UNIVERSITA’ DI PISA
DIPARTIMENTO DI MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE
Scuola di Specializzazione in
Endocrinologia e Malattie del Metabolismo
“Correlazione tra Linfociti T e B infiltranti i
tessuti orbitari e attività dell’Orbitopatia
Basedowiana (OB): possibile spiegazione per la
risposta dell’OB alle terapie immunosoppressive”
RELATORE Dr. Michele Marinò
CANDIDATO Dr.ssa Ilaria Ionni
INDICE
Riassunto
pag. 2
Introduzione
pag. 5
Razionale, scopo e disegno della tesi
pag. 10
Pazienti e metodi
pag. 12
Risultati
pag. 16
Discussione
pag. 20
Conclusioni pag. 25
Bibliografia
pag. 26
Legenda delle figure
pag. 30
Tabelle e Figure
pag. 32
RIASSUNTO
Benché siano state formulate varie ipotesi, la patogenesi dell’orbitopatia basedowiana (OB) è nota solo in parte. L’ipotesi più accreditata è che vi sia una reazione autoimmunitaria contro antigeni presenti sia nella tiroide che nei tessuti orbitari.
A differenza del Morbo di Basedow (MB), che è un classico esempio di autoimmunità umorale, causato da autoanticorpi stimolanti il recettore dell’ormone tireotropo (TSH), si ritiene che l’OB sia espressione di autoimmunità cellulo-mediata con i linfociti T come maggiori responsabili. Tuttavia è recentemente emerso un ruolo importante dei linfociti B come antigen presenting cells.
L’OB risponde in modo soddisfacente alla terapia immunosoppressiva quando è clinicamente attiva, ma poco quando inattiva. In altre malattie autoimmuni questo tipo di risposta riflette il numero dei linfociti che infiltrano l’organo bersaglio. Nel diabete mellito di tipo 1 sono stati individuati due fenotipi immunopatologici correlati con la diversa risposta alla terapia con un anticorpo monoclonale anti-CD20, ovvero il Rituximab. Il primo fenotipo, denominato “iperimmune”, è caratterizzato da un elevato numero di linfociti B CD20-positivi sia circolanti che infiltranti le insule pancreatiche, ed è associato ad una risposta più efficace al Rituximab; il
secondo fenotipo, denominato “pauci-immune”, è caratterizzato da uno scarso numero dei linfociti B CD20-positivi sia circolanti che infiltranti le isole pancreatiche, e si associa ad una risposta meno efficace al farmaco. Sulla base di tali rilievi, abbiamo ipotizzato che una simile eterogeneità immunopatologica possa esser presente anche nei tessuti orbitari dei pazienti con OB, spiegandone l’eterogeneità clinica e di risposta alla terapia immunosoppressiva.
Lo scopo della presente tesi era pertanto di valutare se esiste una correlazione tra le caratteristiche cliniche dell’OB e l’infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari. Venivano quindi raccolti i tessuti orbitari di 20 pazienti consecutivi con OB sottoposti a decompressione orbitaria. I campioni venivano sottoposti ad esame istologico e immunoistochimica per CD3 (marcatore dei linfociti T) e CD20 (marcatore dei linfociti B). Tutti i pazienti venivano sottoposti a valutazione oculistica.
Il numero totale dei linfociti infiltranti il tessuto orbitario, il numero dei linfociti CD3- e CD20-positivi non era correlato con età, sesso, precedente terapia dell’OB, funzione tiroidea, anticorpi anti-recettore del TSH (TRAb) e alcuni dei parametri oftalmologici, ovvero esoftalmometria, apertura palpebrale, diplopia e acuità visiva. Tuttavia era presente una correlazione diretta e statisticamente significativa, ottenuta mediante regressione lineare,
tra numero dei linfociti totali, numero dei linfociti CD3-positivi, numero dei linfociti CD20-positivi e Clinical Activity Score (CAS), una misura dell’attività dell’OB, a dimostrazione di un ruolo diretto sia dei linfociti T che B nella patogenesi dell’OB. Il risultato, inoltre, fornisce dei dati utili a spiegare la risposta favorevole ai trattamenti immunosoppressivi nei pazienti con OB attiva, ma non nei pazienti con OB non attiva.
INTRODUZIONE
L’orbitopatia basedowiana (OB) è la principale manifestazione extratiroidea delle tireopatie autoimmuni. L’OB è comunemente associata al Morbo di Basedow (MB), e raramente alla tiroidite cronica autoimmune [1]. Ancora più raramente l’OB si osserva in assenza di tireopatie clinicamente evidenti (Euthyroid Graves’ Orbitopathy) [1]. Tuttavia, anche in quest’ultima condizione, sono presenti quasi invariabilmente alterazioni tiroidee subcliniche, in particolare la positività degli autoanticorpi anti-tiroide [1].
