UNIVERSITA’ DI PISA
Facoltà di Medicina veterinariaCorso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE
NELL’ALLEVAMENTO CANINO
Candidato: Relatori:
Marta Mellea Dott.ssa Alessandra Rota Prof. Iacopo Vannozzi
Mellea Marta
UNIVERSITA’ DI PISA
Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
LA GESTIONE DELLA RIPRODUZIONE NELL’ALLEVAMENTO CANINO
Parole chiave: cane, allevamento, riproduzione, ciclo estrale, gravidanza.
Lo scopo di questa Tesi è stato quello di raccogliere dati sulla gestione della riproduzione negli allevamenti canini, sia mediante un questionario inviato agli allevatori che raccogliendo in modo continuativo per oltre due anni i dati in due allevamenti, cercando di individuarne le differenze di gestione e l’efficienza riproduttiva. I questionari sono stati compilati da 35 allevatori rappresentanti 39 razze canine. Il 77,1% degli intervistati allevava cani da oltre 10 anni. Dalle risposte ai questionari risulta che la percentuale di parti, rispetto alle femmine accoppiate, è stata mediamente dell’84,9%, con percentuali nei diversi allevamenti tra il 33 ed il 100%, e la percentuale di cuccioli svezzati è stata del 96%, con una variabilità negli allevamenti tra l’82,2 ed il 100%. La maggior parte degli allevatori ritiene che l’età in cui una femmina debba riprodursi sia tra i 2 ed i 6-7 anni e decide il momento degli accoppiamenti affidandosi prevalentemente al comportamento estrale, spesso però associato al dosaggio ematico del progesterone e/o alla citologia vaginale. Il 45,7% degli allevatori dichiara di utilizzare l’inseminazione artificiale, sporadicamente o costantemente, ed il 54,3% di questi richiede la diagnosi ecografica della gravidanza. Il parto avviene prevalentemente in una cassa, in casa o in un box riscaldato, e l’assistenza è generalmente continua. Tra i fattori che secondo gli allevatori hanno un’influenza positiva sulla fertilità vi sono il dosaggio del progesterone ematico e l’utilizzo di un maschio interno all’allevamento piuttosto che esterno, mentre un’influenza negativa avrebbe l’utilizzo dell’inseminazione artificiale rispetto alla monta naturale. I due allevamenti seguiti per oltre due anni differivano per molti aspetti tra cui il monitoraggio del ciclo estrale, il metodo di riproduzione (monta naturale o inseminazione artificiale) e l’efficienza riproduttiva complessiva.
Key words: bitch, breeding, reproduction, estrous cycle, pregnancy.
The aim of this Thesis was to collect data on the management of reproduction in dog kennels, both through a questionnaire sent to dog breeders and through the continuous collection of data for more than two years in two kennels, trying to detect the differences in management and reproductive efficiency. The questionnaires were compiled by 35 breeders representing 39 dog breeds. 77.1% of the interviewed was breeding dogs since more than 10 years. From the answers to the questionnaires the proportion of whelping among the bred bitches was mainly 84.9%, with proportions in the different kennels between 33 and 100%, and the proportion of weaned puppies was 96%, with a variability of 82.2 to 100%. Most of the breeders believe that the age at which a female should reproduce lies between 2 and 6-7 years, and choose the time for mating relying mainly on estrous behaviour, often in association with blood progesterone concentration and/or vaginal cytology. 45.7% of the breeders declare to use artificial insemination, occasionally or constantly, and 54.3% of them ask for ultrasonographic pregnancy diagnosis. Parturition occurs mainly in a whelping box, at home or in a warmed kennel, and assistance is usually continuous. Among the factors detected by the breeders as influencing positively fertility are blood progesterone evaluation and the use of male dogs owned by the kennel rather than kept in other locations, while a negative influence is ascribed to the use of artificial insemination rather than natural mating. The two kennels followed for more than two years differed under many aspects such as monitoring of estrous cycle, method of reproduction (natural mating or artificial insemination) and overall reproductive efficiency.
INDICE
INTRODUZIONE 7
LA PUBERTA’ 9
IL CICLO ESTRALE 11
FASI DEL CICLO ESTRALE 13
Proestro 13
Estro 15
Diestro 17
Anestro 20
VALUTAZIONE DELLE FASI DEL CICLO ESTRALE 21
Citologia vaginale 22
Dosaggio del Progesterone ematico 33
Endoscopia vaginale 36
Protocollo per l’individuazione del momento dell’ovulazione 38
L’ACCOPPIAMENTO 40
Insorgenza delle manifestazioni sessuali 40
Accoppiamento 40
INSEMINAZIONE ARTIFICIALE 44
Prelievo del seme 44
Valutazione del seme 46
Inseminazione con seme fresco 54
Inseminazione con seme refrigerato 56
Inseminazione con seme congelato 56
LA GRAVIDANZA 60
Durata della gravidanza 60
Profilo endocrino 60
Evoluzione della gravidanza 63
Diagnosi di gravidanza 64
Segni secondari di gravidanza 70
IL PARTO 73
Determinismo 73
Modificazioni endocrine al parto 73
Segni premonitori del parto 74
Assistenza al parto: il box da parto 76
Stadi del parto naturale 79
Involuzione uterina fisiologica 83
Parto con taglio cesareo 84
Dimensione della cucciolata 85
Alimentazione in gravidanza 86
L’ALLATTAMENTO 87
Sviluppo mammario e lattazione 87
Il colostro 89
Il latte 89
Alimentazione durante la lattazione 91
Lo svezzamento dei cuccioli 92
SCOPO DELLA TESI 98 IL QUESTIONARIO 99 Materiali e metodi 99 Risultati 106 GLI ALLEVAMENTI 138 Materiali e metodi 138 Risultati 140 DISCUSSIONE 155 BIBLIOGRAFIA 165
INTRODUZIONE
La gestione della riproduzione occupa sicuramente un posto centrale nella riuscita dell’allevamento canino che, da questo punto di vista, è stato certamente meno studiato rispetto agli allevamenti di specie zootecniche da reddito. Il cane, oggi, riveste un ruolo di notevole importanza sia per il coinvolgimento emotivo dei proprietari che dal punto di vista economico. I cuccioli di razza iscritti annualmente ai libri genealogici, infatti, sono circa 130.000, e ipotizzando un prezzo medio di vendita di 500 euro si può dire che ogni anno vengano “prodotti” cuccioli per un valore complessivo di 65 milioni di euro. Oltre a ciò, il cane muove un notevole volume di affari per quanto riguarda la sua alimentazione, la sua cura, e nel cane di razza anche per tutte le attività sportive ed espositive ad esso legate. L’allevamento canino può quindi essere considerato un’attività produttiva a tutti gli effetti, che necessita di un’adeguata gestione anche dal punto di vista sanitario, soprattutto per quanto riguarda la riproduzione. Oggigiorno il Veterinario ha a disposizione, oltre alle capacità professionali che gli permettono di seguire lo stato di salute degli animali presenti in allevamento, degli strumenti che gli possono
permettere di ottimizzare l’efficienza riproduttiva nell’allevamento stesso. Gli allevatori, pur confidando nell’esperienza accumulata negli anni, richiedono sempre più frequentemente l’aiuto del Veterinario che deve essere quindi in grado di rispondere in modo esaustivo alle loro domande, mai banali, di occuparsi in modo ottimale della gestione della riproduzione e di applicare tecniche riproduttive quali l’inseminazione artificiale.
L’incontro tra l’Allevatore ed il Veterinario, una volta acquistata la fiducia reciproca, non potrà che arricchire entrambi.
LA PUBERTA’
La pubertà è definita come il momento in cui il soggetto raggiunge la capacità di riprodursi. Per la cagna la pubertà coincide con l’inizio del primo proestro. L’età in cui si hanno le prime manifestazioni estrali è influenzata soprattutto dalla razza e dalla mole della cagna: soggetti di piccola e media taglia manifesteranno generalmente il primo calore tra i 6 e i 10 mesi di età mentre quelli di grossa mole e i levrieri possono “tardare” fino ai 18 – 24 mesi (Feldman e Nelson, 1998) [Tab.1]. Una previsione sull’epoca di comparsa della pubertà, oltre che dalle differenze interrazziali è resa difficile dalla notevole variabilità individuale. Sussistono comunque della differenze tra un ciclo di una cagna alla pubertà e quello di una cagna matura; in primo luogo soggetti alla pubertà possono dimostrare meno, dal punto di vista comportamentale, l’estro, nonostante questo sia generalmente accompagnato da ovulazione. Altra differenza sta nella durata del proestro – estro, che può essere più breve nelle cagne al primo ciclo. Questo primo ciclo estrale può differire da quello delle femmine mature anche per l’incidenza maggiore di falsi calori, caratterizzati da manifestazioni fisiche che normalmente sono spia di estro non accompagnate però da ovulazione, e di calori
silenti, dove invece abbiamo ovulazione in assenza di comportamenti o manifestazioni cliniche tipiche dell’estro (Johnston et al, 2001).
