L’impiego dell’inseminazione artificiale riconosce diverse motivazioni, la principale delle quali è rappresentata dall’impossibilità di un accoppiamento naturale a causa di: impedimenti meccanici alla penetrazione, dolore al coito, patologie muscolo-scheletriche, sproporzione somatica tra i soggetti, inesperienza, aggressività reciproca.
Alcuni proprietari preferiscono ricorrere all’inseminazione artificiale anche per limitare il rischio di trasmissione di malattie ai
Può essere altresì utile ricorrere all’inseminazione artificiale nel caso in cui si preferisca trasportare il seme piuttosto che il riproduttore.
Prelievo del seme
danni dei propri animali.
Per la raccolta del seme si può ricorrere all’uso di vagine artificiali anche se la tecnica più utilizzata è tramite la manipolazione digitale del pene. Questa richiede di afferrare il pene semieretto e, in concomitanza dell’inizio dell’inturgidimento del bulbo, di far scorrere il sacco prepuziale caudalmente, esteriorizzando completamente l’organo copulatorio; mantenendo la mano dietro
al bulbo si applica una modesta pressione tanto da indurre ovimenti coitali e l’eiaculazione; in alcuni cani che si presentano
oito naturale molti
tore.
o, tipico della frazione ricca di sperma. La rosecuzione della raccolta porterebbe solamente ad un’inutile
one spermatica ad opera della terza frazione m
lenti nella risposta si può associare anche un massaggio dietro al bulbo, ottenendo così l’erezione e l’eiaculazione.
La presenza di una femmina in estro non è indispensabile, anche se, almeno per i soggetti abituati alla monta naturale, essa può rendere più agevoli tutte le operazioni [Fig.16].
Analogamente a quanto avviene nel corso del c
maschi tendono ad aggirare il braccio dell’operatore che, per continuare la raccolta dovrà semplicemente ribaltare il pene tra gli arti posteriori del riprodut
Di solito il prelievo viene effettuato per i primi 2-5 minuti, fino a che, cioè, il materiale eiaculato mantiene un colorito biancastro, denso, opac
p
diluizione della frazi di origine prostatica.
Nel caso in cui si voglia ricorrere all’utilizzo della vagina artificiale, che altro non è che un cono collettore in lattice al cui apice è posizionata una provetta, la tecnica è sostanzialmente la stessa descritta in precedenza per la manipolazione digitale. Tutte le manualità vengono però effettuate con il pene all’interno del cono.
Figura n° 16 : Prelievo del liquido seminale di un soggetto in presenza di una femmina in
and Neonatology, 1998).
estroSimpson GM, England GCW, Harvey M: BSAVA Manual of Small Animal Reproduction
Valutazione del seme
Per la valutazione del seme generalmente vengono prese in considerazione diverse caratteristiche macro e microscopiche come : il volume, il colore, l’aspetto e il pH dell’eiaculato, la motilità progressiva, la concentrazione, l’integrità della membrana plasmatica e la morfologia degli spermatozoi.
La qualità del seme raccolto può variare in base a quando e quanto spesso viene effettuato il prelievo, all’età del soggetto (cani molto giovani o molto anziani possono avere seme di qualità inferiore), ad eventuali patologie a carico del genitale ed alla razza (Takeishi et al, 1975). A quest’ultimo fattore è legato il numero
totale di spermatozoi presenti nell’eiaculato, che a sua volta
Saeger, Volume
dipende dai grammi di tessuto testicolare funzionale (Schubert e 1991; Saeger e Schubert, 1996) .
Normalmente il volume dell’eiaculato nella specie canina varia in un range che va da 1 ml agli 80 ml (Dubiel, 1976; Johnston, 1991) [Tab.4]. Il volume del materiale prelevato non è indicativo della qualità del seme, visto che dipende da quanta frazione prostatica
stata raccolta dall’operatore. è
Colore e Aspetto
Il colore dell’eiaculato dipende dalla concentrazione in spermi e di sostanze diverse. Normalmente il seme dall’eventuale presenza
canino è di colore bianco-grigiastro con aspetto opaco [Tab.4]; un colore giallo è indice di contaminazione con le urine o di presenza di essudato infiammatorio, che nel caso sia di tipo purulento, conferisce al materiale un colore verdastro. Il rosso testimonia presenza di sangue.
