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Dipartimento di Scienze Veterinarie
Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
CHIRURGIA ONCOLOGICA DEL MASTOCITOMA.
TECNICHE DI VALUTAZIONE CLINICA
DEI MARGINI DI ESCISSIONE
Candidato: Relatore:
Mara Michelucci Prof. Iacopo Vannozzi
Correlatore:
Dott. Alessio Pierini
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AD ANDREA CECCARELLI (1982-2007)
A MIA NONNA MOSTI ANGELA (1929-2005)
"NON C'E SUCCESSO IN MEDICINA SENZA UMANITÀ"
Cit: Mara MichelucciPag. 2 a 57
INDICE
Pag.
1 Indice
Pag.
3 Riassunto e Abstract
Pag.
4 Introduzione
Pag.
5 Capitolo 1
Pag.
8 Capitolo 2
Pag. 21 Capitolo 3
Pag. 24 Capitolo 4
Pag. 30 Capitolo 5
Pag. 43 Discussioni
Pag. 44 Conclusioni
Pag. 45 Bibliografia
Pag. 55 Ringraziamenti
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RIASSUNTO
PAROLE CHIAVE: Cane, Mastocitoma Cutaneo, Ecografia, Chirurgia, Istopatologia
In questo studio sono stati esaminati 15 mastocitomi Cutanei Canini con lo scopo di valutare se l 'indagine ecografica è utile per definire i margini di escissione chirurgici e la tecnica chirurgica.Tramite l'Ecografia sono state determinate la dimensione,la forma e i margini dei Mastocitomi applicando poi Clip Metalliche che delineano i margini ecografici stessi.Ogni Mastocitoma è stato asportato chirurgicamente mantenendoci con l'incisione a 2 cm minimo dalle Clip metalliche,immerso in formalina e sottoposto all'esame Istopatologico dei margini per valutare se liberi o infiltrati di Mastociti.Il Patologo ha inoltre assegnato ad ogni Mastocitoma anche il Grado di Kiupel.
ABSTRACT
KEY WORDS: Canine, Cutaneous Mast Cell Tumors, Ultrasound, Histopathology
In this study 15 cutaneous canine mastocytomas were examined with the aim of evaluating whether the ultrasound examination is useful for defining surgical excision margins and the surgical technique. The ultrasound was used to determine the size,shape and margins of the Mastocytomas,then applying metal clips that outline the ultrasound margins themselves.Each Mastocytoma was surgically removed,maintaining the incision at 2cm minimum from the metal clips, immersed in formalin and subjected to histopathological examination of the margins to evaluate whether free or infiltrated mast cells. The Pathologist as also assigned to each mastocytoma also Degree of Kiupel.
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INTRODUZIONE
Il Mastocitoma è un tumore che origina dalle Mastzellen residenti nel derma o nel tessuto sottocutaneo.In citologia viene indicato come "Neoplasia a Cellule Rotonde" insieme a Istiocitoma, Plasmocitoma, Tumore Venereo Trasmissibile, Linfosarcoma. Nel cane rappresenta il 16-21% dei tumori cutanei in eta' media di 9 anni e piu' frequentemente in Boxer, Boston Terrier,B ull Terrier, fox Terrier, Staffordshire Bull Terrier, Labrador, Carlino. In assenza di metastasi agli organi addominali la Chirurgia rappresenta il trattamento d'elezione del Mastocitoma Cutaneo Canino asportandolo con margini di 3cm su ogni lato e un piano fasciale in profondita' rispetto al tumore. Nella stadiazione dei tumori del cane le neoplasie superficiali non vengono valutate con tecniche di Diagnostica per Immagini anche se l'Ecografia rappresenta un mezzo utile.In riferimento a questo vi è uno studio condotto da Hahn et al.del 1990 dove è stata valutata l'estensione del limite ecografico del Mastocitoma Cutaneo Canino rispetto a quello visibile e in aggiunta sono state integrate anche le caratteristiche ecografiche riportate da Loh et al.nel 2009 e Nyman et al.nel 2006. Lo scopo di questo lavoro è stato esaminare tramite l'ecografia l'estensione e le caratteristiche del Mastocitoma Cutaneo Canino con l'obbiettivo di valutare possibili informazioni utili ai margini di escissione chirurgici e determinare se l'indagine ecografica è utile ai fini della chirurgia.
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CAPITOLO 1
MASTOCITOMA CANINO
Nei cani il mastocitoma, che è il tumore cutaneo più comune,origina dalle Mastzellen, residenti nel derma o nel tessuto sottocutaneo, che derivano da cellule progenitrici CD34 del midollo emopoietico. Dal midollo le cellule progenitrici migrano nei tessuti periferici dove,sotto l’influenza di citochine locali, si differenziano in Mastzellen mature.Queste sono presenti nella maggior parte dei tessuti specialmente dove l’organismo è a contatto con l’ ambiente come la pelle e le mucose. Le Mastzellen si trovano occasionalmente anche nel midollo emopoietico,ma non sono mai presenti nel sangue circolante. Le Mastzellen contengono granuli citoplasmatici pieni di sostanze bioattive,c ome l’istamina e l’eparina, implicate nell’ipersensibilità, nell’allergia e nei processi infiammatori. I granuli citoplasmatici si colorano metacromaticamente in viola con il Blu di Toluidina. Il mastocitoma rappresenta il 16-21% dei tumori cutanei del cane. Si manifesta all ‘età media di 9 anni e più frequentemente nei Boxer, Boston Terrier, Bull Terrier, Fox Terrier, Staffordshire Bull Terrier,Labrador e Carlino.Nei Boxer e nei Carlino il tumore ha in genere una prognosi più favorevole. Invece in altre razze come gli Shar-Pei, specialmente nei giovani, ha un comportamento molto aggressivo. Macroscopicamente il mastocitoma appare in forma di singoli nodi o noduli o papule,da pochi mm a numerosi cm di diametro (in media circa 3 cm), non incapsulati, ma ben circoscritti, talvolta peduncolati,di colore rossastro per eritema o nerastro per iperpigmentazione melanica. Alcuni mastocitomi si presentano come pomfi orticarioidi o estesi focolai di edema infiammatorio simili a celluliti. In certi casi il tumore ha l’aspetto di un nodulo sormontato da peli ispidi oppure è ulcerato. Talvolta la manipolazione meccanica durante l’esame per palpazione determina la liberazione dalle Mastzellen di sostanze vasoattive che provocano eritema e edema infiammatorio locale con formazione di pomfi (segno di Darier). Generalmente localizzato nel derma, il mastocitoma cutaneo può talora coinvolgere anche i tessuti sottostanti. Si considera come variante il mastocitoma sottocutaneo. La superficie di
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taglio mette in evidenza un tessuo neoplastico bianco-grigiastro, talvolta edematoso ed emorragico, o pigmentato. Le neoformazioni sono per lo più singole, ma possono svilupparsi anche in forma multipla (11% ca), contemporaneamente o in sequenza. Le sedi di predilezione del mastocitoma sono la cute del tronco, la regione perineale (50%), delle estremità (40%) e della testa e del collo (10%). Le recidive sono frequenti per la natura infiltrante del tumore.