La massima capacità riproduttiva può non essere raggiunta sino al secondo, terzo estro. Per questo motivo per una corretta gestione della femmina dal punto di vista riproduttivo, si preferisce indicare come età ottimale per il primo accoppiamento quella compresa tra i 1 e i 2 anni, a seconda dello sviluppo somatico raggiunto.
Tabella n°1: Tabella relativa all’età di raggiungimento della pubertà in alcune razze canine
(da Evans JM et al, The Book of the Bitch: A Complete Guide to Understanding and Caring
for Bitches, 1988; Clark RD et al, Medical and Genetic Aspects of Purebred Dogs, 1983).
Razza Raggiungimento della pubertà (mesi)
Airedale Terrier 15 Alano > 18 Australian sheperd 6-18 Bichon frise 8-9 Border collie 6-8 Boxer 8-24 Bullmastiff 6-16 Bull terrier 7-11 English setter 7-20 Golden retriever 9-11 Greyhound 11-30 Irish wolfhound 14-18
Pastore dei pirenei 12
Rottweiler 8 Saluki 8-24 Samoiedo > 12 Shetland sheepdog 7-17 Whippet 12-24 Yorkshire terrier 8-16
IL CICLO ESTRALE
La cagna, dal punto di vista riproduttivo, è definita come una specie monoestrale.
Si sostiene comunemente che le cagne presentino cicli estrali due volte l’anno, con un range che va da uno a tre cicli per alcune razze o individui. Numerose indagini hanno portato ad escludere qualsiasi forma di stagionalità propriamente detta dal momento che, nell’insieme, le femmine manifestano attività sessuale distribuita lungo tutta la durata dell’anno (Feldman e Nelson, 1998).
Il ciclo estrale del cane domestico appare costituito da quattro fasi: proestro, estro, diestro e anestro. Generalmente l’inizio della fase proestrale coincide con l’inizio del ciclo riproduttivo.
La cagna presenta manifestazioni cicliche mediamente ogni sette mesi, in modo che durante l’arco della vita tenderà a manifestare i calori in diversi mesi dell’anno. L’intervallo interestrale (calcolato dal termine della fase estrale propriamente detta all’inizio del proestro successivo) ha, inoltre, una durata variabile tra i 5 e i 10 mesi, che accentua ulteriormente la distribuzione dei calori in tutti i mesi dell’anno. Intervalli inferiori ai quattro mesi sono per lo più associati ad infertilità, e quelli superiori agli undici mesi possono
associarsi sia a fenomeni di ipofertilità che ad infertilità (Feldman e Nelson, 1998).
La durata dell’intervallo interestrale, infine, appare essere variabile nella stessa cagna, tra cagne di razza uguale e tra cagne di razze diverse.
Sembra che l’età costituisca un fattore che va ad influire sull’intervallo interestrale: con il progredire degli anni, di media superati i sette, assistiamo in alcuni casi ad un allungamento della durata dell’anestro. Anche problemi di salute quali l’ipotiroidismo, contribuiscono all’allungamento dell’intervallo interestrale. Altro fattore che sembra influenzare la durata del periodo in questione e che comporta una variabilità interrazziale è l’ereditarietà (Andersen e Wooten, 1959).
FASI DEL CICLO ESTRALE
Proestro
Fase di incremento dell’attività follicolare ovarica che precede l’estro.
Durata
La durata media di questa fase si attesta attorno ai 9 giorni (0 – 27).
Generalmente tra inizio del proestro e primo accoppiamento trascorrono dai 6 agli 11 giorni con una media di 9; la variabilità individuale può essere però molto ampia, con fasi proestrali che perdurano da 1-2 giorni fino ad un massimo di 25 (Bell e Christie, 1971) .
Segni clinici
Durante questa fase si assiste alla comparsa di uno scolo siero-ematico vulvare con l’intumidimento della vulva. In molti soggetti, in corrispondenza del momento di transizione dal proestro all’estro, le perdite si trasformano da emorragiche in sierose, trasparenti e paglierine, e si attenuano fino a svanire. In alcune razze la lunghezza del pelo può rendere più difficile il rilevamento della presenza di suddetto scolo.
I maschi sono attratti dalla femmina che però non accetta la monta, sottraendosi attivamente al corteggiamento con manifestazioni vocali o reazioni aggressive e violente; questa attrazione è spiegabile con la produzione di feromoni presenti nelle secrezioni vaginali, rettali e nelle urine (Goodwin et al, 1979).
Durante questo periodo si accentuano tre riflessi sessuali:
1. l’“ammiccare” della vulva in risposta a stimoli meccanici sulla pelle subito dorsalmente alla vulva stessa
2. l’irrigidire la zampa posteriore ipsilaterale in risposta a stimoli meccanici sulla pelle alla destra o alla sinistra della vulva
3. il deviare la coda in risposta a stimoli meccanici su qualsiasi lato della vulva
Questi riflessi risultano assenti durante l’anestro, aumentano durante il proestro e raggiungono l’apice durante la prima metà dell’estro (Beach et al, 1982) .
Endocrinologia
Nella cagna durante il proestro gli estrogeni prodotti dai follicoli ovarici, rappresentano la componente endocrina predominante, responsabile delle modificazioni peculiari di questa fase. Il vero e proprio picco estrogenico si verifica 24-48 ore prima
dell’insorgenza dell’estro, fase che invece è caratterizzata da concentrazioni ematiche di estrogeni in lenta e progressiva diminuzione sino a raggiungere la soglia basale (Concannon et al, 1975; Olson et al, 1982).
La concentrazione di progesterone, ridotta per tutta la fase proestrale (< 0,5 – 1 ng/ml), tende a superare il livello basale in concomitanza del calo di estrogeni a cavallo della fase proestro – estrale (Concannon et al, 1977a).
Le gonadotropine (FSH e LH) registrano un primo aumento nella fase proestrale precoce per ricadere poi a livelli basali fino all’aumento associato alle prime fasi estrali (Olson at al, 1982a).
Estro
Fase in cui la cagna accetta il maschio. Durata
Il primo giorno di disponibilità al coito viene comunemente considerato come inizio della fase estrale.
L’estro mediamente ha una durata di 5-9 giorni; anche questa fase presenta una notevole variabilità individuale con estremi compresi tra un minimo di 1-2 giorni e un massimo di 18-20. Comunque sia nella singola cagna la durata sembra abbastanza costante in cicli successivi (Bell e Christie, 1971) .
Segni clinici
La manifestazione più caratteristica è l’accettazione del maschio: la cagna in estro può accettarlo passivamente o cercare di suscitare attivamente la sua attenzione.
Il turgore vulvare si attenua, lasciando i tessuti morbidi e flaccidi. Lo scolo vulvare color paglierino rosato si presenta fluido e solo raramente ancora emorragico.
Endocrinologia
Gli estrogeni raggiungono la massima concentrazione ematica già 1 o 2 giorni prima dell’inizio dell’estro, per poi calare al culmine della maturazione follicolare preovulatoria. Al calo degli estrogeni fa riscontro la luteinizzazione e la secrezione di progesterone; questi eventi sono responsabili del cambiamento comportamentale della femmina e della modificazione endocrina che, grazie ad un’azione di feed-back positivo sull’asse ipotalamo-ipofisi, induce in picco di secrezione di FSH e LH, tipico delle prime fasi estrali. L’ovulazione si ha approssimativamente 2 o 3 giorni dopo il picco preovulatorio di LH (Wildt et al, 1978). Gli oociti di cane vengono rilasciati quando ancora sono oociti primari, quindi la fecondazione non è possibile fino a 48-72 ore dopo l’ovulazione, quando si ha la seconda divisione meiotica
dalla quale si ottengono oociti secondari (Phemister et al, 1973) [Fig.1]. Inizio del calore Concentrazione massima estrogeni Picco LH Ovulazione Inizio periodo fertile Fine periodo fertile
2 giorni 2 giorni 3 giorni
3 – 28 giorni
Giorni utili per l’accoppiamento
Figura n°1: Momenti principali del ciclo di una cagna, importanti per una buona gestione
della riproduzione (Goodman M, Ovulation timing Concepts and Controversies, 2001). Diestro
Periodo di attività secretoria dei corpi lutei. Durata
La durata media del diestro si aggira attorno ai 60-80 giorni (Holst e Phemister, 1974).