Un aspetto chiaro, trasparente può far nascere il sospetto che il soggetto sia oligo o azoospermico.
pH
Il pH di un normale eiaculato di cane è compreso tra 6,3 e 6,7 (Johnston, 1991) [Tab.4] e tende ad aumentare in caso di
zione del tratto uro-genitale. infiamma
Motilità progressiva
La percentuale di spermatozoi che presentano una motilità di tipo progressivo viene calcolata mettendo una goccia di seme non diluito su di un vetrino ed esaminandolo al microscopio ad un ingrandimento di 100 X. Normalmente questa percentuale si
l 70% o più e rappresenta l’indicatore più
he il pH delle soluzioni saline può ridurre la
ovo, presenti in molti diluenti può ridurne la velocità.
attesta attorno a
sensibile della qualità dell’eiaculato (Johnston, 1991) [Tab.4]. Una sua diminuzione può essere indice precoce di infezioni a carico del tratto genitale o di danni a livello testicolare.
Nel caso in cui il seme sia troppo concentrato possiamo diluirlo utilizzando liquido prostatico autologo, una soluzione di sodio citrato al 2,9% oppure un diluente appositamente preparato per il seme, ricordandoci c
percentuale di spermatozoi mobili, così come la presenza di sostanze viscose, quali il tuorlo d’u
Concentrazione/Numero totale di spermatozoi
eiaculati contenenti spermi, e dipende dalla quantità di liquido prostatico
ero totale Questo parametro non rappresenta da solo un indicatore della qualità del seme eccezion fatta per quei casi in cui ritroviamo una totale assenza di spermatozoi. Negli
la loro concentrazion
raccolto e può variare dai 4 ai 400 milioni per millilitro [Tab.4].
La concentrazione può essere stimata utilizzando la camera contaglobuli o lo spettrofotometro. Nel caso della camera contaglobuli il seme viene preventivamente diluito (diluizione 1:40) e trattato con sostanze che immobilizzano gli spermatozoi, quali soluzione di NaCl al 3% e formalina tamponata al 10%.
Moltiplicando la concentrazione di spermatozoi in milioni per il volume del liquido seminale in millilitri otteniamo il num
di spermi, che, in un normale eiaculato oscilla tra i 300 milioni e i 2 miliardi (Johnston, 1991) [Tab.4].
Un numero molto basso di spermatozoi può indicare un’alterata funzione testicolare.
Integrità della membrana plasmatica
L’integrità della membrana plasmatica è strettamente correlata con la vitalità degli spermatozoi e può essere valutata con diversi metodi, i più utilizzati dei quali sono il Test di rigonfiamento ipo-
osmotico (HOS-test) e l’utilizzo di colorazioni vitali quali
con
soluzione
una colorazione rosa, mentre la
n membrana integra (vivi).
generalmente attraverso lo l’eosina/nigrosina o colorazioni fluorescenti.
L’HOS-test può essere effettuato con diverse soluzioni (50-150 mOsm) e diluizioni. Generalmente prevede la diluizione di una parte di seme in dieci parti di soluzione ipo-osmotica, un’incubazione di 45-60 minuti a 37°C e l’osservazione
microscopio a contrasto di fase ad un ingrandimento di 400– 1000X; gli spermatozoi vivi presenteranno la coda arricciolata o ripiegata, mentre quelli morti avranno la coda dritta; questo perché la membrana plasmatica non integra non permetterà alla cellula di trattenere sali ed acqua e di equilibrarsi con la
ipo-osmotica extracellulare.
