di ridurre i tempi di analisi ed il rischio di eventuali contaminazioni poiché elimina i saggi post-PCR; inoltre, è altamente riproducibile e consente l’analisi in contemporanea di molti campioni.
Riassunto La tecnica del microarray si basa sulla capacità di ibridazione degli acidi nucleici, secondo cui due filamenti ibridano tra loro se complementari. Un microarray è caratterizzato da migliaia di sonde microscopiche, disposte in righe e colonne su una superficie solida, che possono ibridare con altrettanti campioni contemporaneamente. Il microarray consente di analizzare un enorme numero di campioni in tempi e costi ridotti; combinando sensibilità e specificità, dal momento che lo strumento riesce a rilevare sino ad 1 pg di DNA e ciascuna sonda è disegnata in modo da ibridare specificatamente ad un singolo gene. Come la PCR e la QPCR, anche il microarray rappresenta un’innovazione rispetto alle tecniche di micologia classica, ma mentre la QPCR è stata impiegata in analisi sia qualitative che quantitative, il microarray è stato quasi unicamente usato come metodo diagnostico.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato il confronto delle tecniche molecolari Real-Time PCR (QPCR) e microarray per l’identificazione e la quantificazione del DNA di undici specie di Fusarium presenti su campioni di mais danese. La tesi, infatti, fa parte del progetto danese “Mycotoxins carry-over from maize silage via cattle into diary product”. Tutte le specie di Fusarium oggetto di questo studio sono ben noti patogeni del mais, produttori di micotossine: F. graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. subglutinans, F. poae, F. langsethiae, F. proliferatum, F. verticilloides, F. sporotrichioides, F. tricinctum e F. equiseti. Le prove per valutare la QPCR come metodo molecolare di diagnostica hanno costituito il corpo principale della tesi. Una volta eseguita la validazione del
Riassunto EF-1α (elongation factor 1α), ciascuno specifico per una delle specie di Fusarium sopracitate. La parte riguardante il microarray si è basata sugli studi preliminari di un progetto in fase di sviluppo, riguardante l’identificazione delle suddette specie di Fusarium, utilizzando la sequenza EF-1α. Tutti i saggi microarray sono stati realizzati servendosi della tecnologia degli “spotted arrays”. Il metodo della QPCR si è rivelato un valido strumento sia per l’identificazione che per la quantificazione del DNA delle undici specie di Fusarium analizzate. Anche la tecnologia microarray ha permesso l’identificazione di tali specie, ma ulteriori prove sono necessarie per completare l’analisi.
Il lavoro di tesi ha, inoltre, riguardato la ricerca di un’eventuale correlazione tra il livello di micotossine nei campioni e la quantità di DNA della corrispondente specie di Fusarium produttrice. Le micotossine oggetto di questo studio sono state i tricoteceni (deossinivalenolo, nivalenolo, tossine HT-2 e T-2), lo zearalenone e le fumonisine B1 e B2. Una correlazione del 100% è stata evidenziata tra fumonisine e DNA di F. proliferatum. Relativamente al deossinivalenolo, è stata rilevata una bassa correlazione con il DNA di F. graminearum, mentre non è stata riscontrata corrispondenza con le altre specie di Fusarium produttrici. Infine nessuna correlazione è stata registrata tra nivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2 ed il DNA delle rispettive specie di Fusarium produttrici.
Riassunto
Abstract
Fusarium is a widespread fungus that can be found on the most economically important cereal grains such as maize and wheat.
The genus Fusarium currently includes more than 30 species, but the taxonomy and the systematics of Fusarium species have been the object of many changes in the last ten years and nowadays it remains a controversial matter. Recently new strains of F. graminearum were identified but no agreements were found in classifying them as new populations or species. F. langsethiae is a quite new species, initially called “powdery poae”. The presently accepted name was given according to the fact that both morphological and mycotoxic profiles weren’t found in other Fusarium species. F. verticilloides was previously called F. moniliforme. Much confusion there has been around this name during the last two decades, until the final accepted name F. verticilloides was given. Furthermore new cryptic species and populations were identified and classified as F. subglutinans.
Approaches used to gain a clear identification of the species have been several, ranging from traditional morphological methods to new molecular and metabolic ones. Recent phylogenetic studies have been carried on using the translation elongation factor-1 alpha gene (EF-1α) that has been demonstrated to be a higher source of phylogenetic information at Fusarium species level than ITS, isozyme or β-tubulin gene.
Riassunto A great variability can be observed among Fusarium species karyotypes due to differences in chromosome number and size caused by genome rearrangements. Some incongruities also exist.