Segni clinici
Il diestro inizia dal momento in cui la femmina, trascorsa la fase di recettività sessuale, improvvisamente rifiuta l’accoppiamento; contemporaneamente viene meno l’interesse da parte del maschio.
La vulva riprende dimensioni e tono tipiche dell’anestro. Le crescenti concentrazioni di progesterone inducono uno sviluppo
della ghiandola mammaria che si rende evidente a partire da metà diestro.
Endocrinologia
Successivamente all’ovulazione la formazione dei corpi lutei induce una produzione continua ed elevata di progesterone, con picco massimo di solito a 20-30 giorni dall’ovulazione e a due–tre settimane dall’inizio del diestro.
Durante questa fase non è di difficile riscontro l’instaurarsi di una pseudogravidanza, condizione dovuta al perdurare di corpi lutei che secernono progesterone nonostante non ci sia una condizione di gravidanza propriamente detta. Nei soggetti non gravidi questi corpi lutei secernenti manifestano la tendenza a sopravvivere per periodi più lunghi rispetto a quelli gravidi.
Le concentrazioni di estrogeni nella prime fasi del diestro sono di solito a livello basale; in caso di gravidanza queste tornano ad innalzarsi in concomitanza con un abbassamento dei livelli di progesterone durante l’ultima o la penultima settimana di gestazione. Tale incremento risponde all’esigenza di stimolare il rilasciamento della cervice e delle strutture legamentose e a numerose altre funzioni indispensabili all’espletamento del parto (Feldman e Nelson, 1998) [Tab.2].
Tabella n°2: Relazione tra specifici eventi fisiologici del ciclo riproduttivo della cagna
( da Johnston SD, Canine and Feline Theriogenology, 1982).
PICCO DI LH OVULAZIONE MATURAZIONE
OOCITI INIZIO DIESTRO CITOLOGICO PICCO DI LH L’ovulazione si ha 2-3 giorni dopo il picco di LH La maturazione si ha 4-6 giorni dopo il picco di LH
L’inizio del diestro si ha 8-9 giorni dopo il picco di LH OVULAZIONE Il picco di LH si ha 2-3 giorni prima dell’ovulazione La maturazione si ha 2-4 giorni dopo l’ovulazione
L’inizio del diestro si ha 5-7 giorni dopo l’ovulazione MATURAZIONE OOCITI Il picco di LH si ha 4-6 giorni prima della maturazione L’ovulazione si ha 2-4 giorni prima della maturazione
L’inizio del diestro si ha 2-5 giorni dopo la maturazione INIZIO DIESTRO CITOLOGICO Il picco di LH si ha 8-9 giorni prima dell’inizio del diestro L’ovulazione si ha 5-7 giorni prima dell’inizio del diestro La maturazione si ha 2-5 giorni prima dell’inizio del diestro
Anestro
Fase quiescente del ciclo riproduttivo canino. Durata
La durata dell’anestro è soggetta a considerevoli variazioni, da un minimo di 7 settimane a un massimo di un anno o più (Andersen e Wooten, 1959).
Segni clinici
Per quanto riguarda il comportamento una normale cagna in anestro non attrae maschi né è disponibile all’accoppiamento. La vulva è piccola e con assenza si scolo.
Endocrinologia
Per quanto riguarda la situazione ormonale di una cagna in anestro, la concentrazione sierica di LH aumenta in modo pulsatile, soprattutto verso la fine della fase in questione. Anche l’FSH tende ad aumentare durante l’anestro, raggiungendo livelli simili a quelli registrati per il picco preovulatorio durante l’estro; il progesterone raggiunge e si attesta su livelli basali (Jeffcoate, 1992a; Jeffcoate, 1992b).
VALUTAZIONE DELLE FASI DEL CICLO ESTRALE
Vista la lunga durata del periodo di recettività sessuale della cagna, la difficoltà a visualizzarne le ovaie, la progressiva luteinizzazione del follicolo preovulatorio, che rende difficile l’identificazione del momento dell’ovulazione con ecografia transaddominale e l’ovulazione non simultanea dei follicoli ovarici (Simpson et al,1998), individuare il momento esatto dell’ovulazione è difficile. Diversi metodi possono però essere utilizzati per cercare di stimare il momento in cui questa avviene ed individuare quindi il momento ideale per l’accoppiamento; tra questi ricordiamo la citologia vaginale, il dosaggio del progesterone e l’endoscopia vaginale.
Citologia vaginale
L’esame colpocitologico costituisce una delle indagini diagnostiche collaterali di più vasto impiego in ginecologia canina, ai fini della scelta del momento ottimale per l’accoppiamento; questo perché la mucosa vaginale è un organo bersaglio per gli estrogeni che inducono modificazioni dell’epitelio che può passare da 2/4 strati ad un epitelio pluristratificato. Il cambiamento in valore percentuale del numero di cellule superficiali cheratinizzate presenti in uno striscio vaginale può essere utilizzato per monitorare il progredire delle fasi proestrale ed estrale e per predire il momento più appropriato per l’accoppiamento.
Si consiglia solitamente di esaminare gli strisci a cominciare dal prostro, ogni 2 o 3 giorni; il riscontro di un quadro costituito per oltre l’80% da cellule di tipo superficiale (estro) ci autorizza ad intraprendere un primo tentativo di accoppiamento (Feldman e Nelson, 1998).
Tipologie di cellule epiteliali ritrovabili nel secreto vaginale canino Cellule basali
Sono cellule piccole, rotondeggianti dalle quali derivano tutti i tipi di cellule dell’epitelio che si possono ritrovare nel secreto (Christie et al, 1972).
Dal momento che queste cellule si trovano a livello dello strato basale della membrana, di solito non vanno incontro ad esfoliazione e quindi si osservano raramente in seguito a striscio vaginale (Roszel, 1977).
Cellule parabasali
Sono le cellule epiteliali più piccole osservabili nel secreto vaginale; il loro diametro oscilla tra i 10 e i 20 µm (Concannon e Digregorio, 1986).
La forma può variare dal circolare all’ovalare [Fig.2].
Cellule intermedie
Cellule di varia grandezza, con diametro compreso tra i 20 e i 30 µm a margini irregolari o angolati (Olson, 1989) [Fig.3].
Figura n°3: Cellule epiteliali intermedie; Colorazione Diff Quik.
Cellule superficiali
Grandi cellule epiteliali, con diametro compreso tra i 30 e i 75 µm (Concannon, 1986; Olson,1989). La loro denominazione è dovuta alla posizione superficiale che vanno ad occupare a livello dell’epitelio della mucosa vaginale al momento della massima stimolazione da parte degli estrogeni. I margini della membrana citoplasmatica sono irregolari ed angolari, con nucleo picnotico se non addirittura indistinguibile dal citoplasma circostante (Roszel, 1977; Post,1985) [Fig.4].
Figura n°4: Cellule epiteliali superficiali; Colorazione Diff Quik.
Altre cellule ritrovabili nel secreto vaginale canino Globuli rossi
Possono essere presenti nelle secrezioni vaginali durante il proestro, l’estro o l’inizio del diestro. Durante il proestro la concentrazione sierica del 17-β-estradiolo aumenta con la maturazione del follicolo; questo aumento sembra essere responsabile della diapedesi delle emazie dal distretto capillare a livello uterino. Normalmente il numero di queste cellule è maggiore in cagne in fase proestrale rispetto a soggetti in estro o in diestro (Roszel, 1977).
Cellule della linea bianca
La popolazione più rappresentativa è costituita dai granulociti neutrofili, che si ritrovano numerosi in strisci ottenuti da cellule all’inizio della fase diestrale. Nel caso in cui queste cellule si
ritrovino in cagne in estro bisogna prendere in considerazione l’ipotesi di una possibile infezione vaginale o uterina (Roszel, 1977).
Cellule batteriche
Batteri vengono frequentemente ritrovati nelle secrezioni vaginali ottenute da cagne normali. Il loro numero aumenta in maniera notevole durante la fase proestrale rispetto a quanto si osserva in anestro, in gravidanza e durante il postpartum (Baba et al, 1983).