L’ eosina/nigrosina viene utilizzata in quanto l’eosina penetra negli spermatozoi che presentano la membrana plasmatica danneggiata (morti) conferendogli
nigrosina rende lo sfondo grigio-bluastro, sul quale risaltano bene gli spermi bianche co
Le colorazioni fluorescenti agiscono
stesso principio, ovvero tramite l’esclusione di alcuni coloranti da parte delle membrane plasmatiche integre.
Morfologia
La percentuale di spermatozoi morfologicamente normali in un
el testicolo o durante la maturazione normale eiaculato di cane dovrebbe essere maggiore o uguale all’80% [Tab.4]. Questa percentuale è correlata in maniera positiva con la percentuale relativa alla motilità progressiva (Ellington et al, 1993) .
La morfologia può essere valutata su seme fresco (spermi mobili), su preparati umidi (spermi immobili) o su strisci colorati (eosina/nigrosina, Diff-Quik o altre colorazioni).
Eventuali anomalie possono essere classificate secondo due criteri in primarie e secondarie, a seconda che abbiano origine durante la spermatogenesi n
e il trasporto nell’epididimo, o in maggiori e minori, prendendo in considerazione il loro effetto sulla fertilità del soggetto. Le anomalie morfologiche più frequentemente associate ad infertilità nel cane sono a carico del tratto intermedio o del suo punto di attacco.
Citologia
Un’altra indagine che possiamo compiere sull’eiaculato per rilevare eventuali problemi a carico dell’apparato genitale è l’esame citologico; di normale riscontro sono chiaramente gli spermatozoi maturi. Occasionalmente possiamo ritrovare batteri
che possono provenire dalla normale flora batterica presente sulla mucosa di pene e prepuzio e a livello dell’uretra distale, oltre a cellule epiteliali e globuli bianchi che possono avere la stessa origine. Batteri e globuli bianchi possono anche indicare la presenza di patologie a carico dell’apparato riproduttore [Tab.4]. Tabella n°4: Caratteristiche macr
(da Johnston SD et al, Canine and Feline Theriogenology, 2001, modificato). oscopiche e microscopiche di un seme normale di cane
Ia Frazione IIa Frazione IIIa Frazione Totale
Volume (ml) 0,5-5,0 1,0-4,0 1,0-80,0 2,5-80,0
PH - 6,3
Colore chiaro opalescente chiaro Opalescente
6,3-6,8 6,3-6,8
Motilità progressiva (%) - >70% - >70%
Concentrazione (106/ml) - 100-1000 - 4-400
N° totale di spermatozoi (10 /ml)6 - 300-2000 - 300-2000
Morfologia normale (%) - >80% - >80%
Conservazione del seme
Il seme di cane può essere refrigerato e mantenuto alla temperatura di 4°C per qualche giorno oppure può essere congelato e mantenuto in azoto liquido senza limiti di tempo. Solitamente agli spermatozoi vengono aggiunte delle sostanze che provvedono a fornire nutrienti, prevengono la crescita di batteri e tamponano il pH del seme (Concannon e Battista, 1989). Alcuni extenders possono essere utilizzati sia per il seme refrigerato che per quello congelato; nel caso del congelato
generalmente è richiesta l’aggiunta di sostanze crioprotettrici come il glicerolo o il tuorlo d’uovo. Quest’ultimo contiene lipidi ad elevato peso molecolare che, essendo igroscopici, non entrano nella cellula spermatica ma creano uno spazio all’esterno che permette il congelamento senza recare danni agli spermatozoi. Il
ò entrare nella cellula legando l’acqua limitando, così, la formazione di ghiaccio intracellulare ed aiutando la lenta disidratazione degli spermi (Sm 1984).