Le metastasi si sviluppano in un primo tempo nei linfonodi,poi in vari organi interni, soprattutto nella milza, nel fegato e nel midollo osseo. Può essere presente nel sangue periferico una mastocitemia e talvolta un’eosinofilia e una basofilia.Tuttavia la mastocitemia è rilevabile anche in varie malattie con infiammazione acuta come le infezioni da Parvovirus.
Il reperto citologico dell’aspirato midollare è considerato anormale quando le Mastzellen sono più di 10/10.000 cellule midollari. Nei cani affetti da mastocitoma si possono riscontrare fenomeni paraneoplastici fisiopatologici causati dalla liberazione dalle cellule neoplastiche di eparina (prolungamento del tempo di coagulazione:anticoagulante), di istamina (ipersecrezione acida gastrica con formazione di ulcere gastro-duodenali) e di proteasi. Localmente, nella sede primaria del tumore, queste sostanze possono causare edema, ulcerazioni, ritardo della cicatrizzazione, e difetti locali della coagulazione del sangue.
I più frequenti effetti sistemici sono quelli che riguardano l’apparato gastroenterico. L’istamina liberata dalle cellule neoplastiche stimola i recettori gatrici H2 con l’effetto di un’eccessiva liberazione di acido cloridrico e di un’ipermotilità gastrica. Altri effetti secondari sono ulcera e vomito, emorragia gastrointestinale, anemia, peritonite da ulcera perforata. Blackwood et al. riportano che in sede di necroscopia si possono rilevare ulcere gastrointestinali nel 35-83% dei casi di mastocitoma.Inoltre, molto più di rado la liberazione di istamina può causare una reazione anafilattica acuta e episodi di collasso.
Altri fenomeni, registrabili in concomitanza al mastocitoma del cane,sono una glomerulonefrite fcale e un deficit nella produzione di anticorpi. In partenza da un mastocitoma cutaneo malignosi può manifestare infrequentemente una mastocitosi
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sistemica di origine metastatica. E’ ancor meno frequente la mastocitosi sistemica
(multiorganica: l infonodi, milza, fegato, midollo osseo, rene, polmoni e cuore) in partenza da un mastocitoma extracutaneo (cavità orale, laringe e trachea, linfonodi, raramente l’intestino).
La mastocitosi sistemica canina si accompagna raramente alla leucemia mastocitaria (mastocitoleucemia o mastocitoleucosi leucemica).
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CAPITOLO 2
DIAGNOSI E PROGNOSI:LO STAGING CLINICO DEL MASTOCITOMA
CANINO
DIAGNOSI
La diagnosi certa e l’identificazione delle variabili cliniche, patologiche e molecolari predittive di un comportamento metastatico del mastocitoma canino servono a indirizzare il clinico ad eseguire precisi atti, come il campionamento citologico e/o istologico degli organi bersaglio(linfonodi regionali,l infonodi a distanza, milza, fegato, sangue periferico e midollo osseo) per la ricerca precoce di metastasi, le quali si associano a una riduzione dei tempi di sopravvivenza. Sono utili per la diagnosi e la stadiazione degli MCT anamnesi, esame fisico, patologia clinica, citologia del tumore e del midollo osseo, radigrafie, ecografie e istopatologia.
Anamnesi: L’anamnesi può stabilire da quanto tempo è presente la massa e la sua
velocità di crescita. Gli MCT presenti da mesi senza peggioramento dell’aspetto clinico posssono essere associti a prognosi favorevole.
Esame fisico: Esaminare accuratamente l’animale per rilevare la localizzazione e il
numero delle masse. Eseguire un’attenta palpazione per rilevare epatomegalia, splenomegalia e ingrossamento dei linfonodi quali segni di metastasi.
Patologia clinica: Gli esami di laboratorio di routine possono essere normali.
Esaminare l’emogramma per cercare segni di disseminazione sistemica. Nei mastociti circolanti l’acidofilia e la basofilia sono frequenti più nel cane che nel gatto (tranne che nella forma viscerale). L’anemia microcitico-ipocromica può sugerire la presenza di emorragia gastro-intestinale.
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pazienti afetti da malattie non neoplastiche potrebbero presentarne un numero più elevato.
Ago-aspirato del midollo osseo: E’ un indicatore più attendibile dello striscio del
buffy coat per determinare il coinvolgimento del midollo osseo. La presenza di più di 10 mastociti ogni 1000 cellule nucleate è anomala. Tuttavia, il coinvolgimento del midollo osseo interessa meno del 5% dei cani affetti da MCT cutanei.
Radiografie ed ecografie: Eseguire l’esame radiografico o ecografico (preferibile)
dell’addome per individuare epatomegalia,splenomegalia e ingrossamento dei linfonodi intraddominali. L’FNA degli organi che si sono ingrossati (in particolare la milza) può essere utile per confermare un MCT metastatico. Le radiografie toraciche sono raramente utili.
Ago-aspirato mediante ago sottile: Gli MCT si esfoliano bene e di solito è
possibile la diagnosi tramite FNA.In generale, gli aspirati contengono numerose cellule rotonde separate da abbondanti granuli basofili (mastociti). Occasionalmente, è possibile che i granuli non si colorano bene con la colorazione rapida (Diff-Quick®).
Istopatologia: L’istopatologia è importante per valutare la completa asportazione e
il grado istologico.Talvolta sono necessari coloranti speciali (blu di Toluidina, Giemsa) per identificare gli MCT indifferenziati. Sui campioni istopatologici si possono eseguire altre colorazioni o test immunoistochimici che possono favorire la determinazione della prognosi,ossia colorazione AGNOR (agyrophilic nucleolar staining organizing regions), PCNA (proliferating cell nuclear antigen, antigene nucleare delle cellule proliferanti) e colorazione Ki-67. Più elevate risultano le conte, peggiore sarà la prognosi.
