UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea Specialistica in Biologia Marina
CRESCITA E TOSSICITA’
DI DUE CEPPI DI
OSTREOPSIS OVATA
(DINOPHYCEAE)
RELATORI:
CANDIDATO:
Prof. Luciano Galleschi
Andrea Feller
Prof.ssa Rossella Pistocchi
CONCLUSIONI ... 5 BIBLIOGRAFIA ... 11
L’analisi molecolare ha permesso di convalidare l’identificazione morfologica di Ostreopsis ovata. Inoltre sono stati caratterizzati due ceppi italiani con diversa provenienza geografica ed è stato possibile ottenere, per entrambi, le sequenze dei domini D1-D2-D3 del gene 28S rDNA. La sequenza del dominio D3 è stata ottenuta per la prima volta per la specie in esame ed è in corso di pubblicazione in GenBank. I risultati hanno mostrato che i due ceppi italiani sono filogeneticamente omologhi, ma presentano una minima variabilità nucleotidica che permette di distinguerli molecolarmente aprendo la possibilità di sviluppi futuri quali la costruzione di sonde specie-specifiche ed intraspecifiche. Risulta auspicabile approfondire le indagini sugli stessi ceppi anche con la caratterizzazione del tratto ITS1-5,8S-ITS2 per confrontare i dati con quelli disponibili in bibliografia e ampliare le conoscenze sulla variabilità nucleotidica osservata. Le analisi filogenetiche confermano quanto noto in bibliografia e suggeriscono l’idea di analizzare più ceppi con diversa provenienza per valutare eventuali differenziamenti genetici all’interno del genere e anche della specie.
Per quanto riguarda la caratterizzazione della crescita, la valutazione è stata complicata dalla presenza nelle colture in fase stazionaria di aggregati mucillaginosi, che non permettono di effettuare subcampionamenti omogenei, condizione fondamentale per una buona stima del numero cellulare. Il problema è stato in parte ovviato applicando un’acidificazione blanda che ha determinato il dissolvimento degli aggregati. Con questo metodo di conteggio si è potuto stabilire che il ceppo di O. ovata di Ancona presenta un tasso di crescita più alto con il raggiungimento di un numero di cellule finale più elevato rispetto al ceppo di Latina (107 cellule per litro). Per quanto riguarda la valutazione della tossicità, i risultati ottenuti effettuando il test con Artemia sp. hanno permesso di capire che l’alga determina la morte dei nauplii del crostaceo e che il biosaggio è molto utile per evidenziare la tossicità delle alghe anche in presenza di numeri di cellule molto bassi. Tuttavia, i tempi di esposizione previsti dal metodo (24 ore) non permettono di apprezzare differenze, in termini di EC50, nelle diverse condizioni saggiate. Non è stato pertanto possibile evidenziare le differenze di tossicità, messe in evidenza con le analisi chimiche, sia fra i due ceppi algali che nelle due diverse fasi di crescita; tale saggio non consente inoltre di discriminare quale tossina (palitossina putativa e/o ovatossina-a) sia responsabile dei livelli di tossicità registrati. Per quanto riguarda l’effetto sulle artemie dei soli mezzi di coltura, pur mostrando un’ampia variabilità, i risultati evidenziano un rilascio di
tossine all’esterno da parte delle cellule, rilascio che aumenta con l’invecchiamento della coltura, come confermato dai risultati delle analisi chimiche.
Anche il test di emolisi ha messo in evidenza un marcato effetto emolitico da parte delle alghe, con valori di EC50 intorno ai 67 ng di tossina/ml di saggio. Al contrario di quanto riportato in letteratura per la palitossina, l’emolisi non è stata inibita completamente dall’ouabaina. Questo risultato potrebbe essere spiegato dalla predominanza dell’ovatossina-a, che presenta una composizione chimica diversa dalla palitossina e che potrebbe avere un sito di azione differente dalla pompa Na,K-ATPasi. La percentuale di emolisi inibita dalla ouabaina potrebbe invece essere dovuta alla presenza, seppur minore, di palitossina putativa
.