Metodica per ottenere, fissare e conservare le cellule vaginali
Le cellule esfoliate possono essere raccolte dalla vagina propriamente detta utilizzando un tampone sterile. Per evitare di raccogliere cellule ad esempio dalla fossa clitoridea è bene inserire il tampone in vagina mantenendo una direzione dorso-craniale per poi portarsi orizzontalmente appena raggiunta la volta vaginale [Fig.5].
Figura n°5: Rappresentazione grafica dell’anatomia delle vagina e del vestibolo della cagna
e dell’angolo appropriato per introdurre il tampone nel vestibolo e nella porzione caudale della vagina, evitando la fossa clitoridea e raggiungendo la vagina craniale.
Le cellule raccolte vengono poi trasferite dal tampone su di un vetrino, facendocelo rotolare delicatamente per evitare di danneggiare le cellule stesse [Fig.6].
Dopo questa operazione il veterinario ha a disposizione diversi tipi di colorazione tra i quali può scegliere. Il metodo più pratico, più rapido e più utilizzato prevede l’uso del colorante Diff-Quik; questo corrisponde ad un Wright-Giemsa modificato in grado di colorare efficacemente globuli rossi e cellule epiteliali.
Figura n°6: C e D: Veduta caudale della femmina da esaminare con dimostrazione del
giusto angolo di inserimento del tampone nel vestibolo e nella vagina (Olson PN, Thrall MA et al: Vaginal citology. Part 1. A useful tool for staging the canine estrous cycle. Compend Contin Educ Pract Vet 6: 288-298, 1984) E: Subito dopo la raccolta il tampone vaginale viene fatto rotolare delicatamente su di un vetrino.
Il vetrino, fatto asciugare all’aria e fissato in metanolo, deve essere successivamente immerso in due differenti coloranti e poi sciacquato delicatamente. Questi strisci si mantengoo inalterati per parecchi giorni, ma, nel caso si richieda conservazione protratta, sarà opportuno procedere a montaggio con balsamo e vetrino coprioggetto (Olson, 1989).
Altre colorazioni utilizzabili sono Wright-Giemsa e Nuovo Blu di metilene.
Il colorante di Wright è composto da blu di metilene, trattato a caldo con bicarbonato di sodio, con l’aggiunta di eosina; il Giemsa consiste, invece, di una miscela di azzurro II ed eosina. Il Nuovo Blu di metilene new è un colorante di pronto impiego, che richiede la deposizione di una goccia sul preparato e l’apposizione di un vetrino coprioggetto prima della lettura (Concannon et al, 1986).
Aspetto microscopico degli strisci Proestro
Le proporzioni tra i vari tipi cellulari variano nelle fasi del proestro, in particolare il numero delle emazie, che nelle fasi iniziali e finali può essere molto scarso. Nelle fasi iniziali predominano le cellule epiteliali nucleate, mentre negli stadi finali cala la percentuale di cellule parabasali e piccole intermedie e aumenta quella di cellule grandi intermedie e superficiali conrneificate con nuclei picnotici. I neutrofili sono presenti nelle fasi iniziali del proestro e diventano progressivamente meno numerosi man mano che ci si avvicina all’estro mentre i batteri possono essere presenti in numero
Figura n°7:
abbondante [Fig.7].
Striscio vaginale di una cagna in proestro. Sono presenti cellule epiteliali, prevalentemente intermedie, e numerosi eritrociti
Estro
el passaggio da proestro ad estro si assiste ad un notevole umento di cellule superficiali; quando queste raggiungono e
enti si parla di estro (Feldman e Nelson, 1998). Generalmente vi è totale assenza di leucociti e di emazie, sebbene talvolta queste ultime possano persistere per tutta la durata dell’estro. Le cellule cheratinizzate sono le più rappresentate; verso la fine dell’estro vanno incontro a degenerazione assumendo un aspetto assottigliato. Sono frequentemente osservate numerose cellule batteriche. In assenza di neutrofili, la presenza di numerosi batteri durante l’estro può essere considerato un reperto normale [Fig.8-9].
Figura n°8 N
a
superano l’80% dei tipi cellulari pres
: Striscio vaginale di una cagna in estro. Sono presenti cellule epiteliali superficiali in percentuale superiore all’80%.
Figura n°9: Striscio vaginale di una cagna a fine estro. Sono presenti ammassi di cellule
epiteliali superficiali.
Diestro
Vi è un repentino cambiamento dei tipi cellulari presenti: ricompaiono le cellule epiteliali parabasali ed intermedie e compaiono numerosi polimorfonucleati, soprattutto nelle prime settimane. Le emazie possono essere presenti nei primi giorni per tendere poi a scomparire [Fig.10].
Figura n°10: Striscio vaginale di una cagna in diestro. Sono presenti cellule epiteliali,
Anestro
Vi è una diminuzione dei polimorfonucleati che, comunque, possono restare sporadicamente presenti. Il numero delle cellule è comunque generalmente scarso.
Dosaggio del Progesterone ematico
lla concentrazione ematica di progesterone. Il cane è infatti l’unica tra le specie domestiche in cui la concentrazione ematica di progesterone inizia ad aumentare 2-3 giorni prima dell’ovulazione. Durante l’anestro e per buona parte del proestro il progesterone ematico è presente in quantità inferiore a 1 ng/ml [Tab.3]; questo valore aumenta in maniera rapida subito prima e durante il picco di LH e continua ad aumentare per tutta la durata dell’estro (Concannon, 1983; Concannon et al, 1989).
Al momento dell’ovulazione i livelli sierici di progesterone sono compresi tra 4 e 10 ng/ml (Manothaiudom et al, 1995) [Tab.3]; riuscendo, quindi, a dosare questo ormone possiamo individuare il momento migliore per l’accoppiamento o per la fecondazione artificiale che, generalmente, coincide con il secondo giorno dopo l’ovulazione.
Abbiamo accennato a come sia difficile da determinare il momento esatto dell’ovulazione nella cagna; questo però può essere stimato con il dosaggio de
Tabella n°3: Variazione del tasso ematico di progester
del ciclo, e in particolare, al momento dell’ovulazione (da Johnston SD et al, Serum one nella cagna rispetto al momento
progesterone timing of ovulation in the bitch, 1995).
TASSO EMATICO DI PROGESTERONE MOMENTO DEL CICLO ESTRALE
(ng/ml)
Da 1 a 1,9 - 3 gg dall’ovulazione
Da 3 a 3,9 - 1 g dall’ovulazione
> 10 con striscio cheratinizzato + 1 / + 5 gg dall’ovulazione (momento migliore per
monta naturale/inseminazione artificiale)
> 10 con striscio non cheratinizzato Diestro
< 1 Anestro – Proestro
Da 2 a 2,9 - 2 gg dall’ovulazione
Da 4 a 10 Ovulazione
La concentrazione sierica di progesterone può essere misurata sia con il metodo RIA (RadioImmunoAssay) sia con l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Figura n°11:Figura n°11:
Eventi fisiologici nella vita riproduttiva di una cagna
prendendo in considerazione i tempi, i tassi di progesterone
e di estrogeni e la citologia vaginale (Johnston SD, Root Ku
stritz MV, Olson PNS: Canine and Feline
Theriogenol 11:1, 2001, modificato)
Theriogenology,
J
Endoscopia vaginale
Come abbiamo già detto parlando della citologia vaginale, la mucosa vaginale, in quanto organo bersaglio degli ormoni della riproduzione, riflette i cambiamenti del loro livello ematico man mano che il ciclo estrale progredisce. L’osservazione di questi cambiamenti tramite endoscopia può rappresentare un metodo rapido ma utile a determinare il momento dell’ovulazione (Jeffcoate e Lindsay, 1989; Goodman 2001)
Durante il proestro la mucosa appare decisamente edematosa, in concomitanza con l’aumento del tasso estrogenico. Il lume vaginale è difficile da ispezionare e la superficie mucosale è liscia e lucida (Lindsay, 1983).
Con l’avvicinarsi della fase estrale, che coincide con un calo del tasso di estrogeni e un aumento del progesterone ematico, l’edema della mucosa tende a diminuire così come l’iperemia. Le pareti della vagina presentano pliche per la perdita di fluidi non accompagnata dalla retrazione repentina del tessuto vaginale, che rimane stirato. La mucosa mostra progressivamente sempre più pieghe e le pareti vaginali tendono a diminuire di spessore, a causa della diminuzione dell’edema. Questi segni sono massimi durante il periodo fertile, 4-7 giorni dopo il picco di LH (Lindsay, 1983).