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Secondo il sistema di graduazione di Patnaik si distinguono nel mastocitoma canino tre tipi citologici: ben differenziato (grado1), intermedio (grado2), anaplastico (grado3)
Graduazione istologica dei mastocitomi secondo Patnaik
Grado istologico 1 2 3 Estenzione del tumore Cellularità Morfologia cellulare Morfologia nucleare Derma Mastzellen separate da fibre collagene Rotonda, monomorfa, confini cellulari distinti, granuli di media grandezza Rotonda Derma e sottocute Da moderata ad altamente cellulare Da rotonda ad ovoidale, cellule moderatamente pleomorfe con sparse cellule fusiformi o giganti,confini cellulari distinti, granuli fini Da rotonda a indentata, nucleoli singoli, alcune cellule con nuclei doppi
Invade sotocute e tessuti profondi Altamente cellulare Pleomorfa, cellule di media grandezza, rotonde, ovoidali o fusiformi, confini cellulari indistinti, granuli fini o assenti
Nuclei indentati e
escicolosi con uno o più nucleoli, sparse cellule multinucleate
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STADI DEL MASTOCITOMA SECONDO LA WORLD HEALT ORGANIZATION. SI RIPORTA IN AGGIUNTA LA DESCRIZIONE DELLE PROCEDURE CLINICHE NECESSARIE A DEFINIRE LO STADIO CLINICO
STADIO DEFINIZIONE PROCEDURE DIAGNOSTICHE RICHIESTE 0 Mastocitoma asportato incompletamente senza coinvolgimento linfonodale
-Valutazione istopatologica dei margini di escissione chirurgica -Valutazione citologica e/o istologica del linfonodo regionale.
La valutazione istologica è sempre da preferire 1 Mastocitoma singolo localizzato al derma, senza coinvolgimento linfonodale
-Valutazione istologica della massa escissa
-Valutazione citologica e/o istologica del linfonodo regionale.
La valutazione istologica è sempre da preferire 2 Mastocitoma singolo localizzato al derma, con coinvolgimento linfonodale
-Valutazione istologica della massa escissa
- Valutazione citologica e/o istologica del linfonodo regionale.
La valutazione istologica è sempre da preferire 3 Mastocitoma multiplo o MCT singolo infiltrante con o senza coinvolgimento linfonodale
- Valutazione clinica accompagnata dalla diagnosi citologica
- La valutazione istologica è da preferire nella diagnosi di mastocitoma infiltrante
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del linfonodo regionale.
La valutazione istologica è sempre da preferire
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Qualsiasi mastocitoma con metastasi a distanza o recidiva con metastasi (incluso coinvolgimento di sangue e midollo)
Ogni stadio può essere sudddiviso in:
a: senza sintomi sistemici
b: con sintomi sistemici (i sintomi possono riferirsi ai segni di DARIER: edema,
prurito, eritema, locali o sistemici, vomito,
diarrea, sincopi
Diagnosi citologica di metastasi negli organi bersaglio
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VALUTAZIONE CITOLOGICA DEL CAMPIONAMENTO LINFONODALE SECONDO KRICK ET AL. 2011
DIAGNOSI CITOLOGICA DESCRIZIONE
Linfonodo normale Assenza di mastociti
Linfonodo reattivo Più dl 50% di piccoli linfociti
frammisti a pro linfociti, l infoblasti, plasmacellule e/o da basso a moderato numero di macrofagi, eosinofili,
neutrofili e/o rari ed isolati mastociti Possibile metastasi Almeno su un vetrino,due o tre
aggregati formati da 2-3 mastociti Probabile metastasi Almeno su un vetrino, più di tre
aggregati formati da 2-3 mastociti e/o da due a cinque aggregati formati da più di 3 mastociti
Metastasi certa Almeno su un vetrino, tessuto linfoide assente in presenza di mastociti e/o presenza di aggregati di mastociti poco differenziati con pleomorfismo, anisocitosi, anisocariosi e/o mastociti con poca granulazione citoplasmatica e/o più di cinque aggregati formati da più di 3 mastociti
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VALUTAZIONE ISTOLOGICA IN SEGUITO A LINOFADENECTOMIA SECONDO WHEISHAAR ET AL,2014
CLASSIFICAZIONE DESCRIZIONE
HN0-Non metastatico
Nessuno o rari (0-3) mastociti isolati localizzati a livello dei seni
(sucapsulari, paracorticali, medullari) e/o del parenchima (0-3
mastociti/campo a 400x
ingrandimento), o il campione non corrisponde alle descrizioni
successive
HN1-Pre-metastatico
Più di 3 mastociti isolati localizzati a livello dei seni (sucapsulari, paracorticali, medullari) e/o del parenchima in almeno 4 campi a ingrandimento 400x
HN2-Metastasi precoce
Cluster di almeno 3 mastociti localizzati a livello dei seni
(sucapsulari, paracorticali, medullari) e/o del parenchima, o distesedi
mastociti nei seni sinusoidali
HN3-Metastasi conclamata
Distruzione della normale architettura del linfonodo per presenza di noduli, foci o masse conclamate di mastociti
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CRITERI DI DIAGNOSI CITOLOGICA PER MALATTIA METASTATICA A CARICO DI MILZA E FEGATO SECONDO STEFANELLOET AL,2009
Organo negativo per metastasi Non si evidenziano mastociti Mastociti rari e isolati
Mastociti associati al connettivo Organo positivo per metastasi Cluster di mastociti ben differenziati
Mastociti ben differenziati in numero elevato
Mastociti morfologicamente atipici
LISTA DI FATTORI PROGNOSTICI CHE SI ASSOCIANO PIU’FREQUENTEMENTE A PROGNOSI SFAVOREVOLE(FATTORI PROGNOSTICI NEGATIVI)
VARIABILI CLINICHE VARIABILI PATOLOGICHE
Localizzazione muco-cutanea o viscerale
Gradi istologico 3 (Patnaik et al,1984)
RazzaShar-Pei Alto grado (Kiupel et al, 2011) Dimensioni > 3cm Indice mitotico elevato
Ulcerazione Ki67 elevato
Segni
sistemici(anoressia,vomito,melena)
Espressione immunoistochimica intracitoplasmatica della proteina KIT Recidiva locale Presenza di mutazioni del gene c-KIT
(analisi PARR) Linfoadenomegalia regionale
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IMMUNOISTOCHIMICA
Pattern 1: colorazione della sola
membrana cellulare
Pattern 2: piccoli punti
intracitoplasmatici colorati o aggregati colorati in posizione paranucleare
Pattern 3: colorazione
citoplasmatica diffusa e di alta intensità con aggregati di grandi dimensioni in posizione
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CAPITOLO 3
TRATTAMENTO DEI MASTOCITOMI CUTANEI NEL CANE
Il trattamento dei MCT può prevedere intervento chirurgia, radioterapia, chemioterapia o una combinazione dei tre. Il tipo di trattamento istituito dipende principalmente dal grado istologico del tumore e dallo stadio clinico del paziente.