Glucosio, destrosio e lattosio vengono solitamente utilizzati come
el caso del seme congelato, dopo la raccolta l’eiaculato viene centrifugato e la frazione ricca di spermi addizionata del diluente. Dopodichè si sottopone il liquido ad un primo raffreddamento lento fino alla temperatura di refrigerazione (equilibratura), per ridurre eventuali danni dovuti allo shock termico. Una volta terminato il tempo di equilibratura il seme verrà congelato, procedendo comunque con un graduale abbassamento di temperatura, fino ad arrivare ad un valore che ne permetterà la conservazione sotto azoto liquido.
glicerolo invece ha un peso molecolare basso e quindi pu
ith,
fonte di energia. N
Inseminazione con seme fresco
L’utilizzo del seme fresco è indicato in quegli animali che non possono portare a termina una monta naturale e il successo nel suo utilizzo dipende da tre fattori: la qualità del seme, l’accuratezza nella scelta del giorno dell’inseminazione e il sito di deposizione del liquido seminale.
Nella maggior parte dei casi l’inseminazione con seme fresco viene fatta utilizzando tutto l’eiaculato, che contiene dai 250 ai 2500 x 106 spermatozoi; la dose minima suggerita dovrebbe in
ccolta del seme sarebbe bene raggiungere un
ella commissura dorsale delle labbra vulvari e diretto cranio dorsalmente fino all’arco ischiatico, una volta raggiunto il quale viene mantenuta una direzione ogni caso far registrare più di 150 x 106 spermi mobili. Al momento della ra
volume complessivo (frazione prostatica e frazione spermatica) pari a 2-4 ml (Johnston et al, 2001).
Per l’operazione si utilizza un catetere sterile da inseminazione o un catetere uretrale non spermiotossico, ai quali viene raccordata una siringa da 5 ml o da 10 ml, a seconda della quantità di eiaculato raccolta. Prima di aspirare la dose inseminante è buona norma aspirare 1-2 ml di aria, che servirà a svuotare completamente il catetere (Johnston et al, 2001) .
craniale. Il sito di deposizione appropriato del seme fresco è a
atetere lateralmente a questo.
Figura n°17:
livello dell’ostio cervicale esterno (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989) [Fig.17].
A volte, soprattutto se si utilizza un catetere uretrale flessibile, la manualità è resa più semplice inserendo in vagina un dito munito di guanto e facendo scorrere il c
Una volta depositato il seme si estrae il catetere; in alcuni casi può essere utile stimolare con il dito la volta della vagina per evocare le contrazioni del tratto genitale.
Posizione da assumere con il catetere durante l’inseminazione artificiale con cervicale esterno. (Johnston SD, Root Kustritz MV, Olson PNS: Canine and Feline Theriogenology, J Soc Theriogenol 11:1, 2001)
È buona norma tenere il quarto posteriore della cagna sollevato per almeno 10 minuti per facilitare il passaggio del seme attraverso l’ostio cervicale e per minimizzare le perdite di liquido seminale.
Inseminazione con seme refrigerato
Le manualità da compiere per inseminare una cagna con seme refrigerato ricalcano esattamente quelle descritte per
per 12-24 ore. (Linde- l’inseminazione con il seme fresco [Fig.17]. La differenza sostanziale sta nel fatto che il seme utilizzato è, appunto, refrigerato e nella maggior parte dei casi addizionato di sostanze che ne prolungano la durata e ne facilitano il trasporto a distanza. Un seme di buona qualità se refrigerato utilizzando i diluenti giusti mantiene la propria capacità fecondante
Forsberg, 1995).
Inseminazione con seme congelato
Il congelamento del seme canino sta acquistando importanza con il passare del tempo in quanto permette di conservare il materiale genetico per un tempo indefinito, permette il trasporto del seme anche a migliaia di chilometri di distanza e soprattutto permette di continuare ad usare un buon riproduttore anche dopo la sua morte.
La buona riuscita di un’inseminazione con seme congelato è condizionata, oltre che dai fattori che influenzano l’IA con seme fresco e refrigerato, anche dalla procedura di raccolta, dal tipo di diluente utilizzato, dal congelamento, dalla conservazione, dal
trasporto, dallo scongelamento e dalla tecnica di inseminazione
che gli spermatozoi, una volta scongelata la ose, hanno un tempo di vita residuo molto limitato; in generale si
4° giorno post-ovulazione,
agna sono riportati due metodi per l’inseminazione con stessa.