L’analisi chimica delle tossine mostra che in entrambi i ceppi sono presenti due molecole principali: una tossina indicata come palitossina putativa e un nuovo analogo chiamato ovatossina-a; quest’ultimo presente in quantità prevalente, pari al 94-96% delle tossine totali. La determinazione quantitativa per cellula ha mostrato che il ceppo di O. ovata di Ancona produce una quantità maggiore di tossine, sia rispetto al ceppo di O. ovata di Latina che a quello isolato a Genova nell’estate 2006. Le tossine sono prodotte in maggiore quantità in fase stazionaria rispetto alla fase esponenziale e durante questa fase viene evidenziato anche un rilascio maggiore di tossine nel mezzo di coltura. Questi dati indicano che anche nell’ambiente la fase finale di una fioritura di O. ovata può costituire un pericolo maggiore di intossicazione e un maggiore passaggio di tossine nell’aerosol.
Infine poiché le differenze morfometriche hanno messo in evidenza che il ceppo di O. ovata di Ancona presenta un volume cellulare di circa il doppio rispetto il ceppo di O. ovata di Latina, rapportando il contenuto di tossine per cellula sull’unità di biovolume, emerge che le cellule di Latina hanno una capacità di accumulo e di produzione, per entrambe le molecole, di circa il 20% maggiore rispetto a quelle di Ancona.
Per concludere il ceppo di Ostreopsis ovata di Ancona potrebbe essere impiegato preferenzialmente rispetto a quello di Latina nell’allestimento di colture in laboratorio, perché presenta un tasso di crescita maggiore, un raggiungimento di valori cellulari piuttosto elevati (107 cellule/litro) e una produzione maggiore di tossine per litro. In questo modo possono essere ottenute grandi quantità di ovatossina-a e di palitossina putativa, che potranno essere isolate e purificate.
L’utilizzo di tali sostanze purificate consentirà di chiarire a quale delle due molecole devono essere attribuiti gli effetti da noi osservati nel saggio con Artemia sp. e in quello di emolisi.
Ade P., Funari E., Poletti R. (2003) – Il rischio sanitario associato alle tossine di alghe marine. Ann. Ist. Super. Sanità. 39(1): 53-68.
Adl S. M., Simpson A. G. B., Farmer M. A., Andersen R. A., Anderson O. R., Barta J. R., Bowser S. S., Brugerolle G., Fensome R. A., Frederico S., James T. Y., Karpov S., Kugrens P., Krug J., Lane C. E., Lewis L. A., Lodge J., Lynn D. H., Mann D. G., Mccourt R. M., Mendoza L., Moestrup Ø., Mozley-Standridge S. E., Nerad T. A., Shearer C. A., Smirnov A. V., Spiegel A. W., Taylor M. F. (2005) – The New Higher Level Classification of Eukaryotes with Emphasis on the Taxonomy of Protists. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 52 (5): 399-451.
Aligizaki K., Nikoladaidis G. (2006) – The presence of the potential toxic genera Ostreopsis and Coolia (Dinophyceae) in the North Aegean Sea, Greece. Harmful Algae. 5: 717-730.
Bianco I., Congestri R., Sangiorgi V., Albertano P., Zaottini E. (2006) – Fioriture di microalghe potenzialmente tossiche lungo le coste laziali. Biol. Mar. Medit. 13(1): 947-950.
Bianco I., Sangiorgi V., Penna A., Guerrini F., Pistocchi R., Zaottini E., Congestri R. Ostreopsis ovata in benthic aggregates along the Latium coast (middle Tyrrhenian Sea). International Symposium on Algal Toxins, Trieste 27-29 Maggio 2007.
Bignami G. S. (1993) – A rapid and sensitive haemolysis neutralization assay for palytoxin. Toxicon. 31(6): 817-820.
Boni L., Guerrini F., Pistocchi R., Cangini M., Pompei M., Cucchiari E., Romagnoli T., Totti C. (2005) – Microalghe tossiche del Medio e Alto Adriatico. Guida per acquacoltori e operatori sanitari. Casa editrice Fernandel - Ravenna.
Brescianini C., Grillo C., Melchiorre N., Bertolotto R., Ferrari A., Vivaldi B., Icardi G., Gramaccioni N., Funari E., Scardala S. (2006) – Ostreopsis ovata algal blooms affecting human health in Genova, Italy, 2005 and 2006. Eurosurveillance. 11(9): 060907.