Intervento chirurgico
Il trattameno di elezione dei MCT canini è un’ampia asportazione chirurgica.
•
Somministrare un antistaminico (es:difenidramina 2mg/Kg IM o EV) appena prima dell’asportazione chirurgica di tumori di grandi dimensioni per diminuire gli effetti del rilascio di istamina da parte del tumore.•
Asportare la massa con margini di 3 cm su ogni lato e un piano fasciale in profondità rispetto al tumore.•
Rimuovere i linfonodi regionali se sono ingrossati o se vengono rilevate metastasi.•
Eseguire la valutazione istologica dei margini del campione per valutare la completezza dell’asportazione e il grado. Se il tumore si estnde ai margini, pianificare (se possibile) una seconda asportazione più ampia.•
Nel caso in cui i tumori siano asportati parzialmente o non resecabili, procedere con chemioterapia e/o radioterapia.In seguito all’asportazione dell’MCT possono insorgere complicanze a carico della ferita, come infiammazione eccessiva, edema e deiscenza.
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La radioterapia,da sola o in combinazione con altre modalità terapeutiche può essere usata per trattare gli MCT asportati parzialmente o non resecabili.
•
I pazienti affetti da tumori di grado 1 e 2 reagiscono meglio di quelli affetti da grado 3.•
L’irradiazione è molto efficace nei confronti delle neoplasie microscopiche.•
Se necessario irradiare i linfonodi regionali coinvoltiChemioterapia
La chemioterapia è indicata nei pazienti affetti da mastocitosi sistemica, tumori di grado 3, tumori non resecabili o tumori asportati parzialmente quando non è possibile eseguire un secondo intervento chirurgico o una seconda radioterapia.
•
I glucocorticosteroidi (prednisone e prednisolone) sono usati comunemente, ma sono efficaci in meno del 25% dei cani se usati da soli.•
I farmaci chemioterapici che si sono dimostrati efficaci nei confronti degli MCT sono vimblastina, ciclofosfamide e lomustina. Si presume che la terapia combinata sia migliore di quella con agente singolo.Terapia farmacologica ausiliaria
I pazienti affetti da tumori di grado 3,mastocitosi sistemica o emorragia gastrointestinale devono ricevere una terapia farmacologica ausiliaria.
•
Usare H2-antagonisti per ridurre la secrezione degli acidi gastrici e favorire la diminuzione dell ‘incidenza di ulcere gastrointestinali nei pazienti affetti da MCT. Somministrare uno dei seguenti H2-bloccanti-Cimetidina,5-10mg/Kg PO q8h -Ranitidina,1-2mg/Kg PO q12h -Famotidina,0,5-1mg/Kg PO q24h
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animale affetto da MCT somministrare anche il seguente farmaco :
-Sucralfato,250-1000mg PO q6-8h
Usare un H1-antagonista (difenidramina) secondo necessità per ridurre l’infiammazione e il prurito associati al rilascio di istamina.
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CAPITOLO 4
ECOGRAFIA (ULTRASONOGRAFIA)
Ci sono tecniche che utilizzano onde elettromagnetiche a frequenze molto diverse per ottenere immagini diagnostiche.
In natura esiste un altro tipi di onde,le onde meccaniche.
Esse hanno bisogno di un mezzo meccanico per propagarsi,infatti esse consistono in un movimento oscillatorio, generalmente microscopico, di particelle.Si è soliti classificare le onde meccaniche in funzione della loro frequenza in infrasuoni,suoni e ultrasuoni. I primi hanno frequenza inferiore a 16 Hz,i suoni tra 16 e 20.000 Hz,al di sopra dei 20.000 Hz si parla di ultrasuoni. L'ecografia è una tecnica di Diagnostica per Immagini in grado di fornire immagini tomografiche delle strutture corporee in tempo reale,mediante l'utilizzo di ultrasuoni. Gli ultrasuoni impiegati in diagnostica hanno frequenze comprese tra 1 e 20 MHz. Essi hanno avuto ampia diffusione in diagnostica a partire dagli anni '70. L'apparecchio ecografico è costituito da quattro componenti:
- Un trasduttore o sonda,che viene posto a contatto della cute del paziente o inserito nel corpo in prossimita'della struttura da studiare.
- Un sistema elettronico, costituito da circuiti diversi che pilotano il trasduttore generando l'impulso di trasmissione, ricevono il segnale elettrico prodotto dall'eco di ritorno della sonda,ed amplificano ed elaborano il segnale ricevuto.
- Uno scan-converter,che ha funzione di memorizzare i dati ottenuti durante la scansione e di convertirli nel formato necessario per rappresentare l'immagine o una seguenza di dati in forma di tracciato.
- Un sistema di visualizzazione e stampa,costituito da un monitor televisivo,che consente di visualizzare le immagini prodotte e una stampante che registra le immagini su pellicole radiografiche o su carta.
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Nell'apparecchio ecografico (ecografo) gli ultrasuoni sono prodotti da sonde (trasduttori) dotate di cristalli piezoelettrici. Le onde hanno una doppia funzione: producono ultrasuoni e leggono gli echi riflessi dalle strutture corporee permettendo la costruzione delle immagini ecografiche. L'Effetto Piezoelettrico è il fenomeno fisico per il quale l'energia elettrica puo' essere covertita in energia meccanica da alcuni materiali come il quarzo,che rispondono all'applicazione di differenze di potenziale con piccole deformazioni. Applicando quindi un segnale elettrico alternato ,i cristalli piezoelettrici contenuti nelle sonde ecografiche entrano in vibrazione, producendo onde meccaniche della stessa frequenza del segnale elettrico. Questi stessi materiali forniscono una tensione elettrica proporzionale a un'eventuale sollecitazione meccanica a cui siano sottopostied è questa proprieta' che viene sfruttata per la rilevazione degli echi,cioè degli ultrasuoni riflessi dalle strutture esaminate. Negli apparecchi ecografici moderni si utilizzano materiali piezoelettrici "sintetici"chiamati ceramiche ferroelettriche (in particolare PZT, piombozirconato-titanato), che possono essere prodotti in forme molto diverse adatte alla costruzione dei diversi tipi di trasduttore utilizzati per gli esami ecografici.In futuro questi materiali piezoelettrici ceramici potrebbero essere anche sostituiti da speciali polimeri plastici.