Cenni sull’OB
Epidemiologia
L’OB ha un picco di incidenza tra i 30 e i 50 anni e colpisce con maggiore frequenza il sesso femminile, con un rapporto femmine/maschi di 3:1 [1, 2]. I sintomi e i segni clinici dell’OB sono presenti in circa il 30% dei pazienti con MB [3]. Nel 15% dei casi l’OB precede l’insorgenza dell’ipertiroidismo, mentre il 40% dei soggetti sviluppa l’OB contemporaneamente all’ipertiroidismo [4]. Il 45% dei soggetti che sono eutiroidei al momento della diagnosi di OB, sviluppa ipertiroidismo nei 18
mesi successivi [4]. Nella maggioranza dei casi l’OB è di grado lieve e non necessita di terapie maggiori [3]. Tuttavia, nel 2-5% dei casi il quadro clinico è rilevante per cui sono necessarie terapie di tipo medico, radiante o chirurgico [1].
Patogenesi
Nonostante gli sforzi di molti ricercatori, la patogenesi della OB non è ancora completamente nota, anche se la maggioranza degli autori concorda sul fatto che verosimilmente si tratti di una sindrome autoimmune [5]. Ciò è stato avvalorato da evidenze cliniche, istopatologiche e sierologiche, quali l’associazione con l’autoimmunità tiroidea, la presenza di una infiltrazione linfocitaria nei tessuti orbitari e la buona risposta ai trattamenti immunosoppressivi, specie con glucocorticoidi [5]. Recenti dati clinici, sia pur con alcune discrepanze, hanno dimostrato che il Rituximab, un anticorpo monoclonale che distrugge le cellule B, legandosi al cluster di differenziazione 20 (CD20) espresso sulla loro superficie, è efficace nei pazienti con OB [6]. I linfociti B CD20+ agirebbero nella patogenesi dell’OB come antigen presenting cells. [6]
La natura dell’antigene(i) responsabile(i) dell’OB ed alcuni dei meccanismi molecolari che conducono ai cambiamenti istologici dei tessuti
orbitari sono noti solo in parte [5]. L’ipotesi maggiormente accreditata prevede che antigeni espressi costitutivamente dalle cellule epiteliali della tiroide e dai tessuti orbitari siano il bersaglio del sistema immunitario [7]. Il principale antigene candidato è il recettore dell’ormone tireotropo (TSH) [5]. Recenti studi hanno inoltre suggerito un ruolo del recettore dell’Insulin-like growth factor-1, che formerebbe un complesso con il recettore del TSH [8].
Anatomia Patologica
Nell’OB si osserva un aumento del volume del tessuto connettivo retroorbitario e dei muscoli extraoculari per diverse ragioni, tra cui: 1) l’infiltrato infiammatorio in sede retroorbitaria da parte di cellule mononucleate, soprattutto linfociti T; 2) l’edema infiammatorio e la tumefazione dei muscoli extraoculari; 3) l’accumulo di componenti della matrice extracellulare, in particolare di glicosaminoglicani idrofili (GAG) come l’acido ialuronico e il condroitin solfato, prodotti dai fibroblasti orbitari; e 4) l’aumentato numero di adipociti (infiltrazione grassa). Nelle fasi tardive della malattia è in genere presente fibrosi.
L’ispessimento del grasso orbitario e dei muscoli è responsabile della proptosi (protrusione dei bulbi oculari). Inoltre, l’ispessimento dei muscoli
extraoculari può determinare limitazione della loro motilità, con conseguente strabismo e diplopia. In casi particolarmente gravi, l’ispessimento dei ventri muscolari e del grasso orbitario può determinare la compressione del nervo ottico con conseguenze funzionali di grado variabile.
Principali manifestazioni cliniche
Le manifestazioni cliniche della OB riflettono le alterazioni anatomo-patologiche dei tessuti orbitari [1]. L’interessamento degli occhi può essere mono- o bilaterale; più frequentemente vengono colpiti entrambi gli occhi, a volte in tempi diversi.
I sintomi e i segni principali sono: 1) esoftalmo (anche definito proptosi); 2) riduzione della motilità oculare; 3) diplopia; e 4) retrazione palpebrale con possibile lagoftalmo (incompleta chiusura delle palpebre), che può essere responsabile dell’insorgenza di ulcere corneali. Sono presenti inoltre numerose manifestazioni infiammatorie, quali: 1) dolore; 2) edema palpebrale e periorbitario; 3) edema congiuntivale (chemosi); 4) edema della caruncola; e 5) iperemia palpebrale. L’attività della malattia viene definita mediante un punteggio denominato Clinical Activity Score (CAS), che si riferisce esclusivamente alle manifestazioni infiammatorie [1]. Nei casi più
gravi può essere presente compressione dei nervi ottici con conseguente comparsa di alterazioni varie dell’acuità visiva fino alla completa cecità.