Durante il diestro la mucosa appare appiattita e pallida. Dal momento che gli strati epiteliali protettivi tendono a diminuire, la mucosa diviene più friabile; frequentemente si possono osservare placche ed emorragie superficiali (Lindsay, 1983) [Fig.12].
Figura n°12: Immagini all’endoscopio della mucosa vaginale nelle fasi chiave del suo
sviluppo durante il ciclo della cagna (a) Proestro (b) Inizio dell’estro (c) Metà dell’estro (d) Manual of Small Animal Reproduction and Neonatology, 1998).
Protocollo per l’individuazione del momento dell’ovulazione
Tenendo sempre presente che nessuno dei metodi sopra citati garantisce l’assoluta accuratezza nell’individuazione del momento dell’ovulazione, questo protocollo prevede l’utilizzo di tutti gli strumenti diagnostici di cui il veterinario può disporre.
La cagna dovrebbe essere seguita a partire dalle prime manifestazioni della fase proestrale con un esame clinico. A questo potrà essere associato un primo controllo citologico e il dosaggio della concentrazione ematica di progesterone per valutarne il livello basale (Goodman, 2001).
L’esame citologico vaginale dovrebbe essere ripetuto ogni 2-4 giorni, fino ad evidenziare un aumento significativo (>70%) delle
Il test per valutare il progesterone ematico dovrebbe essere ripetuto a giorni alterni, fino al superamento dei 2 ng/ml. A questo punto, se la femmina accetta il maschio, è possibile cominciare a provare la monta a giorni alterni, fino ad un totale di 2-3 accoppiamenti completi (Goodman, 2001), anche se l’ideale è attendere il 2° giorno dopo il raggiungimento dei 4 ng/ml prima di effettuare l’accoppiamento, soprattutto se non è possibile ripeterlo.
cellule cheratinizzate. A questo punto sarebbe bene iniziare con i dosaggi ormonali (Goodman, 2001).
L’endoscopia vaginale può essere utilizzata per tutta la durata del ciclo e può risultare un buon ausilio, affiancata alla citologia e al dosaggio del progesterone, in caso di cicli inusuali.
L’ACCOPPIAMENTO
Insorgenza delle manifestazioni sessuali
Nei cuccioli di sesso maschile a sole 3-4 settimane di vita si possono gia rilevare atteggiamenti di tipo sessuale, consistenti in tentativi di simulazione del coito nei confronti dei fratelli di entrambi i sessi.
Tale comportamento è, invece, raro nelle femmine, che, in caso di tentativi di monta, restano di solito passive.
Naturalmente, a questa età, un tale comportamento è considerato solo un aspetto della normale attività ludica: si ritiene, però, che l’impossibilità di socializzazione con i propri simili possa condizionare marcatamente il successivo comportamento sessuale da adulto (Feldman e Nelson, 1998).
Accoppiamento
Normalmente il coito può essere preceduto da un corteggiamento protratto o più semplicemente da un breve annusamento e lambimento vulvare.
La femmina recettiva rivolge il treno posteriore al maschio in maniera caratteristica, immobilizzandosi e deviando lateralmente la coda ad ogni tentativo di monta. Il maschio si accinge
all’accoppiamento disponendo gli arti anteriori ai fianchi della mmina [Fig.13].
resenza nel maschio
de vaginale [Fig.14]. Alle spinte più intense farà
, 1991).
[Fig.15].
in tale posizione per 5-60 minuti (nodo interno).
nte dai fluidi prostatici (1-80 ml) (Johnston, fe
La penetrazione si realizza per tentativi; la p
del supporto osteo-cartilagineo permette l’introduzione del pene prima della completa erezione, che culminena con l’inturgidimento dei corpi cavernosi del bulbo del glande, una volta che questo sia stato accolto in se
seguito, entro 15-60 secondi, l’emissione di liquido prostatico (0,5-5 ml), ancora privo di spermatozoi (Johnston
Terminata la fase di eccitazione pelvica, il maschio, non potendo estrarre il glande dalla cavità vaginale, lascia la presa ai fianchi, tenta di appoggiare gli arti anteriori ad un lato della femmina e solleva un arto posteriore, facendolo passare sul dorso della cagna per raggiungere la posizione coda a coda
I soggetti restano
La frazione ricca di spermatozoi viene emessa nei primi 2-5 minuti (0,5-4 ml), mentre le fasi eiaculatorie successive saranno costituite esclusivame
Figura n°13: Due soggetti, stallone e fattrice, appartenenti alla razza Dogo Argentino
durante la fase iniziale di approccio.
Figura n°14: Due soggetti, stallone e fattrice, appartenenti alla razza Dogo Argentino
durante la fase di spinte che precedono l’inturgidimento dei corpi cavernosi del bulbo del glande.
Figura n°15: Due soggetti, stallone e fattrice, appartenenti alla razza Dogo Argentino
INSEMINAZIONE ARTIFICIALE
L’impiego dell’inseminazione artificiale riconosce diverse motivazioni, la principale delle quali è rappresentata dall’impossibilità di un accoppiamento naturale a causa di: impedimenti meccanici alla penetrazione, dolore al coito, patologie muscolo-scheletriche, sproporzione somatica tra i soggetti, inesperienza, aggressività reciproca.
Alcuni proprietari preferiscono ricorrere all’inseminazione artificiale anche per limitare il rischio di trasmissione di malattie ai
Può essere altresì utile ricorrere all’inseminazione artificiale nel caso in cui si preferisca trasportare il seme piuttosto che il riproduttore.
Prelievo del seme
danni dei propri animali.
Per la raccolta del seme si può ricorrere all’uso di vagine artificiali anche se la tecnica più utilizzata è tramite la manipolazione digitale del pene. Questa richiede di afferrare il pene semieretto e, in concomitanza dell’inizio dell’inturgidimento del bulbo, di far scorrere il sacco prepuziale caudalmente, esteriorizzando completamente l’organo copulatorio; mantenendo la mano dietro
al bulbo si applica una modesta pressione tanto da indurre ovimenti coitali e l’eiaculazione; in alcuni cani che si presentano
oito naturale molti
tore.
o, tipico della frazione ricca di sperma. La rosecuzione della raccolta porterebbe solamente ad un’inutile
one spermatica ad opera della terza frazione m
lenti nella risposta si può associare anche un massaggio dietro al bulbo, ottenendo così l’erezione e l’eiaculazione.
La presenza di una femmina in estro non è indispensabile, anche se, almeno per i soggetti abituati alla monta naturale, essa può rendere più agevoli tutte le operazioni [Fig.16].
Analogamente a quanto avviene nel corso del c
maschi tendono ad aggirare il braccio dell’operatore che, per continuare la raccolta dovrà semplicemente ribaltare il pene tra gli arti posteriori del riprodut
Di solito il prelievo viene effettuato per i primi 2-5 minuti, fino a che, cioè, il materiale eiaculato mantiene un colorito biancastro, denso, opac
p
diluizione della frazi di origine prostatica.
Nel caso in cui si voglia ricorrere all’utilizzo della vagina artificiale, che altro non è che un cono collettore in lattice al cui apice è posizionata una provetta, la tecnica è sostanzialmente la stessa descritta in precedenza per la manipolazione digitale. Tutte le manualità vengono però effettuate con il pene all’interno del cono.
Figura n° 16 : Prelievo del liquido seminale di un soggetto in presenza di una femmina in
and Neonatology, 1998).
estroSimpson GM, England GCW, Harvey M: BSAVA Manual of Small Animal Reproduction
Valutazione del seme
Per la valutazione del seme generalmente vengono prese in considerazione diverse caratteristiche macro e microscopiche come : il volume, il colore, l’aspetto e il pH dell’eiaculato, la motilità progressiva, la concentrazione, l’integrità della membrana plasmatica e la morfologia degli spermatozoi.
La qualità del seme raccolto può variare in base a quando e quanto spesso viene effettuato il prelievo, all’età del soggetto (cani molto giovani o molto anziani possono avere seme di qualità inferiore), ad eventuali patologie a carico del genitale ed alla razza (Takeishi et al, 1975). A quest’ultimo fattore è legato il numero
totale di spermatozoi presenti nell’eiaculato, che a sua volta
Saeger, Volume
dipende dai grammi di tessuto testicolare funzionale (Schubert e 1991; Saeger e Schubert, 1996) .