Princpi fisici
Un fascio di ultrasuoni è costituito da una serie di onde longitudinali (con variazioni di pressione nella direzione di propagazione)che viaggiano nei tessuti molli,ad una velocita' di circa 1500m/sec;la velocita' di trasmissione non dipende dalla frequenza del suono ma dalle caratteristiche del mezzo attraversato.In un mezzo omogeneo la lunghezza d'onda(I)è uguale al rapporto tra la velocita'(V)e la frequenza(v):
I=V/v
La velocità dipende dalla proprieta' fisica del materiale definita"impedenza acustica". Gli ultrasuoni vanno piu' veloci nei mezzi piu' densi e sono trasmessi piu' lentamente nell'aria. Tra aria e tessuti corporei c'è un enorme differenza di velocita'
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di trasmissione e questo ha un'importanza pratica notevole per l'esecuzione dell'esame ecografico e per alcuni problemi che si possono verificare nel corso dell'esame ecografico. L'esame ecografico consiste nel campionamento degli echi riflessi dalla parte del corpo verso la quale vengono indirizzati i fasci di ultrasuoni.Il segnale ecografico si ottiene con impulsi di breve durata (ne vengono prodotti circa 1000 al sec o piu'). Negli intervalli tra gli impulsi il trasduttore fuziona da "ricevitore degli echi". L'apparecchio è in grado di misurare il "ritardo"dell'eco e quindi di misurare la profondita' a cui l'eco si è generata.Nell'attraversamento dei tessuti corporei il fascio va incontro a una serie di fenomeni fisici che "attenuano" il fascio; questi fenomeni comprendono:
▪ Diffusione ▪ Riflessione ▪ Rifrazione ▪ Assorbimento
Il fenomeno che permette l'eseme ecografico è la riflessione. La riflessione comporta il formarsi di echi, cioè di segnali che ritornano verso il trasduttore che è in grado di rilevarli generando una serie di segnali elettrici che vengono "letti" dall'apparecchio ecografico e utilizzati per formare le immagini. Con la sonda posta a 90°(perpendicolare alla struttura da esaminare)si ottimizza la trasmissione in profondita' del fascio di ultrasuoni .L'assorbimento e la diffusione non concorrono alla formazione dell'immagine ecografica e comportano soltanto un assorbimento di energia meccanica nella struttura interessata. La rifrazione,cioè la deviazione del fascio di ultrasuoni dal suo percorso originario puo' determinare la comparsa di artefatti nelle immagini ecografiche. Parte del fascio ultrasonoro oltre che riflesso puo' essere assorbito. L'assorbimento consiste nella trasformazione dell'energia ultrasonora in calore e dipende dalla frequenza dell'ultrasuono e dalle caratteristiche del mezzo attraversato.In particolare esoo è proporzionale alla frequenza, cioè è maggiore per frequenze piu' elevate. L'assorbimento si misura in decibel/cm ed è proporzionale alla impedenza. Una regola pratica per stimare l'assorbimento è: Assorbimento=1 decibel/cm/MHz
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(nel caso dell'ecografia si deve considerare la doppia distanza sonda-tessuto-sonda). L'effetto finale è che gli echi di ritorno hanno un'ampiezza da 20 a 1.000.000 di volte inferiori dell'onda di partenza. Echi provenienti da profondita' maggiori sono proporzionalmente piu' debolo. L'apparecchio ecografico ha la possibilita' di "amplificare"i segnali in rapporto al loro ritardo e quindi alla profondita' di provenienza, in modo da ottimizzare la presentazione dell'immagine ecografica.(Gli echi òprovenienti da strutture lontane devono essere amplificati in misura proporzionalmente maggiore). Ultrasuoni afrequenze piu' elevate(7-15MHz)hanno un maggiore assorbimento negli strati superficiali e quindi una minore penetrazione in profondita'.Pertanto,per esaminare strutture superficiali (es :occhio, ghiandole salivari, tiroide, tendini, muscoli, testicoli...) si devono utilizzare sonde ad alta frequenza che danno anche un' elevata risoluzione spaziale(la risoluzione spaziale degli ultrasuoni è in funzione della frequenza). Per esaminare parti del corpo a profondita'maggiori (es: contenuto addominale) si usano sonde a frequenza minore (1-7MHz). La scelta della sonda deve tenere conto delle dimensioni del soggetto da esaminare :in soggetti di taglia maggiore si devono utilizzare frequenze proporzionalmente decrescenti. Sono descritti in ecografia tre schemi di rappresentazione del segnale ecografico:
-A-MODE: (Modulazione di ampiezza) il modo piu' semplice di rappresentare il segnale ecografico,l'energia ultrasonica riflessa viene evidenziata sottoforma di picchi di ampiezza proporzionale alla riflessione (oscilloscopio).
-B-MODE:La classica immagine ecografica,ovvero la rappresentazione su un monitor televisivo degli echi provenienti da una sezione del corpoattraversata dal fascio di ultrasuoni. Ogni eco è rappresentato come un punto luminoso la cui tonalita'è direttamente proporzionale all'intensita' dell'eco stesso. Sullo schermo compare l'immagine dell'organo in esame.
-TM-MODE: Questo tipo di tracciato è molto diffuso in cardiologia è simile all'A-MODE con la differenza che viene tracciato anche il movimento dell'eco. Questo consente di riportare su diagrammi la dinamica di strutture in rapido movimento.