Storia naturale
Come riportato sopra, l’OB può precedere l’ipertiroidismo del MB, seguirlo o insorgere contemporaneamente ad esso [4]. In circa l’85% dei casi il tempo che intercorre tra l’esordio dell’OB e quello dell’ipertiroidismo non è superiore a 12 mesi [4]. Nel corso del tempo l’OB presenta un andamento particolare che prevede una suddivisione in tre fasi: 1) una fase iniziale di progressione e attività, caratterizzata dalla presenza di segni e sintomi infiammatori; 2) una fase intermedia di relativa stabilità; e 3) una fase tardiva in cui la sindrome tende a migliorare spontaneamente per poi mantenersi stabile nel tempo, verosimilmente a causa della fibrosi dei tessuti orbitari [9].
Terapia
Nell’OB, i trattamenti aggressivi sono necessari solo nel 3-5% dei casi (forme gravi) [1]. La terapia è per lo più medica, a base di glucocorticoidi (GC) ad alte dosi somministrati per via endovenosa ad intervalli settimanali, fino ad arrivare ad una dose cumulativa di 4-4.5 g di metilprednisolone. La
radioterapia esterna orbitaria (RT) è una terapia di seconda scelta [1]. Nei casi particolarmente gravi, soprattutto in presenza di neuropatia ottica e mancata risposta al trattamento medico e/o radiante, è indicata la terapia chirurgica [orbitotomia decompressiva (OTD)]. La OTD viene comunque utilizzata anche a scopo riabilitativo/estetico [1]. Spesso, quando la OB è ormai inattiva, sono necessari interventi di chirurgia muscolare per correggere l’eventuale diplopia residua e/o di chirurgia palpebrale per correggere la retrazione palpebrale [1]. Nelle forme lievi è in genere sufficiente la terapia locale con lubrificanti oculari e, in caso di lagoftalmo, il bendaggio oculare notturno [1]. Inoltre, in uno studio multicentrico randomizzato, il selenio si è dimostrato efficace del determinare un miglioramento dell’OB di grado lieve [10]
RAZIONALE, SCOPO E DISEGNO DELLA TESI
L’OB risponde in modo soddisfacente alla terapia immunosoppressiva quando è clinicamente attiva, ma poco quando inattiva [1]. In altre malattie autoimmuni questo tipo di risposta riflette il numero dei linfociti che infiltrano l’organo bersaglio. Nel diabete mellito di tipo 1 sono stati individuati due fenotipi immunopatologici correlati con la diversa risposta alla terapia con un anticorpo monoclonale anti-CD20, ovvero il Rituximab
[11, 12]. Il primo fenotipo, denominato “iperimmune” è caratterizzato da un elevato numero di linfociti B CD20-positivi sia circolanti che infiltranti le insule pancreatiche, ed è associato ad una risposta più efficace al Rituximab; il secondo fenotipo, denominato “pauci-immune”, è caratterizzato da uno scarso numero dei linfociti B CD20-positivi sia circolanti che infiltranti le isole pancreatiche, e si associa ad una risposta meno efficace al farmaco.
Lo scopo della presente tesi era pertanto di valutare l’entità e il fenotipo immunoistochimico dell’infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari e correlarlo con il fenotipo clinico dell’OB. Il disegno dello studio prevedeva l’inclusione di 20 pazienti consecutivi affetti da OB che erano stati sottoposti a intervento di decompressione orbitaria (OTD). Il numero dei pazienti veniva stabilito arbitrariamente, non essendo noti studi a riguardo su casistiche sufficientemente ampie.
Il reclutamento dei pazienti veniva effettuato dal primo Gennaio al 31 Maggio 2017.
PAZIENTI E METODI
Caratteristiche dei pazientiVenivano reclutati arbitrariamente 20 pazienti consecutivi affetti da OB candidati a OTD. In tutti i pazienti veniva documentata l’abitudine al fumo, valutata la funzione tiroidea mediante il dosaggio di tiroxina libera (FT4), triiodotironina libera (FT3) (Vitros Immunodiagnostics) e tireotropina (TSH) (Immulite 2000; Siemens Healthcare) e determinata la presenza dei TRAb circolanti (Brahms).
I pazienti venivano sottoposti ad una valutazione oculistica completa che comprendeva: i) misurazione della proptosi mediante esoftalmometro Hertel; ii) Valutazione del CAS (range 0-7; OB attiva per CAS ≥ 3); iii) valutazione della diplopia secondo il Gorman Score (da assente a costante); valutazione dello stato corneale; iv) valutazione del fondo dell’occhio; v) misurazione dell’acuità visiva.