Normalmente il volume dell’eiaculato nella specie canina varia in un range che va da 1 ml agli 80 ml (Dubiel, 1976; Johnston, 1991) [Tab.4]. Il volume del materiale prelevato non è indicativo della qualità del seme, visto che dipende da quanta frazione prostatica
stata raccolta dall’operatore. è
Colore e Aspetto
Il colore dell’eiaculato dipende dalla concentrazione in spermi e di sostanze diverse. Normalmente il seme dall’eventuale presenza
canino è di colore bianco-grigiastro con aspetto opaco [Tab.4]; un colore giallo è indice di contaminazione con le urine o di presenza di essudato infiammatorio, che nel caso sia di tipo purulento, conferisce al materiale un colore verdastro. Il rosso testimonia presenza di sangue.
Un aspetto chiaro, trasparente può far nascere il sospetto che il soggetto sia oligo o azoospermico.
pH
Il pH di un normale eiaculato di cane è compreso tra 6,3 e 6,7 (Johnston, 1991) [Tab.4] e tende ad aumentare in caso di
zione del tratto uro-genitale. infiamma
Motilità progressiva
La percentuale di spermatozoi che presentano una motilità di tipo progressivo viene calcolata mettendo una goccia di seme non diluito su di un vetrino ed esaminandolo al microscopio ad un ingrandimento di 100 X. Normalmente questa percentuale si
l 70% o più e rappresenta l’indicatore più
he il pH delle soluzioni saline può ridurre la
ovo, presenti in molti diluenti può ridurne la velocità.
attesta attorno a
sensibile della qualità dell’eiaculato (Johnston, 1991) [Tab.4]. Una sua diminuzione può essere indice precoce di infezioni a carico del tratto genitale o di danni a livello testicolare.
Nel caso in cui il seme sia troppo concentrato possiamo diluirlo utilizzando liquido prostatico autologo, una soluzione di sodio citrato al 2,9% oppure un diluente appositamente preparato per il seme, ricordandoci c
percentuale di spermatozoi mobili, così come la presenza di sostanze viscose, quali il tuorlo d’u
Concentrazione/Numero totale di spermatozoi
eiaculati contenenti spermi, e dipende dalla quantità di liquido prostatico
ero totale Questo parametro non rappresenta da solo un indicatore della qualità del seme eccezion fatta per quei casi in cui ritroviamo una totale assenza di spermatozoi. Negli
la loro concentrazion
raccolto e può variare dai 4 ai 400 milioni per millilitro [Tab.4].
La concentrazione può essere stimata utilizzando la camera contaglobuli o lo spettrofotometro. Nel caso della camera contaglobuli il seme viene preventivamente diluito (diluizione 1:40) e trattato con sostanze che immobilizzano gli spermatozoi, quali soluzione di NaCl al 3% e formalina tamponata al 10%.
Moltiplicando la concentrazione di spermatozoi in milioni per il volume del liquido seminale in millilitri otteniamo il num
di spermi, che, in un normale eiaculato oscilla tra i 300 milioni e i 2 miliardi (Johnston, 1991) [Tab.4].
Un numero molto basso di spermatozoi può indicare un’alterata funzione testicolare.
Integrità della membrana plasmatica
L’integrità della membrana plasmatica è strettamente correlata con la vitalità degli spermatozoi e può essere valutata con diversi metodi, i più utilizzati dei quali sono il Test di rigonfiamento
ipo-osmotico (HOS-test) e l’utilizzo di colorazioni vitali quali
con
soluzione
una colorazione rosa, mentre la
n membrana integra (vivi).
generalmente attraverso lo l’eosina/nigrosina o colorazioni fluorescenti.
L’HOS-test può essere effettuato con diverse soluzioni (50-150 mOsm) e diluizioni. Generalmente prevede la diluizione di una parte di seme in dieci parti di soluzione ipo-osmotica, un’incubazione di 45-60 minuti a 37°C e l’osservazione
microscopio a contrasto di fase ad un ingrandimento di 400– 1000X; gli spermatozoi vivi presenteranno la coda arricciolata o ripiegata, mentre quelli morti avranno la coda dritta; questo perché la membrana plasmatica non integra non permetterà alla cellula di trattenere sali ed acqua e di equilibrarsi con la
ipo-osmotica extracellulare.
L’ eosina/nigrosina viene utilizzata in quanto l’eosina penetra negli spermatozoi che presentano la membrana plasmatica danneggiata (morti) conferendogli
nigrosina rende lo sfondo grigio-bluastro, sul quale risaltano bene gli spermi bianche co
Le colorazioni fluorescenti agiscono
stesso principio, ovvero tramite l’esclusione di alcuni coloranti da parte delle membrane plasmatiche integre.
Morfologia
La percentuale di spermatozoi morfologicamente normali in un
el testicolo o durante la maturazione normale eiaculato di cane dovrebbe essere maggiore o uguale all’80% [Tab.4]. Questa percentuale è correlata in maniera positiva con la percentuale relativa alla motilità progressiva (Ellington et al, 1993) .
La morfologia può essere valutata su seme fresco (spermi mobili), su preparati umidi (spermi immobili) o su strisci colorati (eosina/nigrosina, Diff-Quik o altre colorazioni).
Eventuali anomalie possono essere classificate secondo due criteri in primarie e secondarie, a seconda che abbiano origine durante la spermatogenesi n
e il trasporto nell’epididimo, o in maggiori e minori, prendendo in considerazione il loro effetto sulla fertilità del soggetto. Le anomalie morfologiche più frequentemente associate ad infertilità nel cane sono a carico del tratto intermedio o del suo punto di attacco.
Citologia
Un’altra indagine che possiamo compiere sull’eiaculato per rilevare eventuali problemi a carico dell’apparato genitale è l’esame citologico; di normale riscontro sono chiaramente gli spermatozoi maturi. Occasionalmente possiamo ritrovare batteri
che possono provenire dalla normale flora batterica presente sulla mucosa di pene e prepuzio e a livello dell’uretra distale, oltre a cellule epiteliali e globuli bianchi che possono avere la stessa origine. Batteri e globuli bianchi possono anche indicare la presenza di patologie a carico dell’apparato riproduttore [Tab.4]. Tabella n°4: Caratteristiche macr
(da Johnston SD et al, Canine and Feline Theriogenology, 2001, modificato). oscopiche e microscopiche di un seme normale di cane
Ia Frazione IIa Frazione IIIa Frazione Totale
Volume (ml) 0,5-5,0 1,0-4,0 1,0-80,0 2,5-80,0
PH - 6,3
Colore chiaro opalescente chiaro Opalescente
6,3-6,8 6,3-6,8
Motilità progressiva (%) - >70% - >70%
Concentrazione (106/ml) - 100-1000 - 4-400
N° totale di spermatozoi (10 /ml)6 - 300-2000 - 300-2000
Morfologia normale (%) - >80% - >80%
Conservazione del seme
Il seme di cane può essere refrigerato e mantenuto alla temperatura di 4°C per qualche giorno oppure può essere congelato e mantenuto in azoto liquido senza limiti di tempo. Solitamente agli spermatozoi vengono aggiunte delle sostanze che provvedono a fornire nutrienti, prevengono la crescita di batteri e tamponano il pH del seme (Concannon e Battista, 1989). Alcuni extenders possono essere utilizzati sia per il seme refrigerato che per quello congelato; nel caso del congelato
generalmente è richiesta l’aggiunta di sostanze crioprotettrici come il glicerolo o il tuorlo d’uovo. Quest’ultimo contiene lipidi ad elevato peso molecolare che, essendo igroscopici, non entrano nella cellula spermatica ma creano uno spazio all’esterno che permette il congelamento senza recare danni agli spermatozoi. Il
ò entrare nella cellula legando l’acqua limitando, così, la formazione di ghiaccio intracellulare ed aiutando la lenta disidratazione degli spermi (Sm 1984).
Glucosio, destrosio e lattosio vengono solitamente utilizzati come
el caso del seme congelato, dopo la raccolta l’eiaculato viene centrifugato e la frazione ricca di spermi addizionata del diluente. Dopodichè si sottopone il liquido ad un primo raffreddamento lento fino alla temperatura di refrigerazione (equilibratura), per ridurre eventuali danni dovuti allo shock termico. Una volta terminato il tempo di equilibratura il seme verrà congelato, procedendo comunque con un graduale abbassamento di temperatura, fino ad arrivare ad un valore che ne permetterà la conservazione sotto azoto liquido.
glicerolo invece ha un peso molecolare basso e quindi pu
ith,
fonte di energia. N
Inseminazione con seme fresco
L’utilizzo del seme fresco è indicato in quegli animali che non possono portare a termina una monta naturale e il successo nel suo utilizzo dipende da tre fattori: la qualità del seme, l’accuratezza nella scelta del giorno dell’inseminazione e il sito di deposizione del liquido seminale.