Pag. 28 a 57 I Tasduttori
I trasduttori o sonde,che contengono il cristallo o una serie di cristalli,sono la parte piu' delicata e costosa dell'apparecchio ecografico e vanno trattati con cura evitando urti.I trsduttori possono essere danneggiati anche dal calore infatti al di sopra di una temperatura critica(temperatura di Curie,generalmente nell'ordine di alcune centinaia di gradi)il cristallo perde le proprieta'piezoelettriche.Elementi tecnici che caratterizzano la qualita' del cristallo sono il tempo di decadimento della vibrazione indotta dalla differenza di potenziale(ring down-time)e il fattore Q,la purezza della frequenza di emissione. Ogni cristallo piezoelettrico ha,in rapporto alle sue caratteristiche strutturali una determinata frequenza di emissione(frequenza di risonanza) che è proporzionale allo spessore della ceramica(es:un cristallo di spessore di 1mm emette ultrasuoni a 2MHz,uno di 0'5mm dello stesso materiale li emette a 4MHz). All'aumentare della frequenza diminuisce lo spessore del cristallo. Un cristallo sottile è piu' difficile da costruire,per cui lo sonde ad alta frequenza con cristalli sottili costano proporzionalmente di piu'.Si distinguono per caratteristiche costruttive diversi tipi di trasduttori:
-Settoriale meccanico: dotato di un singolo cristallo oscillante (economico)
-Settoriale anulare: caratterizzato da piu'anelli concentrici oscillanti meccanicamente; puo' focalizzare a piu' livelli e il fascio ultrasonoro è circolare -Settoriale elettronico (phased array): dotato di un gruppo di elementi che vengono eccitati in sequenza e creano immagini "settoriali", questo sistema consente di avere focalizzazione a multipli livelli, e d ha un costo relativamente elevato e non ha parti in movimento
-Array settoriale: in questo trasduttore gli elementi non sono sullo stesso piano ma sono disposti su una superficie a curvatura stretta, questo tipo di trasduttore è maneggevole ed ha un fascio divergente (non ha parti in movimento)
-Lineare: costituito da una serie di elementi disposti linearmente, in genere ha dimensioni elevate (utile per lo studio di tendini, legamenti.,) e fornisce immagini rettangolari
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-Convex:costituioto da una serie di cristalli posti su un piano curvo,che producono un'immagine di tronco di cono.
I sistemi di scansione sono definiti in base al tipo di immagine,che,a sua volta,dipende dal tipo di sonda. La scansione lineare produce immagini rettangolari.Essa utilizza trasduttori lineari (5-6 elementi di 64-200 cristalli eccitati in maniera sequenziale). La scansione settoriale produce immagini settoriali. Essa utilizza trasduttori meccanici a singolo cristallo o settoriali elettronici (phased array) dove vengono eccitati con opportuni ritardi gli elementi che compongono il trasduttore. Esistono infine sonde convesse che funzionano come quelle lineari, ma per la loro forma convessa producono immagini a tronco di cono. Nell'imaging ecografico attuale prevale largamente la rappresentazione in modalita' "real time", possibile soltanto con trasduttori a scansione elettronica,in cui l'apparecchio è in grado di formare rapidamente una serie di immagini tali da creare un effetto "movie" (cinematografico), e quindi di poter seguire in diretta il movimento delle strutture corporee.
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CAPITOLO 5
PARTE SPERIMENTALE
SCOPO DEL LAVORO
Lo scopo di questa Tesi è stato esaminare,tramite Ecografia, l'estensione e le caratteristiche del Mastocitoma Cutaneo canino,con l'obbiettivo di valutare possibili informazioni utili ai margini di Escissione Chirurgici, valutando se l'indagine ecografica è utile ai fini della chirurgia
MATERIALI E METODI
Questo lavoro comprende 12 pazienti di uno studio retrospettivo che presentavano un Mastocitoma cutaneo localizzato in un zona del corpo valuatabile con l'Ecografia:11 casi tra il Giugno del 2015 e il Settembre 2016,1 caso del Maggio 2017,e invece da me valutati 3 casi nell'anno 2019, riferiti all'Ospedale Didattico "Mario Modenato"di Pisa. I cani erano di entrambi i sessi di eta' compresa tra 3 mesi e 13 anni. Ciascun paziente è stato valutato con esame clinico comprendente: Segnalamento, Anamnesi, Esame Obbiettivo Generale e Particolare.
Ogni Mastocitoma è stato diagnosticato con Citologia di campioni ottenuti da Ago Aspirato e relativa Stadiazione tramite Ecografia addominale e Ago Aspirato dei Linfonodi drenanti. Prima dell'intervento chirurgico è stata eseguita la visita Anestesiologica con prelievo di un campione di sangue venoso per valutare:Emocromo, Profilo Coagulativo e Profilo Biochimico di Base (Proteine Totali, Albumine, Globuline, Enzimi (GGT e ALT), Metaboliti (Urea, Creatinina, Colesterolo totale, Glucosio)).
IL giorno della Chirurgia ogni paziente ha seguito un Iter comprendente varie fasi:
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EV), Metadone (0,3mg/Kg EV o IM), Dexmedetomidina (1-8μg/Kg EV o IM). Somministrati anche: Ranitidina (2mg/Kg SC), Omeprazolo (1mg/Kg EV),e un antibiotico tra Cefazolina(22mg/Kg EV o SC) e Amoxicillina+Acido Clavulanico (12,5mg/Kg SC).
-Induzione dell'anestesia:Propofol (3mg/Kg EV) in alcuni casi associato con Ketamina (1mg/Kg EV)e Diazepan (0,2mg/Kg EV).
-Ecografia:
Per ogni Mastocitoma sono state valutate:
-Dimensioni identificando i margini ecografici con Clip Metalliche e in base a queste è stato confrontato il limite ecografico della neoplasia con quello reperito durante la visita,
-Forma,
-Eventuale Invasivita',
-Ecotessitura(Omogenea o Eterogenea), -Ecotessitura.
Tutte le Ecografie sono state eseguite dallo stesso Operatore con il medesimo apparecchio ecografico con sonda ad alta frequenza.
-Intubazione Endotracheale e mantenuto con Isofluorano(1%-2,5%)
-Somministrazione di Corticosteroide tra Metilprednisolone (1mg/Kg EV) e Desametasone (0,15mg/Kg EV)
-Tricotomia della zona cutanea interessata dal Mastocitoma mantenendoci molto ampi.
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-Preparazione del campo operatorio con 3 passaggi alternati di Alcool e Iodopovidone
-Chirurgia: Drapeggio del campo chirurgico,incisione ellittica della Neoplasia mantenendoci a 2 cm dalla Clip metallica. L'incisione ha compreso cute, sottocute e fascia del muscolo o dei muscoli sottostanti seguita da scollamento dei piani tissutali tramite forbici da dissezione effettuando l'emostasi con Elettrobisturi Bipolare. Dopo l'Exeresi del Mastocitoma la sintesi della fascia muscolare e del sottocute è stata effettuata con una sutura continua semplice utilizzando filo monofilamento riassorbibile,la cute invece tramite punti staccati semplici con filo monofilamento non riassorbibile o tramite Clip metalliche.