Tessuti orbitari
Venivano raccolti i tessuti orbitari dei 20 pazienti con OB ed eseguite istologia ed immunoistochimica per CD3 (marcatore dei linfociti T) e CD20 (marcatore dei linfociti B).
I tessuti orbitari raccolti venivano fissati in formalina e inclusi in paraffina per eseguire sia la colorazione istologica con ematossilina eosina sia l’immunoistochimica (Ventana Benchmark system; Ventana Medical Systems).
Come tessuti di controllo positivi venivano utilizzate tiroidi di pazienti con MB. Come tessuti di controllo negativi venivano utilizzati tessuti fibroadiposi orbitari e addominali di pazienti non affetti da MB e OB.
Sezioni con spessore di 3-5 µm venivano deparaffinate in xylene, disidratate e processate utilizzando la diaminobenzidina come metodo di rivelazione (Ventana), secondo le istruzioni fornite dal produttore. La molecola CD3, marcatore dei linfociti T, veniva identificata usando un anticorpo monoclonale di coniglio (immunoglobulina [Ig]G) diretto contro la catena ε non glicosilata della molecola CD3 espressa dai linfociti T umani (CONFIRM anti-CD3, clone 2GV6; Ventana). La molecola CD20, marcatore dei linfociti B, veniva determinata usando un anticorpo monoclonale di topo (IgG2a k) (CONFIRM anti-CD20, clone L26; Ventana). Successivamente alla colorazione immunoistochimica con ematossilina eosina, l’intero tessuto adiposo orbitario veniva scansionato a bassa risoluzione (ingrandimento di 2.5x) e poi analizzato ad un ingrandimento di 20x al fine di contare il numero dei linfociti totali
infiltranti i tessuti orbitari e il numero dei linfociti B e T in 4 campi microscopici rappresentativi. Il numero dei linfociti totali per paziente veniva espresso come la somma delle cellule presenti in tutti i 4 campi microscopici.
In 9 pazienti (45%) su 20 si evidenziava un numero di linfociti infiltranti il tessuto orbitario > 300 in 4 campi microscopici rappresentativi. In 9 pazienti il numero dei linfociti CD3-positivi era >100 e in 8 (40%) dei 20 pazienti i linfociti CD20-positivi erano > 200. Questi valori di cut-off venivano calcolati in base al modello statistico dei finite mixture models. Il finite mixture model è un modello che viene usato per rappresentare sottopopolazioni all’interno di una popolazione complessiva e assume come modello la somma di due curve gaussiane. È una variabile casuale la cui funzione di densità di probabilità è data da una media di due o più funzioni di densità di probabilità individuali. Una volta stabiliti i parametri delle due curve (media [SD]) il cut-off viene calcolato come il valore sulla base del quale la probabilità delle 2 curve è uguale. Pertanto, i valori di cut-off riportati erano quelli che meglio discriminavano le 2 normali distribuzioni identificate con l’analisi del finite mixture model. L’anatomopatologo che esaminava le sezioni dei tessuti ed eseguiva la conta delle cellule non era a conoscenza delle caratteristiche cliniche dei pazienti.
Consenso informato
Lo studio era stato approvato dal Comitato Etico Locale (Comitato Etico Area Vasta Nord Ovest). Tutti i pazienti avevano firmato il consenso informato.
Presentazione dei dati e analisi statistica
I dati sono presentati come media±SD o mediana e range interquartile in base alla distribuzione normale o meno dei valori, che veniva valutata mediante test di Shapiro-Wilks. Il numero dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari è espresso come logaritmo decimale in quanto non avevano una distribuzione gaussiana. I gruppi venivano confrontati mediante regressione lineare, semplice o multipla, Chi Quadrato, t-test o Mann Whitney test, ove appropriati.
Il livello di significatività statistica veniva stabilito per un valore di p ≤0.05. Il software SPSS, version 25 (IBM Corp) veniva usato per l’analisi statistica.
RISULTATI
Caratteristiche cliniche dei pazienti
La popolazione dei pazienti comprendeva 8 maschi e 12 femmine, tutti di razza caucasica, con un’età media (SD) di 46 (±13) anni. La maggior parte dei pazienti non fumava (Tab.1).
L’OB era associata al MB in 19 pazienti, mentre in 1 paziente si presentava in forma isolata (Euthyroid Graves’ Orbitopathy).
Tutti i pazienti con MB erano stati sottoposti ad un trattamento dell’ipertiroidismo (10 pazienti erano stati trattati con terapia radiometabolica con I¹³¹, 6 pazienti erano stati sottoposti a tiroidectomia, e 3 pazienti erano in terapia con metimazolo), e risultavano eutiroidei al momento della decompressione orbitaria. L’OTD veniva eseguita per proptosi grave in 17 pazienti e per neuropatia ottica in 3 pazienti.