Il seme di cane può essere congelato sia in pellets che in paillettes, solitamente da 0,5 ml ma occasionalmente anche da 0,25ml. Solitamente viene preferito il congelamento in paillettes in quanto i pellets presentano numerosi svantaggi, quali la difficoltà nell’identificazione e la possibilità di contaminazione da parte di spermatozoi di altri pellets (Linde-Forsberg, 1995).
Molta importanza acquista il momento dell’inseminazione considerato il fatto
d
raccomanda di coprire la cagna al 3°-
per assicurare la presenza di oociti secondari nelle tube uterine. Normalmente le paillettes contenenti 0,5 ml di seme vengono scongelate a 37°C a bagnomaria per 15-60 secondi mentre le mini-paillettes possono essere scongelate a 75°C per 5 secondi (Andersen, 1980)
Nella c
seme congelato: uno prevede la deposizione del seme nel lume uterino dopo aver attraversato la cervice mentre l’altro richiede un intervento chirurgico con inseminazione attraverso la parete dell’utero per via laparotomica o laparoscopica. In ogni caso il sito
di deposizione appropriato per il seme congelato risulta essere il lume dell’utero, vista l’incidenza negativa che ha la tecnica di
so la parete
i
nea mediana, della lunghezza di 5 cm, a partire congelamento e di scongelamento sulla motilità degli spermatozoi (Linde-Forsberg e Forsberg, 1989) (Concannon e Battista, 1989). Per quanto riguarda la tecnica transcervicale sono riportati due modus operandi; il primo prevede l’utilizzo di un catetere di acciaio lungo 20-50 cm e con l’estremità del diametro di 0,5-1,0 mm. L’operatore deve spingere la cervice ver
addominale applicando una certa trazione in modo da distendere il canale cervicale, facilitando così la penetrazione e il passaggio del catetere tramite il quale verrà poi deposto il seme preventivamente scongelato (Linde-Forsberg, 1991) [Fig.18].
Per il secondo tipo di inseminazione transcervicale l’operatore s avvale dell’ausilio di un endoscopio per visualizzare la cervice e attraversarla con un catetere urinario (Wilson, 1993).
L’inseminazione “chirurgica” comporta che venga effettuata un’incisione sulla li
dall’ombelico fino al bordo della pelvi; da questa breccia viene identificato ed esteriorizzato l’utero. Il chirurgo, tenendo saldamente l’utero, ne penetra la parete, in direzione obliqua, con un ago sterile da 22G montato su una siringa da 2,5 ml o da 5 ml, preventivamente caricata con la dose inseminante. Inizialmente si
inietta una piccola quantità di seme per osservare il riempirsi del lume uterino e per escludere eventuali perdite; una volta assicuratisi che l’organo tende a mantenere il liquido all’interno viene inoculato il resto del seme (Smith, 1984). Generalmente questo tipo di intervento richiede un’anestesia della durata di circa 20 minuti. La breccia laparotomica può essere ridotta usando la laparoscopia (Silva et al, 1995).
Figura n°18: A: Rappresentazione
vagina e cervice di cagna durante intreuterina utilizzando catetere rigido, con seme congelato B: Per la cervice può essere tenuta f con pollice e indice attravers grafica della sezione sagittale di
inseminazione artificiale facilitare il passaggio del catetere,
erma o la parete addominale (Johnston SD, J Soc Theriogenol 11:1, 2001). Root Kustritz MV, Olson PNS: Canine and Feline Theriogenology,
LA GRAVIDANZA
Durata della gravidanza
Il tradizionale calcolo di 63 giorni dal primo accoppiamento non è un metodo preciso per prevedere la data del parto, dal momento che la variabilità della durata della gravidanza, in base a quest’unico dato, oscilla fra i 57 e i 72 giorni. In base a studi relativamente recenti è stato osservato che il parto si ha
di LH, 63 dopo l’ovulazione e c
d
Profilo endocrino
mediamente 65 giorni dopo il picco 57 dopo l’inizio del diestro secondo la variabilità minima. La durata della gravi
dell’ovulazione, è infatti di 63 ± 1 giorni (Holst e Phemister, 1974b).