-Campione: Ogni campione è stato immerso in formalina, processato e dopo colorazione con ematossilina-eosina,sottoposto a esame Istopatologico. Per ogni Mastocitoma sono stati valutati anche i margini chirurgici classificandoli come liberi o infiltrati di mastociti e vi è stato assegnato il Grado di Kupiel. Per ogni campione, prima di essere inviato al laboratorio di Istologia è stata compilata una scheda per esame istopatologico
-Post-Operatorio: Nel post-operatorio ogni paziente è stato trattato con:
• Antibiotico ad ampio spettro(Amoxicillina-Acido clavulanico 12,5mg/kg BID per OS per 7 giorni)
• Gastroprotettore (Omeprazolo 1mg/kg SID per 7 giorni) • FANS (Carprofen 2mg/kg SID per 5 giorni)
• Antistaminico (Clorfenamina maleato 0,5mg/kg BID per OS)
• In tre pazienti è stato somministrato un anticoagulante per evitare trombosi venosa (Eparina 50UI/kg per 7 gioni SC)
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Cane nº Razza Età
(anni)
Sesso Loc. MCT Prec. MC
1 Meticcio 8 F Labbro vulvare sx No
2 Cocker Sp. 9 M Punta prepuzio No
3 Meticcio 12 F Ipocondrio dx Si (coscia sx)
4 Golden R. 6 F Coscia dx No
5 Carlino 11 M Collo sx Si (collo sx)
6 Shitz Tzu 9 FS Cavo popliteo dx No
7 Bulldog Fr 0.25 M Sfintere anale No
8 Boxer 4 F Base orecchio dx Si
(regione cervicale) 9 Meticcio 10 FS Mammelle addom.caud.sx Si (zampa dx)
10 Golden R. 5 MC Addome cran. No
11 Golden R. 8 M Cavo polpiteo dx No
12 Golden R. 9 FS labbro vulvare dx No
13 Meticcio 10 F Piatto coscia dx No
14 Pincher 9 FS Base coda No
15 Bolognes. 3 MC Dorso No
Tab.1: Segnalamento e Anamnesi dei pazienti, localizzazione MCT, precedenti MCT
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Dimensioni Cliniche Dimensioni Ecografiche
Cane nº L(mm) W(mm) D(mm) L(mm) W(mm) D(mm) 1 20 15 10 20 13 13 2 10 10 5 22 13 6 3 13 18 2 14 19 4 4 20 10 5 19 10 4 5 60 30 10 58 33 12 6 15 10 3 16 13 5 7 15 12 3 15 12 6 8 10 10 2 10 9 4 9 5 5 2 6 8 2 10 10 10 1 20 16 2 11 15 15 3 17 15 5 12 15 10 12 15 11 11 13 60 30 8 57 28 9 14 20 15 8 21,4 16 10,1 15 7 4 5 7,3 5 5,2
Tab2: Dimensioni cliniche ed ecografice di ogni MCT in mm (L: lunghezza, W: larghezza, D: spessore)
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Cane n° Forma Margini Ecotessit Ecogenic
1 Ovale Definiti Lisci Omogen. Ipoecog. 2 Irregolare Non Definiti Irregolari Eterogen. Mista
3 Irregolare Non Definiti Irregolari Omogen. Ipoecog. 4 Irregolare Definiti lisci Eterogen. Ipoecog.
5 Ovale Non Definiti Irregolari Omogen. Ipoecog. 6 Ovale Non Definiti Irregolari Omogen. Ipoecog. 7 Ovale Defini Lisci Omogen. Ipoecog.
8 Ovale Definiti Lisci Omogen. Ipoecog. 9 Ovale Non Definiti Irregolari Omogen. Ipoecog.
10 Ovale Non Definiti Irregolari Eterogen. Ipoecog. 11 Ovale Non Definiti Irregolari Omogen Ipoecog.
12 Irregolare Definiti lisci Omogen. Ipoecog. 13 Ovale Definiti lisci Omofen. Ipoecog.
14 Ovale Definiti lisci Eterogen. Ipoecog. 15 Fuso Non definiti Irregolari Omogen. Ipoecog.
Tab3:caratteristiche ecografiche di ogni MCT
In questo studio sono stati esaminati 15 cani con Mastocitoma cutaneo diagnosticato tramite citologia da ago aspirato. Il range di eta' e' da 3 mesi a 12 anni con eta' media di circa 8 anni.
Le razze sono: Meticcio, Golden Retriver, Cocker Spaniel, Carlino, Bulldog Francese, Boxer, Shih Tzu, Pincher, Bolognese.
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popliteo(2), coscia(2), sfintere anale(1), orecchio(1), addome(3), dorso(1), base della coda (1).
Dai dati della tabella numero 2 possiamo rilevare che in 3 casi su 15 (20%) le Dimensioni Ecografiche sono maggiori di quelle Cliniche (dimensioni ecografiche maggiori di 1cm rispetto alle cliniche).
Dai dati della tabella numero 3 possimo rilevare le seguenti informazioni riguardo le caratteristiche ecografiche di ogni Mastocitoma:
Forma • 66,6% Ovale • 26,6% Irregolare • 6,6% Fuso Margini • 46.6% Definiti • 53.3% Non Definiti • 46.6% Lisci • 53,3% Irregolari Ecotessitura • 73,3% Omogenea • 26,6% Eterogenea Ecogenicita' • 93,3% Ipoecogeno • 6,6% Misto
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Ogni Mastocitoma è stato infine sottoposto all'esame Istopatologico per la diagnosi definitiva assegnando ad ognuno il grado di Kiupel e valutando anche i margini di escissione se liberi o infiltrati di mastociti ottenendo il seguente risultato:
▪ 10 MCT di Grado 1 di Kiupel ▪ 3 MCT di Grado 2 di Kiupel ▪ 2 MCT No Grado
Tutti i margini di escissione sono stati definiti liberi da Mastociti.
Pag. 38 a 57 ECOGRAFIA
Fig:1
Fig:2
Figure 1 e 2: Ecografie di un Mastocitoma cutaneo in un cane di razza Bolognese.Dimensioni:5,2x7,3mm.