Many Fusarium species are well-known worldwide pathogens that infect several crop plants attacking all plant parts at all stages. They can cause root, stem and ear rot leading to a 10%-40% ranging loss of crop yield. Maize and wheat are regarded as the primary inoculum for Fusarium species. In addition, Fusarium species can infect maize also when used as row material for silage. Most important diseases caused by Fusarium spp. are Fusarium head blight (FBH), Fusarium ear rot, Fusarium seedling blight and Fusarium stalk rot. Development and severity of Fusarium diseases depend on several factors such as climate, fungal and host plant genotype, cultural practices, presence of herbivore, fungal competitors or antagonists. Fusarium infection has been described as a promoting factor for insect infestation on crop.
In addition to plant pathogenicity, Fusarium spp. hazard is exacerbated by the capacity of most species to synthesize mycotoxins. The most relevant classes of mycotoxins are trichothecenes, fumonisins and zearalenones. Mycotoxins are toxic to both human and animals, but little is known about the relation between mycotoxins synthesis, Fusarium spp. aggressiveness and the severity of the disease. Mycotoxins can be synthesized in all steps of the food and feed chain and they can be found “from field to table”, by contaminating a wide range of food and feed products. At least 25% of the world food crop is contaminated by mycotoxins but some Fusarium toxins (e.g. DON and FB1) on maize can reach even higher levels.
Riassunto The worldwide hazard of Fusarium diseases and mycotoxins involves the need of a deeper understanding of each species. It is of paramount importance the development of fast and easy molecular quantitative assays to correctly identify Fusarium species, and to have a better understanding of their pathogenicity and toxigenicity mechanisms, as well as of their geographical distribution. In this way there will be a clearer communication between scientists, farmers and industries that will allow a better management of Fusarium spread.
Real-time PCR and microarray are two recent molecular methods used for identification and characterization of Fusarium species. Real-Time PCR, also called Quantitative Real-Time PCR (QPCR), is a technique based on polymerase chain reaction, which is used to amplify and quantify a DNA target. Its main feature is the detection of DNA in “real time” as it accumulates after each amplification cycle. For this reason it is more sensitive and accurate in DNA amount quantification than PCR. Like PCR, real-time PCR surpass limits of classical mycology methods. QPCR allows faster analysis and it reduces the risk of contamination because it does not need post-PCR processing; furthermore it is highly reproducible and more suitable to analyze many samples. Real-time QPCR is then a high throughput molecular method of analysis compared to the previous ones.
Microarray is a technique based on nucleic acids hybridization ability according to which two complementary strands hybridize to each other. It can contain thousand of microscopic probes disposed on a solid surface in rows and columns; indeed its main feature is
Riassunto time. Microarray is a high throughput molecular method because it allows fast and efficient analysis of a huge amount of samples. It combines sensitivity and specificity because less than 1 pg of DNA can be detected and each probe is designed to recognize a specific gene. Like in real-time PCR assay, microarray goes beyond limits of classical mycology analysis. While real-time PCR has been used in molecular quantification of Fusarium species, qualitative analyses with microarray have been mostly performed.
As part of the Danish project “Mycotoxins carry-over from maize silage via cattle into diary product”, the aim of my work was to compare the suitability of quantitative real-time PCR and microarrays assays in detecting and quantifying the DNA amount of eleven Fusarium species infecting Danish maize samples. Fusarium species covered by these studies were well-known mycotoxins producers and maize pathogens: F. graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. subglutinans, F. poae, F. langsethiae, F. proliferatum, F. verticilloides, F. sporotrichioides, F. tricinctum and F. equiseti. Testing the feasibility of QPCR assay as a diagnostic molecular method was the main body of the work, validating the method and carrying out Fusarium species-specific assays based on EF-1α sequence with all samples. Studies on microarrays were the previous part of a developing project on Fusarium species diagnostic based on EF-1α sequence. All microarray analyses of this research work were carried out using the “spotted arrays” method.
QPCR assay turned out suitable for the identification and the quantification of the eleven analyzed Fusarium species. Also the
Riassunto microarray technique allowed identifying those species, but further experimental proofs are needed to fulfil the analysis.
We also investigated the presence of any correlations between mycotoxin levels in samples and DNA amounts of corresponding Fusarium producers. Mycotoxins tested were trichothecenes (DON, NIV, HT-2 and T-2), zearalenone and fumonisins.
A 100% correlation has been pointed out between fumonisins and F. proliferatum DNA. Instead, deoxynivalenol and F. graminearum DNA were low correlated, and no interrelations at all were found with the other Fusarium species. Moreover no correlations were observed among nivalenol, zearalenone, T-2 and HT-2 toxins and corresponding producers Fusarium DNA.