Per quanto riguarda la terapia dell’OB, solo 4 pazienti non avevano ricevuto un trattamento specifico, mentre i restanti erano stati sottoposti a terapia solo con glucocorticoidi o associati a terapia radiante esterna, quest’ultima eseguita in 5 pazienti. L’intervallo di tempo mediano intercorso dall’ultima somministrazione di glucocorticoidi era di 4 mesi. Tre pazienti erano stati trattati con glucocorticoidi nei tre mesi precedenti la
decompressione orbitaria.
La maggior parte dei pazienti presentava un’OB di grado medio-grave, di attività variabile (come mostrato dai valori di CAS riportati nella Tab.1) e con una durata mediana di 34 mesi.
Linfociti infiltranti i tessuti orbitari e loro correlazione con il CAS
In nove su 20 pazienti (45%) veniva evidenziato un numero di linfociti infiltranti il tessuto orbitario >300 in 4 campi microscopici. Tre casi rappresentativi, uno con uno scarso e due con un marcato infiltrato linfocitario, sono mostrati in Figura 1. I linfociti, organizzati in foci distinti, comprendevano cellule T e B, senza un sottogruppo predominante. I linfociti che risultavano positivi sia per le molecole CD3 che CD20 venivano individuati anche nei campioni di tessuti tiroidei di pazienti con MB, usati come controlli positivi. Al contrario, nessun linfocita e, di conseguenza, nessuna colorazione per CD3 e CD20, si osservava nei campioni di tessuto fibroadiposo orbitario e addominale di pazienti non affetti da MB o OB, usati come controlli negativi.
Il numero totale dei linfociti e dei sottogruppi CD3-positivi e CD20-positivi era correlato con il CAS mediante regressione lineare (Tabella 2 e
CD3-positivi e CD20-CD3-positivi, il CAS aumentava di 1.52 punti (95% CI 0.60-2.44, P=0.003), di 1.68 punti (95% CI 0.54-2.82, P=0.006) e 1.2 punti (95% CI 0.51-1.90, P=0.002), rispettivamente. I linfociti non erano correlati con l’età, il sesso, l’abitudine al fumo, la durata dell’OB, la terapia tiroidea, le pregresse terapie dell’OB, la funzione tiroidea, i livelli di TRAb, ed alcuni parametri oftalmologici quali l’esoftalmometria, l’apertura palpebrale, la diplopia e l’acuità visiva.
Come riportato in tabella 2, la regressione multipla, in cui la relazione tra linfociti e CAS veniva corretta per fumo e durata dell’OB (le altre variabili correlate con il CAS mediante regressione lineare), confermava una correlazione tra numero di linfociti, loro sottogruppi e CAS.
Caratteristiche dei pazienti correlate con l’infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari
A conferma dei dati sopra riportati, quando i pazienti venivano separati in positivi e negativi sulla base dei livelli di cut-off (vedi “Pazienti e metodi”), si confermava statisticamente significativa la relazione tra numero dei linfociti totali e CAS, che risultava più elevato nei pazienti con numero di linfociti infiltranti il tessuto orbitario >300 rispetto ai soggetti con un numero di linfociti ≤ 300. Inoltre si osservava una diversa distribuzione dei fumatori nei
due gruppi di pazienti. In particolare il numero dei fumatori era significativamente maggiore nel gruppo dei pazienti con linfociti >300 (4 fumatori, 1 ex-fumatore e 4 non fumatori vs 1 fumatore, 1 ex fumatore e 9 non fumatori tra i pazienti con un numero di linfociti inferiore al valore soglia; P=0.007), a conferma del ruolo del fumo come fattore di rischio per l’OB [1]. Al contrario, tutti gli altri parametri (età, sesso, durata dell’OB, terapia tiroidea, pregresse terapie dell’OB, funzione tiroidea, livelli dei TRAb, proptosi, apertura palpebrale, diplopia e acuità visiva) non differivano tra i due gruppi. Si ottenevano gli stessi risultati utilizzando come separatore il cut-off di 100 per i linfociti T e il cut-off di 200 per i linfociti B (vedi “Pazienti e metodi”).