Pag. 39 a 57 CHIRURGIA
Fig:1
Pag. 40 a 57 Fig:3
Pag. 41 a 57 Fig:5
Pag. 42 a 57 Fig:6
Figure: 1,2,3,4: Chirurgia di un Mastocitoma cutaneo in un cane di razza Pincher. Esperienza didattica presso l'Ospedale Didattico Veterinario "Mario Modenato "Pisa.
Figura:5: Scheda per l'invio dei campioni per l'Esame Istopatologico.
Figura:6: Barattolo con Formalina dove è stato immerso il Mastocitoma cutaneo per inviarlo al Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Universita'Veterinaria di Pisa in attesa dell'esame Istopatologico.
Pag. 43 a 57 DISCUSSIONI
In questo lavoro sono stati studiati 15 Mastocitomi Cutanei Canini con Ecografia e Istopatologia con lo scopo di valutare i margini di escissione.Tramite l'Ecografia sono state determinate la forma, i margini, l'ecotessitura, l'ecogenita' e le dimensioni indicando i margini ecografici con Clip metalliche.
In 3 casi su 15 (20%) le dimensionie ecografiche sono risultate maggiori (di piu'di 1cm) rispetto alle dimensioni cliniche.Ogni mastocitoma è stato asportato chirurgicamente mantenendoci a 2cm minimo dalle Clip metalliche scollando cute e sottocute e un piano fasciale sottostante la neoplasia. Ogni neoplasia è stata poi immersa in un barattolo con formalina in attesa dell'esame istopatologico. Il patologo ha esaminato ogni Mastocitoma evidenziandone le caratteristiche cellulari e assegnando a ognuno il Grado di Kiupel. 10 MCT sono stato classificati di Grado 1 di Kiupel, 3 di Grado 2 e a 2 non è stato assegnato nessun grado.
All'esame istopatologico sono stati valutati anche i margini di escissione indicando se liberi o infiltrati di mastociti.Tutti i margini in questo studio sono stati considerati liberi.
Pag. 44 a 57 CONCLUSIONI
Anche se il campione è esiguo si puo' comunque affermare che l'ecografia è risultata utile per identificare i margini e la profondita' di ogni neoplasia per poi adeguare i margini di escissione idonei confermati all'esame istopatologico dove sono stati dichiarari liberi da mastociti e la tecnica chirurgica; quest'ultimo aspetto è legato al fatto che nell'asportazione di 4 Mastocitomi è stata eseguita una plastica cutanea con lembi di rotazione perchè i margini non erano facilmente raffrontabili per localizzazione anatomica della neoplasia o per forma e dimensione del mastocitoma stesso. Tenendo presente che lo studio piu' recente risale al 2006 di Nymal et al.e al 2009 di Loh et al., si possono attribuire i risultati discordanti con la letteratura, soprattuto legati alla forma prevalentemente ovale (66,6%) e ai margini non definiti e irregolari (53,3%) dovuti al fatto che l'ecografia è una tecnica in continua evoluzione sia nelle sonde che nel software portando quindi a un miglioramento dello studio delle neoplasie cutanee e sottocutanee e strumento di ausilio per guidare il chirurgo.
Anche se la TAC si sia dimostrata piu' efficace nell'individuare un aumento dei margini locali della neoplasia (studio condotto da Hahn,Lantz,Salisbury,Blevins,Widmer nel 1990) in questo studio è stata scelta l'Ecografia perche' è una tecnica di Diagnostica per Immagini rapida (perche' si puo' eseguire nell'immediato pre-operatorio) non invasiva, facile da eseguire e dal costo contenuto.
I limite di questo lavoro è la dimensione del campione,con numero esiguo di casi valutati. Sarebbe stato interessante confrontare i parametri rilevati all'ecografia dei MCT eseguita nell'immediato pre-operatorio con quelli rilevati a un eventuale TAC eseguita sulle stesse neoplasie 3-4 settimane prima.
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RINGRAZIAMENTI
AD ANDREA CECCARELLI, SCOMPARSO IL 27/01/07 PERCHE' ERA AMICO, FRATELLO, AMORE
A MIA NONNA ANGELA PERCHE' E' STATA LA SORGENTE DEI MIEI VALORI
AI MIEI NIPOTI MIRIAM E VITTORIO PERCHE' HANNO DATO SENSO ALLA MIA VITA
ALLA FAMIGLIA RIVIERI-MAGNI PERCHE' MI HA FATTO CAPIRE CHE ESISTONO LEGAMI FORTI SVINCOLATI DALLA GENETICA E DALLA
BIOLOGIA, MA SOPRATTUTTO A TE DANIELA RIVIERI, CONOSCIUTA IN UN PERIODO NEGATIVO CHE HA TRASFORMATO PARADOSSALMENTE IN POSITIVO GLI EVENTI AVVENIRE
A MIA SORELLA E MIO FRATELLO, SARA E PIETRO
A DANIEL MAGNI PERCHE'....ESISTI...
ALLA FAMIGLIA CECCARELLI: ANELIDE, GIULIANO, PAOLO,
FRANCESCA,TOMMY, MARGY, PERCHE' SEMPLICEMENTE VI AMO
ALLA DOTTORESSA BUSTI MARIACARLA E AL DOTTOR MASSIMO
PAOLICCHI PER AVERMI REGALATO LA LORO FIDUCIA E IL LORO SAPERE
AL PROFESSOR IACOPO VANNOZZI PER AVERMI SUPPORTATO E INSEGNATO UN ARTE, LA CHIRURGIA
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AL DOTTOR ALESSIO PIERINI PER AVERMI INCORAGGIATA IN QUESTO LAVORO DI TESI
A TUTTI I MIEI PROFESSORI CHE MI HANNO FORMATO DURANTE GLI ANNI ACCADEMICI
AL MIO AVVOCATO CLAUDIA VOLPI CHE DIFENDE LEGALMENTE I MIEI IDEALI
A TUTTI QUELLI CHE HANNO CREDUTO IN ME
A TUTTI QUELLI CHE NON HANNO CREDUTO IN ME, PERCHE' MI HANNO DATO LA FORZA E LA DETERMINAZIONE PER POTERGLI DIMOSTRARE CHE SI SBAGLIAVANO, CHE VALGO MOLTO PIU' DELLA LORO
CATTIVERIA, CHE SONO E RIMARRANO SEMPRE E SOLO LORO I FALLITI DELLA FAVOLA