Carmen Louzao M., Ares I. R., Vieytes M. R., Valverde I., Vieites J. M., Yasumoto T., Botana L. M. (2007) – The cytoskeleton, a structure that is susceptible to the toxic mechanism activated by palytoxins in human excitable cells. FEBS Journal. 274: 1991-2004.
Ciminiello P., Dell’Aversano C., Fattorusso E., Forino M., Silvana Magno G., Tartaglione L., Grillo C., Melchiorre N. (2006) – The Genoa 2007 outbreak. Determination of putative palytoxin in Mediterranean Ostreopsis ovata by a new liquid chromatography tandem mass spectrometry method. Anal. Chem. 78: 6153-6159.
Ciminiello P., Dell’Aversano C., Fattorusso E., Forino M., Tartaglione L., Grillo C., Melchiorre N. (2008) – Putative palytoxin and its new analogue, Ovatoxin-a, in Ostreopsis ovata, collected along the ligurian coasts during the 2006 toxic outbreak. J Am Soc Mass Spectrom. 19: 111–120.
Faust M. A., Morton S. L. (1995) – Morphology and ecology of marine dinoflagellate Ostreopsis labens sp. nov. (Dinophyceae). J. Phycol.. 31: 456-463.
Faust M. A., Morton S. L., Quod J. P. (1996) – Further SEM study of marine dinoflagellates: the genus Ostreopsis (Dinophyceae). J. Phycol.. 32: 1053-1065.
Faust M. A. (1998) – Mixotrophy in tropical benthic dinoflagellates. In Harmful Algae. (eds.) Reguera B., Blanco J.,Fernandez M. L.,Watt T. Xunta de Galicia and IOC Commission of UNESCO, Paris, France. 390-393.
Fukuyo Y. (1981) – Taxonomic study on benthic dinoflagellates collected in coral reef. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 47: 967-978.
Gangemi E., Giacobbe M. G., Fraga S. (2006) – Il complesso delle specie ciguateriche nelle lagune di Capo Peloro (Messina, Sicilia). Biol. Mar. Medit. 13(1): 979-983.
Garcia Camacho F., Gallardo Rodriguez J., Sanchez Miron A., Ceron Garcia M. C., Belarbi E. H., Chisti Y., Molina Grima E. (2007) – Biotechnological significance of toxic marine dinoflagellates. Biotechnology advances. 25: 176-194.
Gallitelli M., Ungano N., Addante L. M., Gentiloni Silver N., Sabbà C. (2005) – Respiratory illness as a reaction to tropical algal blooms occurring in a temperate climate. JAMA. 293(21).
Gleibs S., Mebs D., Werding B. (1995) – Studies on the origin and distribution of palytoxin in a Carribbean coral reef. Toxicon. 33(11): 1531-1537.
Grillo C., Melchiorre N. (2007) – Ostreopsis ovata in Liguria: esperienze di monitoraggio. Corso ARPA-APAT sulle alghe tossiche, CRM, Cesenatico, 15-17/05/07.
Guillard R. R. L. (1975) – Culture of marine invertebrate animals. 26-60.
Heil C. A., Maranda L., Shimuzu Y. (1993) – Mucus-associated dinoflagellates: large scale culturing and estimation of growth rate. Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea. 501-506.
IRSA–CNR, Saggio di tossicità acuta con Artemia sp. (Metodo per la determinazione di effetti tossici acuti con Artemia sp.) (2003) – Metodi analitici per le acque, APAT Manuale e Linee Guida. 29(3): 1043-1050.
Ismael A. A., Halim Y. (2006) – First record of Ostreopsis spp. In Egyptian waters with a description of O. mediterraneus n. sp. International society for the study of harmful algae. 12th International Conference on Harmful Algae, Copenhagen, Denmark, 4-8 September 2006.
Lenoir S., Ten-Hage L., Turquet J., Quod J. P., Bernard C., Hennion M. C. (2004) – First evidence of palytoxin analogues from an Ostreopsis mascarenensis (Dinophyceae) benthic blooms in southwestern Indian Ocean. J. Phycol. 40: 1042-1051.
Lewis R. J. (2001) – The changing face of ciguatera. Toxicon. 39: 97-106.