Nella maggior parte dei casi l’inseminazione con seme fresco viene fatta utilizzando tutto l’eiaculato, che contiene dai 250 ai 2500 x 106 spermatozoi; la dose minima suggerita dovrebbe in
ccolta del seme sarebbe bene raggiungere un
ella commissura dorsale delle labbra vulvari e diretto cranio dorsalmente fino all’arco ischiatico, una volta raggiunto il quale viene mantenuta una direzione ogni caso far registrare più di 150 x 106 spermi mobili. Al momento della ra
volume complessivo (frazione prostatica e frazione spermatica) pari a 2-4 ml (Johnston et al, 2001).
Per l’operazione si utilizza un catetere sterile da inseminazione o un catetere uretrale non spermiotossico, ai quali viene raccordata una siringa da 5 ml o da 10 ml, a seconda della quantità di eiaculato raccolta. Prima di aspirare la dose inseminante è buona norma aspirare 1-2 ml di aria, che servirà a svuotare completamente il catetere (Johnston et al, 2001) .
craniale. Il sito di deposizione appropriato del seme fresco è a
atetere lateralmente a questo.
Figura n°17:
livello dell’ostio cervicale esterno (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989) [Fig.17].
A volte, soprattutto se si utilizza un catetere uretrale flessibile, la manualità è resa più semplice inserendo in vagina un dito munito di guanto e facendo scorrere il c
Una volta depositato il seme si estrae il catetere; in alcuni casi può essere utile stimolare con il dito la volta della vagina per evocare le contrazioni del tratto genitale.
Posizione da assumere con il catetere durante l’inseminazione artificiale con cervicale esterno. (Johnston SD, Root Kustritz MV, Olson PNS: Canine and Feline Theriogenology, J Soc Theriogenol 11:1, 2001)
È buona norma tenere il quarto posteriore della cagna sollevato per almeno 10 minuti per facilitare il passaggio del seme attraverso l’ostio cervicale e per minimizzare le perdite di liquido seminale.
Inseminazione con seme refrigerato
Le manualità da compiere per inseminare una cagna con seme refrigerato ricalcano esattamente quelle descritte per
per 12-24 ore. (Linde-l’inseminazione con il seme fresco [Fig.17]. La differenza sostanziale sta nel fatto che il seme utilizzato è, appunto, refrigerato e nella maggior parte dei casi addizionato di sostanze che ne prolungano la durata e ne facilitano il trasporto a distanza. Un seme di buona qualità se refrigerato utilizzando i diluenti giusti mantiene la propria capacità fecondante
Forsberg, 1995).
Inseminazione con seme congelato
Il congelamento del seme canino sta acquistando importanza con il passare del tempo in quanto permette di conservare il materiale genetico per un tempo indefinito, permette il trasporto del seme anche a migliaia di chilometri di distanza e soprattutto permette di continuare ad usare un buon riproduttore anche dopo la sua morte.
La buona riuscita di un’inseminazione con seme congelato è condizionata, oltre che dai fattori che influenzano l’IA con seme fresco e refrigerato, anche dalla procedura di raccolta, dal tipo di diluente utilizzato, dal congelamento, dalla conservazione, dal
trasporto, dallo scongelamento e dalla tecnica di inseminazione
che gli spermatozoi, una volta scongelata la ose, hanno un tempo di vita residuo molto limitato; in generale si
4° giorno post-ovulazione,
agna sono riportati due metodi per l’inseminazione con stessa.
Il seme di cane può essere congelato sia in pellets che in paillettes, solitamente da 0,5 ml ma occasionalmente anche da 0,25ml. Solitamente viene preferito il congelamento in paillettes in quanto i pellets presentano numerosi svantaggi, quali la difficoltà nell’identificazione e la possibilità di contaminazione da parte di spermatozoi di altri pellets (Linde-Forsberg, 1995).
Molta importanza acquista il momento dell’inseminazione considerato il fatto
d
raccomanda di coprire la cagna al
3°-per assicurare la presenza di oociti secondari nelle tube uterine. Normalmente le paillettes contenenti 0,5 ml di seme vengono scongelate a 37°C a bagnomaria per 15-60 secondi mentre le mini-paillettes possono essere scongelate a 75°C per 5 secondi (Andersen, 1980)
Nella c
seme congelato: uno prevede la deposizione del seme nel lume uterino dopo aver attraversato la cervice mentre l’altro richiede un intervento chirurgico con inseminazione attraverso la parete dell’utero per via laparotomica o laparoscopica. In ogni caso il sito
di deposizione appropriato per il seme congelato risulta essere il lume dell’utero, vista l’incidenza negativa che ha la tecnica di
so la parete
i
nea mediana, della lunghezza di 5 cm, a partire congelamento e di scongelamento sulla motilità degli spermatozoi (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989) (Concannon e Battista, 1989). Per quanto riguarda la tecnica transcervicale sono riportati due modus operandi; il primo prevede l’utilizzo di un catetere di acciaio lungo 20-50 cm e con l’estremità del diametro di 0,5-1,0 mm. L’operatore deve spingere la cervice ver
addominale applicando una certa trazione in modo da distendere il canale cervicale, facilitando così la penetrazione e il passaggio del catetere tramite il quale verrà poi deposto il seme preventivamente scongelato (Linde-Forsberg, 1991) [Fig.18].
Per il secondo tipo di inseminazione transcervicale l’operatore s avvale dell’ausilio di un endoscopio per visualizzare la cervice e attraversarla con un catetere urinario (Wilson, 1993).
L’inseminazione “chirurgica” comporta che venga effettuata un’incisione sulla li
dall’ombelico fino al bordo della pelvi; da questa breccia viene identificato ed esteriorizzato l’utero. Il chirurgo, tenendo saldamente l’utero, ne penetra la parete, in direzione obliqua, con un ago sterile da 22G montato su una siringa da 2,5 ml o da 5 ml, preventivamente caricata con la dose inseminante. Inizialmente si
inietta una piccola quantità di seme per osservare il riempirsi del lume uterino e per escludere eventuali perdite; una volta assicuratisi che l’organo tende a mantenere il liquido all’interno viene inoculato il resto del seme (Smith, 1984). Generalmente questo tipo di intervento richiede un’anestesia della durata di circa 20 minuti. La breccia laparotomica può essere ridotta usando la laparoscopia (Silva et al, 1995).
Figura n°18: A: Rappresentazione
vagina e cervice di cagna durante intreuterina utilizzando catetere rigido, con seme congelato B: Per la cervice può essere tenuta f con pollice e indice attravers grafica della sezione sagittale di
inseminazione artificiale facilitare il passaggio del catetere,
erma o la parete addominale (Johnston SD, J Soc Theriogenol 11:1, 2001). Root Kustritz MV, Olson PNS: Canine and Feline Theriogenology,
LA GRAVIDANZA
Durata della gravidanza
Il tradizionale calcolo di 63 giorni dal primo accoppiamento non è un metodo preciso per prevedere la data del parto, dal momento che la variabilità della durata della gravidanza, in base a quest’unico dato, oscilla fra i 57 e i 72 giorni. In base a studi relativamente recenti è stato osservato che il parto si ha
di LH, 63 dopo l’ovulazione e c
d
Profilo endocrino
mediamente 65 giorni dopo il picco 57 dopo l’inizio del diestro secondo la variabilità minima. La durata della gravi
dell’ovulazione, è infatti di 63 ± 1 giorni (Holst e Phemister, 1974b).
itologia vaginale, con una anza, calcolata dal giorno
Progesterone
La presenza di corpi lutei a livello ovarico risulta essenziale per il normale decorso della gravidanza, considerato che nel cane la secrezione di progesterone dipende solo da queste strutture. Quest’ormone è di fondamentale importanza per il trofismo e la funzionalità delle ghiandole endometriali, per l’inibizione della contrattilità uterina, per l’abbassamento delle difese immunitarie a
livello locale e per il mantenimento dei normali rapporti utero-lacentari. ne la concentrazione ematica di za (Nett et al, 1975). strogeni p
Nel giorno dell’ovulazio
progesterone di circa 5 ng/ml incrementa progressivamente e dal 10°-15° giorno supera i 25 ng/ml. Raggiunto il tasso massimo, la progesteronemia rimane costante per 1-2 settimane, prima di iniziare una lenta e graduale discesa per il resto della gravidanza, che la porterà a 48-36 ore dal parto a livelli inferiori ai 2 ng/ml (Concannon et al, 1975).