L’assenza di una correlazione tra infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari e i valori dei TRAb era sorprendente, in considerazione del dato che i TRAb sarebbero correlati con l’attività e la gravità dell’OB [13]. I livelli individuali dei TRAb circolanti in relazione alla presenza o meno di un infiltrato linfocitario orbitario significativo sono mostrati in Figura 3. Il risultato probabilmente riflette una durata dell’OB relativamente lunga (mediana di 34 mesi), e soprattutto il fatto che la maggior parte dei pazienti era stata sottoposta ad ablazione tiroidea che, con l’eccezione di un transitorio incremento dei TRAb successivo al radioiodio [14], è
generalmente seguita nel lungo termine da una riduzione del titolo di questi anticorpi [7]. Tale riduzione potrebbe spiegare i livelli relativamente bassi e, di conseguenza, la mancanza di correlazione con i linfociti infiltranti il tessuto orbitario. Tuttavia i nostri risultati non escludono con certezza una correlazione generale tra linfociti infiltranti i tessuti orbitari e gli anticorpi diretti contro il recettore del TSH. A questo riguardo, potrebbe essere utile un’analisi funzionale degli anticorpi anti-recettore del TSH, poiché alcuni studi hanno mostrato che la misurazione degli anticorpi stimolanti il recettore del TSH, invece del dosaggio dei TRAb, che come noto non fornisce informazioni sulla funzione di questi anticorpi, potrebbe essere un indice più sensibile per valutare una correlazione dell’autoimmunità contro il recettore del TSH e le caratteristiche dell’OB [15].
DISCUSSIONE
Nel presente studio, mostriamo che l’infiltrato linfocitario dei tessuti orbitari nei pazienti con OB è correlato con l’attività dell’OB, mettendo in luce un’associazione tra caratteristiche immunologiche ed espressione clinica dell’OB e ponendo una base immunopatologica per i futuri studi volti
ad indagare l’associazione tra infiltrato linfocitario orbitario e la risposta ai trattamenti immunosoppressori [16, 17].
I risultati a supporto delle nostre conclusioni possono essere riassunti come segue.
Esaminavamo i tessuti orbitari di 20 pazienti con OB che erano stati sottoposti a decompressione orbitaria. All’esame istologico osservavamo nel 45% dei pazienti la presenza di multiple aree focali di distinti infiltrati linfocitari. All’immunoistochimica i linfociti risultavano positivi sia per le molecole CD3 che per le molecole CD20, indicando che erano presenti sia linfociti T che B, con una predominanza variabile. Il numero totale dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari, così come il numero delle cellule CD3- e CD20-positive, erano correlati significativamente col CAS, che a sua volta era correlato con fumo e durata dell’OB.
L’analisi multivariata confermava la correlazione tra CAS e numero totale dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari, così come tra CAS e linfociti CD3- e CD20- positivi, indicando che i linfociti infiltranti l’orbita sono correlati con l’attività dell’OB in maniera indipendente. A conferma di tali risultati, il CAS era maggiore nei pazienti con un numero totale di linfociti infiltranti i tessuti orbitari superiore al cut-off di 300 in 4 campi microscopici rappresentativi (cut-off stabilito utilizzando il modello statistico dei finite mixture models),
rispetto a quello dei pazienti che avevano livelli di linfociti infiltranti i tessuti orbitari inferiore o uguale al livello di cut-off. I pazienti con un infiltrato linfocitario significativo erano più spesso fumatori, confermando indirettamente la correlazione tra fumo e CAS, e in accordo con il dato che il fumo rappresenta un fattore di rischio dell’OB [1].
A parte studi in cui veniva studiato il fenotipo dei linfociti T orbitari in coltura [18,19], a nostra conoscenza, un solo precedente studio sullo stesso argomento era stato condotto in un numero inferiore di pazienti (n= 14) [20]. Nel suddetto studio, i linfociti T orbitari erano stati rilevati in misura maggiore in pazienti con OB di recente insorgenza rispetto ai pazienti con OB di lunga durata, risultato che, in considerazione dell’evidenza che l’OB è più attiva nelle sue fasi precoci [9], è indirettamente in linea con i nostri risultati. Tuttavia, nello stesso studio, il numero dei linfociti B infiltranti era trascurabile, sia nell’OB di recente insorgenza che di lunga durata [20]. Questa apparente discrepanza con i nostri risultati può riflettere il fatto che, nello studio precedente, i pazienti erano stati selezionati e non consecutivi. Inoltre, il numero (5) dei pazienti con OB di recente insorgenza e presumibilmente attiva era limitato, e 2 dei 5 pazienti erano stati sottoposti a
trattamenti immunosoppressori (glucocorticoidi e, in un paziente, anche azatioprina) nel mese precedente la raccolta del tessuto [20].