Malagoli D. (2007) – A full-length protocol to test haemolytic activity of palytoxin on human erythrocytes. ISJ. 4: 92-94.
Mattei D., Bruno M. (2005) – Fioriture tossiche marine: nuovi sistemi di controllo e ipotesi di gestione. Rapporti ISTISAN. 05(29): 74-81.
Maso M., Garces E., Pages F., Camp J. (2003) – Drifting plastic debris as a potential vector for dispersing Harmful Algal Bloom (HAB) species. Scientia Marina. 67(1): 107-111.
Moestrup Ø., Daugbjerg N. (2007) – On dinoflagellates phylogeny and classification. In Brodie J., Lewis J. (EDS), Unravelling the algae. The past, the present, and the future of algal systematics. CRC Press (Boca Raton). 215-230.
Monti M., Minocci M., Beran A., Ivesa L. (2007) – First record of Ostreopsis cfr. Ovata on macroalgae in the Northern Adriatic Sea. Marine Pollution Bulletin. 54: 598-601.
Norris D. R., Bomber J. W., Balech E. (1985) – Benthic dinoflagellates associated with ciguatera from the Florida Keys. I. Ostreopsis heptagona sp. nov. In Anderson D. M., White A. W., Baden D. G. [Eds] Toxic dinoflagellates. Elsevier Scientific, New York, 39-44.
Onuma Y., Satake M., Ukena T., Roux J., Chanteau S., Rasolofonirina N., Ratsimaloto M., Naoki H., Yasumoto T. (1999) – Identification of putative palytoxin as the cause of clupeotoxism. Toxicon. 37: 55-65.
Penna A., Vila M., Fraga S., Giacobbe M. G., Androni F., Riobò P., Vernesi C. (2005) – Characterization of Ostreopsis and Coolia (Dinophyceae) isolates in the western Mediterranean Sea based on morphology, toxicity and internal transcribed spacer 5,8S rDNA sequences. J. Phycol. 41: 212-225.
Penna A., Bertozzini E., Battocchi C., Galluzzi L., Giacobbe M. G., Vila M., Garces E., Luglie A., Magnani M. (2007) – Monitorino of HAB species in the Mediterranean Sea through molecular methods. Journal of Plankton Research. 29(1): 19-38.
Pin L. C., Teen L. P., Ahmad A., Usup G. (2001) – Genetic diversity of Ostreopsis ovata (Dinophyceae) from Malaysia. Mar. Biotechnol. 3: 246- 255.
Pistocchi R., Guerrini F., Balboni V., Boni L. (1997) – Copper toxicity and carbohydrate production in the microalgae Cylindrotheca fusiformis and Gymnodinium sp. Eur. J. Phycol. 32: 125-132.
Pistocchi R., Guerrini F., Feller A., Milandri A., Ceredi A., Poletti R. (2006) – Effetto della carenza di azoto e fosforo sulla produzione di tossine nalla Dinoflagellata Prorocentrum lima (Ehrenberg) Dodge, 1975. Biol. Mar. Medit. 13(1): 1039-1041
Poletti R., Milandri A, Pompei M. (2003) – Algal biotoxins of marine origin: new indication from the European Union. Veterinary research communication. 27, suppl 1: 173-182.
Poletti R. [1] (2007) – Lo stato delle conoscenze di alcune biotossine marine prodotte da microalghe bentoniche lungo le coste italiane. Corso ARPA-APAT sulle alghe tossiche, CRM, Cesenatico, 15-17/05/07.
Poletti R. [2] (2007) – Rischio associato alle alghe tossiche marine. Corso ARPA-APAT sulle alghe tossiche, CRM, Cesenatico, 15-17/05/07.
Quod J. P. (1994) – Ostreopsis mascarenensis sp. nov. (Dinophyceae), dinoflagellates toxiques associes a la ciguatera dans l’Ocean Indien. Rev. Cryptogamie Algologie. 15 : 243-251.
Randall J. E. (2005) – Review of clupeotoxism, an often fatal illness from the consumption of clupeoid fishes. Pacific Science. 59(1): 73-77.
Riobò P., Paz B., Franco J. M. (2006) – Analysis of palytoxin-like in Ostreopsis cultures y liquid chromatography with precolumn derivatization and fluorescence detection. Analytica Chimica Acta. 566: 217-223.