La concentrazione di progesterone ematico di una cagna gravida è comunque molto simile a quella di una cagna non gravida in diestro e quindi non può essere utilizzata per la diagnosi di gravidan
E
-6 settimane di gestazione la concentrazione estrogeni permane a livello basale, similmente a Durante le prime 5
plasmatica di
quanto accade in diestro. Con il passare del tempo il tasso estrogenico tende ad aumentare e a mantenersi elevata fino al parto, in concomitanza del quale tende a ridursi (Chakraborty, 1987).
Il ruolo di questi ormoni è quello di favorire lo sviluppo della ghiandola mammaria e il rilasciamento della cervice, oltre ad
entrare a far parte del meccanismo endocrino che determina il parto.
Prolattina
Durante l’ultima settimana di gravidanza questo ormone secreto dall’ipofisi comincia lentamente ad aumentare in circolo raggiungendo il livello massimo durante le 16-56 ore prepartum. La concentrazione diminuisce, poi, nelle 36 ore che seguono il picco, per aumentare nuovamente in risposta alla stimolazione da parte dei neonati (Concannon et al, 1978).
Relaxina
Nelle cagne gravide quest’ormone raggiunge la massima concentrazione di 4-6 ng/ml, 2-3 settimane prima del parto, a volte diminuisce lievemente immediatamente prima e si ritrova
mo per le 4-9 settimane successive a livelli di 0,5-2,0
non gravide (Steinez et al, 1987). nell’organis
ng/ml.
Mentre gli ormoni citati finora non sono indicativi di gravidanza, il dosaggio della relaxina può essere considerato un vero e proprio test di gravidanza, in quanto la concentrazione risulta elevata esclusivamente in femmine positive, ed è bassa nelle cagne in diestro,
Evoluzione della gravidanza
La fertilizzazione ha luogo a livello salpingeo; gli zigoti arrivano in olta raggiunto lo stadio di 16 blastomeri, intorno
all’8°-igrazione transuterina rioni che si verifica prima dell’impianto, oltre che per il
fetale. Il circolo fetale e materno sono separati da soli
rafica dei villi coriali, la placenta canina viene definita come zonata; le digitazioni si dispongono a formare una banda tutta attorno ad ogni sacco. utero una v
12° giorno (Holst et al, 1971).
A 17-18 giorni dalla fertilizzazione, nell’endometrio si evidenziano focolai edematosi in corrispondenza delle sedi di impianto, che si realizzerà tra il 17° e il 21° giorno. Il numero dei corpi lutei presenti su di un’ovaia e il numero dei feti nel corno omolaterale possono non coincidere a causa della m
degli emb
possibile riassorbimento di alcune vescicole embrionali (Evans, 1974).
La cagna ha una placenta di tipo endotelio-coriale, il chè sta a significare che l’endotelio dei vasi uterini è in stretto contatto con il corion
quattro strati: endotelio dei vasi uterini materni, il corion, il mesenchima e l’endotelio fetale. Nel cane, comunque, solo il 5-10% delle immunoglobuline totali vengono trasferite dalla femmina alla prole per via transplacentare.
Vengono sempre osservati i così detti ematomi placentari,
a fungere da risorsa di ferro per il
ecograficamente il battito cardiaco dell’embrione, mentre riconoscibili come zone di colore verde-marrone ai margini della banda di corion frondoso. Questi ematomi sono dati da sangue materno stagnante che sembr
feto in via di sviluppo. Questo pigmento (uteroverdina) durante e subito dopo il parto, può ritrovarsi all’esterno ad imbrattare il perineo e la vulva materni, in seguito al distacco della placenta materna da quella dei cuccioli in fase di espulsione (Roberts, 1986a).
Il processo adesivo tra parete uterina e struttura placentare avviene attorno al 22° giorno, momento in cui può già essere visibile
dal 32° in poi saranno già riconoscibili alcune caratteristiche somatiche peculiari [Fig.23]. Le prime aree di mineralizzazione radiograficamente evidenti faranno la loro comparsa dopo 42-45 giorni di gestazione (England, 1998).
Diagnosi di gravidanza
Palpazione transaddominale
Nella cagna gli embrioni e le vescicole formano una serie di rigonfiamenti ovalari distribuiti a corona di rosario lungo le corna uterine, palpabili a partire dal 26° giorno postovulazione. A partire
dal 35° giorno questi rigonfiamenti, ormai aumentati di volume e allungati (così come avviene alle vescicole), rendono l’utero uniformemente ingrossato e le strutture fetali difficilmente distinguibili. Parti fetali saranno ben percepibili dal 55° giorno, quando l’utero tenderà a perdere nuovamente l’aspetto uniformemente ingrossato e la quantità di liquidi sarà relativamente ridotta. Generalmente il periodo migliore per la palpazione transaddominale nella cagna è compreso tra il 28° e il 30° giorno dopo l’ovulazione (Whitney, 1936; England 1998).
Reperti radiografici
Nei feti la calcificazione a livello del cranio e del rachide comincia 43-46 giorni dopo il picco di LH, ovvero 20-22 giorni prima del parto (Rendano et al, 1984).
L’uso della radiografia in cagne a termine può essere d’aiuto per valutare la quantità di cuccioli presenti e le dimensioni delle teste rispetto a quella del canale del parto. Il numero viene facilmente eterminato contando le immagini delle strutture craniche. Il
one dell’architettura scheletrica risulta d
collasso e la disgregazi indicativa di morte fetale.
Ecografia
Questa tecnica permette di riconoscere la gravidanza a partire dal 16°-20° giorno [Fig.19-25]. L’uso dell’ecografia permette di stabilire la presenza di vescicole in tempi molto precoci, ma è piuttosto difficile il conteggio accurato degli embrioni o feti presenti, ancor più se la gravidanza è avanzata. Questo perché possiamo visionare un settore addominale alla volta; c’è quindi il rischio che una vescicola o un feto venga contato due volte o non venga del tutto visto (Shille e Gontarek, 1985; Yeager et al, 1992).
Figura n°19: Immagine ecografica di una vescicola embrionale a circa 23 giorni di
Figura n°20: Immagine ecografica di tre vescicole embrionali a circa 25 giorni di gravidanza
Figura n°21:
in una cagna di razza West Highland white terrier.
Immagine ecografia di una vescicola embrionale a circa 29 giorni di gravidanza una cagna di razza Dogo Argentino.
°22: Immagine ecografica di quattro vescicole embrionali a circa 30-31 giorni di igura n
F
gestazione in una cagna di razza West Highland white terrier.
Figura n°23: Immagine ecografica di una vescicola contenente embrione a circa 32 giorni di
Figura n°24:
vescicole embrionali a circa 35 giorni gestazione in una cagna di
Argentino.
Immagini ecografiche di di razza Dogo
Figura n°25: Immagini ecografiche di un torace
in cui sono ben visibili la gabbia toracica e il cuore, a 55 giorni di gestazione (7 giorni dal parto) in una cagna di razza Dogo Argentino. di feto
Segni secondari di gravidanza
I segni secondari di gravidanza possono rappresentare un’ulteriore conferma allo stato della cagna diagnosticato con i metodi sopra riportati. Presi singolarmente, però non sono indicativi in quanto alcuni di questi segni sono anche caratteristici della pseudogravidanza o di stati patologici.
Aumento del volume addominale
Comincia ad essere evidente verso la quinta settimana di gravidanza. Dopo la sesta settimana l’aumento, che dipende dalle dimensioni della cucciolata, si rende ben visibile e diviene progressivo fino alla settimana che precede il parto. Durante gli ultimi sette giorni si assiste di solit
tesso (Holst, 1985).
o ad una discesa dell’addome
gravida appare più grande, ella di una cagna in diestro
e sono più o meno sempre ominciano a rendersi evidenti to. Qualsiasi traccia di muco s
Aspetto della vulva
olitamente la vulva di una cag
S na
ilassata ed elastica rispetto a qu olst, 1985) .
erdite vaginali r
(H P
erdite di muco chiaro e inodor resenti nella femmina gravida e c -5 settimane dopo l’accoppiamen P
p 4