Limiti dello studio
La maggior parte dei pazienti (16, pari all’80% del campione) di cui sono stati raccolti i tessuti erano stati trattati con glucocorticoidi prima della decompressione orbitaria e potrebbe essere messo in discussione il fatto che questo intervento potrebbe aver alterato i risultati. Tuttavia, il periodo mediano intercorso tra l’ultima somministrazione di glucocorticoidi e la raccolta dei tessuti era maggiore di tre mesi, suggerendo che è improbabile che i glucocorticoidi possano aver influenzato l’infiltrato linfocitario dei tessuti orbitari. A conferma di ciò, non c’era correlazione tra precedente trattamento con glucocorticoidi o dose degli stessi e l’infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari. Allo stesso modo, 5 pazienti erano stati sottoposti a terapia radiante esterna, ma anche in questo caso non vi era correlazione tra radioterapia e i dati sopra riportati.
I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari nella patogenesi dell’OB, nonostante i dati non siano sufficienti per dimostrarlo. A tale proposito dovrebbe essere preso in considerazione il fatto che i linfociti probabilmente rappresentano solo uno
dei numerosi elementi cellulari coinvolti, oltre ai fibroblasti ed ai fibrociti orbitari [5]. Abbiamo osservato una persistenza dell’infiltrato linfocitario che era correlata con il CAS anche nei casi di OB di lunga durata. Il meccanismo alla base di tale osservazione non è noto. Rimane da stabilire come i linfociti rimangano intrappolati nei tessuti orbitari e sono necessari ulteriori studi. Un altro limite dello studio è che il CAS non era inizialmente inteso come un indice di valutazione nel lungo termine dell’OB (nonostante sia ampiamente usato in questo modo) [9].
Come sopra menzionato, i nostri risultati possono porre la base per ulteriori studi volti a indagare l’associazione tra risposta ai trattamenti immunosoppressori, in particolare glucocorticoidi, attività dell’OB e caratteristiche immunoistologiche dell’OB. A tale proposito, abbiamo considerato la possibilità che la presenza variabile dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari e in particolare, della sottoclasse CD20-positiva, possa spiegare i dati discrepanti sull’azione del Rituximab nei pazienti con OB [6]. Infatti è stato osservato che il Rituximab determina un miglioramento dell’OB nei pazienti con malattia di recente insorgenza ma non in quelli con malattia di lunga durata [6]. Tuttavia, nel presente studio non vi era alcuna correlazione tra linfociti CD20-positivi infiltranti i tessuti orbitari e durata di
malattia, suggerendo che la risposta variabile al Rituximab verosimilmente non riflette una differente espressione di queste cellule nei tessuti orbitari. In ogni caso, Salvi et al. [21] hanno mostrato una deplezione dei linfociti infiltranti i tessuti orbitari CD20-positivi in un piccolo numero di pazienti (2) con OB attiva che rispondevano al trattamento, suggerendo che possa in effetti esistere un’associazione tra linfociti CD20-positivi infiltranti l’orbita e risposta al Rituximab. In ogni caso il nostro studio non è rilevante ai fini del trattamento con Rituximab considerando che la maggior parte dei nostri pazienti aveva una malattia di lunga durata ed inattiva, non rappresentando pertanto una popolazione adeguata per essere trattata con anticorpi monoclonali anti-CD20.
CONCLUSIONI
Questo studio dimostra l’esistenza di una relazione tra l’infiltrato linfocitario nei tessuti orbitari e l’attività dell’OB, a dimostrazione di un ruolo diretto sia dei linfociti T che B nella patogenesi dell’OB, e pone una possibile base immunopatologica per spiegare la risposta favorevole ai trattamenti immunosoppressivi nei pazienti con OB attiva, ma non nei pazienti con OB non attiva.
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LEGENDA DELLE FIGURE
Figura 1
Istologia e colorazione immunoistochimica per CD3 e CD20 nei tessuti orbitari di tre pazienti rappresentativi con orbitopatia basedowiana (OB), uno con uno scarso (paziente 3) e due (pazienti 12 e 14) con un marcato infiltrato linfocitario, ed in tre tessuti di controllo, ovvero tiroideo di un paziente con Morbo di Basedow (MB), il tessuto orbitario e fibroadiposo addominale di due pazienti senza MB e OB.
Figura 2. a) Correlazione tra il numero totale dei linfociti nei tessuti orbitari
ed il Clinical Activity Score (CAS) in 20 pazienti con orbitopatia basedowiana; b) Correlazione tra il numero dei linfociti CD3-positivi e CAS; c) Correlazione tra il numero dei linfociti CD20-positivi e CAS. I valori di P sono stati ottenuti mediante regressione lineare. d) Valori di CAS in base al numero di linfociti nei tessuti orbitari (>300 o ≤300 cellule in 4 campi microscopici).
Figura 3. Correlazione tra i livelli degli anticorpi anti-recettore del TSH
(TRAb) e l’infiltrato linfocitario orbitario (≤ 300 e > 300 cellule in 4 campi microscopici rappresentativi).