Saldarriaga J. F., Max Taylor F. J. R., Cavalier-Smith T., Mendez-Deuer S., Keeling P. J. (2004) – Molecular data and the evolutionary history of dinoflagellates. European journal of Protistology. 40: 85-111.
Sansoni G., Borghini B., Camici G., Casotti M., Righini P., Fustighi C. (2003) – Fioriture algali di Ostreopsis ovata (Gonyaulacales: Dinophyceae): un problema emergente. Biologia Ambientale. 17(1): 17-23.
Schmidt J. (1902) – Flora of Koh Chang. Contribution to the knowledge of the vegetation in the Gulf of Siam. Part IV. Peridiniales. J. Botanique. 23: 212-218.
Seminario Internazionale Ostreopsis: problema per il Mediterraneo? Genova. 5 dicembre 2005.
Simoni F., Gaddi A., Di Paolo C., Lepri L. (2003) – Harmfl epiphytic dinoflagellate on Tyrrhenian Sea reefs. Harmful Algae News. The intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO. 24.
Simoni F., Gori L., Di Paolo C., Lepri L., Mancino A. (2004) – Fioritura d’Ostreopsis ovata, Coolia monotis, Prorocentrum lima nelle macroalghe del Mar Tirreno Settentrionale, Mediterraneo (seconda fase di studio). Igiene dell’ambiente e del territorio. Biologi Italiani. 10.
Sun J., Liu D. (2003) – Geometric models for calculating cell biovolume and surface area for phytoplankton. Journal of plankton research. 25(11): 1331-1346.
Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) – MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24(8): 1596– 1599.
Taniyama S., Mahmud Y., Tanu M. B., Takatani T., Arakawa O.,Noguchi T. (2001) – Delayed haemolytic activity by the freshwater puffer Tetraodon sp. toxin. Toxicon. 39:725-727.
Taniyama S., Arakawa O., Terada M., Nishio S., Takatani T., Mahmud Y., Noguchi T. (2003) – Ostreopsis sp., a possible origin of palytoxin (PTX) in parrotfish Scarus ovifrons. Toxicon. 42: 29-33.
Tognetto L., Bellato S., Moro I., Andreoli C. (1995) – Occurrence of Ostreopsis ovata (Dinophyceae) in the Tyrrhenian Sea during Summer 1994. Botanica Marina. 8: 291-295.
Totti C., Cucchiari E., Romagnoli T. (2007) – Bloom of Ostreopsis ovata on the Conero Riviera (NW Adriatic Sea). Harmful Algae News. 33: 12-13.
Toyofuku H. (2006) – Joint FAO/WHO/IOC activities to provide scientific advice on marine biotoxins (research report). Marine Pollution Bulletin. 52: 1735-1745.
Tubaro A., Hungerford J. (2007) – Toxicology of marine toxins. Veterinary Toxicology. chap 60: 725-752.
Turki S. (2005) – Distribution of toxic dinoflagellates along the leaves of seagrass Posidonia oceanica and Cymodocea nodosa from the Gulf of Tunis. Cah. Biol. Mar. 46: 29-34.
Ukena T., Satake M., Usami M., Oshima Y., Naoki H., Fujita T., Kan Y., Yasumoto T. (2001) – Structure elucidation of Osteocin D, a palytoxin analog isolated from the dinoflagellate Ostreopis siamensis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65(11): 2585-2588.
Utermöhl H. (1981) – Neue Wege in der quantitativen erfassung des planktons. Int. Ver. Theor. Angew. Limnol. Verh. 5: 567-597.
Vale-Gonzales C., Pazos M. J., Alfonso A., Vieytes M. R., Botana L. M. (2007) – Study of the neuronal effect of ouabain and palytoxin and their binding to Na,K-ATPases using an optical biosensor. Toxicon. 50: 541-552.
Whittle K., Gallacher S. (2000) – Marine toxins. British Medical Bulletin. 56(1): 236-253.
Zingone A., Siano R., D’Alelio D., Sarno D. (2006) – Potentially toxic and harmful microalgae from coastal waters of the Campania region (Tyrrhenian Sea, Meditrranean Sea). Harmful Algae. 5: 321-337.