itologia vaginale, con una anza, calcolata dal giorno
Progesterone
La presenza di corpi lutei a livello ovarico risulta essenziale per il normale decorso della gravidanza, considerato che nel cane la secrezione di progesterone dipende solo da queste strutture. Quest’ormone è di fondamentale importanza per il trofismo e la funzionalità delle ghiandole endometriali, per l’inibizione della contrattilità uterina, per l’abbassamento delle difese immunitarie a
livello locale e per il mantenimento dei normali rapporti utero- lacentari. ne la concentrazione ematica di za (Nett et al, 1975). strogeni p
Nel giorno dell’ovulazio
progesterone di circa 5 ng/ml incrementa progressivamente e dal 10°-15° giorno supera i 25 ng/ml. Raggiunto il tasso massimo, la progesteronemia rimane costante per 1-2 settimane, prima di iniziare una lenta e graduale discesa per il resto della gravidanza, che la porterà a 48-36 ore dal parto a livelli inferiori ai 2 ng/ml (Concannon et al, 1975).
La concentrazione di progesterone ematico di una cagna gravida è comunque molto simile a quella di una cagna non gravida in diestro e quindi non può essere utilizzata per la diagnosi di gravidan
E
-6 settimane di gestazione la concentrazione estrogeni permane a livello basale, similmente a Durante le prime 5
plasmatica di
quanto accade in diestro. Con il passare del tempo il tasso estrogenico tende ad aumentare e a mantenersi elevata fino al parto, in concomitanza del quale tende a ridursi (Chakraborty, 1987).
Il ruolo di questi ormoni è quello di favorire lo sviluppo della ghiandola mammaria e il rilasciamento della cervice, oltre ad
entrare a far parte del meccanismo endocrino che determina il parto.
Prolattina
Durante l’ultima settimana di gravidanza questo ormone secreto dall’ipofisi comincia lentamente ad aumentare in circolo raggiungendo il livello massimo durante le 16-56 ore prepartum. La concentrazione diminuisce, poi, nelle 36 ore che seguono il picco, per aumentare nuovamente in risposta alla stimolazione da parte dei neonati (Concannon et al, 1978).
Relaxina
Nelle cagne gravide quest’ormone raggiunge la massima concentrazione di 4-6 ng/ml, 2-3 settimane prima del parto, a volte diminuisce lievemente immediatamente prima e si ritrova
mo per le 4-9 settimane successive a livelli di 0,5-2,0
non gravide (Steinez et al, 1987). nell’organis
ng/ml.
Mentre gli ormoni citati finora non sono indicativi di gravidanza, il dosaggio della relaxina può essere considerato un vero e proprio test di gravidanza, in quanto la concentrazione risulta elevata esclusivamente in femmine positive, ed è bassa nelle cagne in diestro,
Evoluzione della gravidanza
La fertilizzazione ha luogo a livello salpingeo; gli zigoti arrivano in olta raggiunto lo stadio di 16 blastomeri, intorno all’8°-
igrazione transuterina rioni che si verifica prima dell’impianto, oltre che per il
fetale. Il circolo fetale e materno sono separati da soli
rafica dei villi coriali, la placenta canina viene definita come zonata; le digitazioni si dispongono a formare una banda tutta attorno ad ogni sacco. utero una v
12° giorno (Holst et al, 1971).
A 17-18 giorni dalla fertilizzazione, nell’endometrio si evidenziano focolai edematosi in corrispondenza delle sedi di impianto, che si realizzerà tra il 17° e il 21° giorno. Il numero dei corpi lutei presenti su di un’ovaia e il numero dei feti nel corno omolaterale possono non coincidere a causa della m
degli emb
possibile riassorbimento di alcune vescicole embrionali (Evans, 1974).
La cagna ha una placenta di tipo endotelio-coriale, il chè sta a significare che l’endotelio dei vasi uterini è in stretto contatto con il