Tabella 1. Caratteristiche cliniche e demografiche dei pazienti. I dati sono
presentati come media±SD o mediana e range interquartile (IQR), ove appropriati. OB: orbitopatia basedowiana; GC: glucocorticoidi; RT: radioterapia; TRAb:autoanticorpi anti-TSH-recettore; OTD: orbitotomia decompressiva.
Sesso Uomini: 8; Donne: 12
Età (anni) 46.4±13.4; range : 18-67
Fumo
Fumatori: 5 Ex fumatori: 2 Non fumatori: 13 Durata OB (mesi) 34; IQR 18-51 ; range : 2-65
Terapia tiroidea Metimazolo: 3 Radioiodio: 10 Tiroidectomia: 6 Nessuna: 1 Terapia OB GC ev and RT: 4 GC ev: 11 GC per os and RT: 1 Nessuna: 4 Mesi dall’ultima somministrazione di
GC 4; IQR 3-18.5; range : 0-36
FT3 (pg/ml) 3.8±0.4; range : 3.2-4.7
TSH (µU/ml) 0.6; IQR 0.1-1.9; range: 0.003-4.2 TRAb (U/L) 3.9; IQR 2.3-5.7; range: 0.3-9.8
Proptosi (mm) 24.6±2.7; range : 17-28
Clinical activity score 4; IQR 3-5; range: 1-7
Diplopia (Gorman’s score)
Assente: 8 Intermittent: 1 Inconstante: 5 Constante: 6 Acuità visiva (decimali) 0.93±0.12; range : 0.6-1
Tabella 2. Correlazione tra le caratteristiche cliniche dei pazienti e l’infiltrato
linfocitario (>300 cellule in 4 campi microscopici rappresentativi) nei tessuti orbitari. I dati sono presentati come media±SD o mediana e range interquartile (IQR), ove appropriati. GC: glucocorticoidi; TRAb: autoanticorpi del recettore del TSH; RT: radioterapia. I valori di P sono stati ottenuti mediante Chi-quadrato, t-test o Mann Whitney test, ove appropriati. *P= 0.007 ; **P=0.04
Linfociti orbitari ≤300 Linfociti orbitari >300
Sesso 5 uomini; 6 donne 3 uomini; 6 donne
Età 42.2±16.3; range: 18-67 51.4±6.5; range: 41-60
Fumo 1 fumatore; 1 ex-fumatore; 9
non-fumatori*
4 fumatori; 1 ex-fumatore; 4 non-fumatori*
Terapia tiroidea 1 metimazolo; 5 radioiodio; 5 tiroidectomia
2 metimazolo; 5 radioiodio; 1 tiroidectomia; 1 nessuna
FT3 (pg/mL) 3.7±0.4; range: 3.1-4.6 3.9±0.4; range: 3.3-4.8
TSH (µU/mL) 0.6; IQR 0.1-1.7 0.9; IQR 0.1-2.5
TRAb (U/L) 2.8; IQR 1.4-6.3 4.2; IQR 2.7-5.9
Durata OB (mesi) 34; IQR 15.7-56.5 34; IQR 19-44.5
Terapia OB GCev e RT: 3, GCev: 4, GC per
os e RT: 1, Nessuna: 3
GCev e RT: 1, GCev: 7, GC per os e RT: 0, Nessuna: 1
Mesi dall’ultima somministrazione di GC
18; IQR 3.2-25.7 4; IQR 2.7-13.5
Esoftalmometria (mm) 24.0±3.1; range: 17-28) 25.3±2; range: 22-28
Clinical activity score 4; IQR 1.2-4.7 ** 5; IQR 3.7-6 **
Diplopia (score di Gorman) Assente: 5 Intermittente: 1, Incostante: 3, Costante: 2 Assente: 3 Intermittente: 0, Incostante: 2, Costante: 4
RINGRAZIAMENTI
Ringrazio i direttori, il Prof. Stefano Del Prato, il Prof. Claudio Marcocci e il Prof. Paolo Vitti per avermi dato l’opportunità di crescere professionalmente e umanamente nel corso di questi anni.
Sento di rivolgere un ringraziamento particolare al Prof. Marcocci per la comprensione e la disponibilità da lui ricevute in questo anno così difficile. Ringrazio di cuore tutti i membri del mio gruppo di ricerca, che mi hanno accolto con affetto e con i quali è stato un piacere collaborare.
Un ringraziamento particolarmente speciale va al mio mentore, il Dott. Marinò, per il sostegno, la pazienza, la fiducia e gli insegnamenti che mi ha fornito nel mio percorso formativo e per avermi trasmesso l’interesse per la ricerca scientifica.
Ringrazio infine tutti i colleghi specializzandi, il personale medico, infermieristico e delle segreterie con cui ho avuto il privilegio di lavorare. È stato un onore aver fatto parte di questa Scuola.
